关键词：胖素；大麻素受体；摄食；基础代谢；大鼠
前言
下丘脑是中枢神经系统整合内环境各类传输信号的中心，其作用类似机体内部的感觉器官，可以探测到激素和神经肽传递的内部信号。下丘脑外侧区（LHA）又称为饥饿中枢，其可通过分泌多种激素，如胖素（orexin），抑食肽（nesfatin-1），黑色素浓集激素（MCH）参与摄食和能量平衡调控。胖素系统是位于LHA及穹隆周的orexin-A（OX-A）和orexin-B（OX-B）神经元统称。OX-A和OX-B的作用主要由两个G蛋白偶联受体orexin-1受体（OX-1R）和orexin-2受体（OX-2R）介导。OX-A对两种受体具有相同的亲和力，而OX-B对OX-2R的亲和力较OX-1R则更高。因此，本研究主要探究胖素对小鼠基础代谢及摄食的影响。
除胖素系统外，中枢参与调节摄食的另一个重要系统是内源性大麻素系统，这也是针对肥胖治疗研究的另一个可能的治疗靶点。Godfrey等研究发现，内源性大麻素（EC）可通过作用于大麻素1受体（CB-1R）经稳态或非稳态机制参与刺激摄食活动。Sudo等发现，小鼠腹腔注射CB-1R拮抗剂AM251，腹侧被盖区（VMH）内胖素表达明显增加；此外，肥胖小鼠弓状核（Arc）微量注射胖素，Arc内大麻素表达也明显增加[7]。CB-R分为1型（CB-1R）和2型（CB-2R），不仅分布于中枢神经系统（CNS），也分布于外周神经系统中。CB-R的下游信号涉及多种神经功能的调控。胖素的促食效应受大麻素信号的调节，Kola等人研究报道称，CB-1R基因敲除小鼠侧脑室微量注射胖素，其对小鼠的促摄食效应无明显的抑制现象，而同族野生型小鼠侧脑室微量注射CB-1R拮抗剂，则可部分阻断胖素对小鼠摄食的促进效应[1]。但目前尚完全明了CB-1R信号通路参与胖素对小鼠能量代谢或摄食调控机制。故本研究拟采用LHA注射大麻素受体抑制剂利莫那班（Rim），探讨大麻素受体信号通路阻抑对LHA胖素调控摄食及能量代谢的影响。
1材料与方法
1.1 实验动物
成年雄性昆明小鼠（8-12周龄；体重25-40g），均在室温（20-22°C）、昼夜循环光照（07:00 至19:00）的环境下饲养。给予小鼠标准实验室饮食，自由进食饮水。所有动物实验均严格按《青岛大学实验动物保护和使用管理办法》执行。
1.2 实验分组
1. LHA微量注射胖素对小鼠基础/静息代谢或摄食的影响研究：随机选取小鼠，随机分为4组（n=7）在小鼠LHA注射0.5 μL以下药物：（1）DMSO对照组；（2）0.1μg 胖素组；（3）0.5μg 胖素组；（4）5.0μg 胖素组。分别观察LHA注射胖素对小鼠基础代谢率（BMR）和静息代谢率（RMR）或普通饲料摄入量和花生酱颗粒可口食物摄入量的影响；
2. 大麻素受体信号通路对LHA胖素促小鼠基础和静息代谢或摄食的影响研究：随机选取小鼠，随机分为4组（n=7）：（1）NSicv+DMSOLHA组：小鼠侧脑室注射0.5 μL NS，同时LHA注射0.5 μL DMSO；（2）NSicv+ 胖素LHA组：小鼠侧脑室注射0.5 μL NS，同时LHA注射0.5μg / 0.5 μL胖素；（3）Rimicv+DMSOLHA组：小鼠侧脑室注射2.0 μg / 0.5 μL Rim，同时LHA注射0.5 μL DMSO；（4）Rimicv+胖素LHA组：小鼠侧脑室注射2.0 μg / 0.5 μL Rim，同时LHA注射0.5μg / 0.5 μL 胖素。
1.3侧脑室及LHA置管
小鼠腹腔注射水合氯醛（0.3 mg/ml）使之麻醉，固定于小鼠脑立体定位仪。头部脱毛备皮，行正中纵行切口，充分暴露颅骨前后囟，根据Paxinos & Franklin小鼠脑图谱定位[2]定位侧脑室（前囟后0.3 mm；旁开：1.0 mm；颅骨下：2.5 mm）及LHA（前囟后：0.9 mm；旁开：1.1 mm；颅骨下：5.0 mm），将一不锈钢套管（长：20 mm，内径：0.4 mm）置入，内安置套管内芯（长20mm，直径0.35mm）并缝合头皮切口。小鼠分笼饲养，自由饮食饮水。手术后，所有小鼠均连续3天肌肉注射8万U青霉素（5mg/kg）预防感染，至少恢复7天后方可对置管小鼠进行后续实验。
1.4 能量代谢测定
使用开放式呼吸测热装置测定小鼠基础代谢率（basal metabolic rate，BMR）和静息代谢率（restingm etabolic rate，RMR）的变化。以电子天平测定小鼠体重，以开放式呼吸测热装置分析仪器测定小鼠耗氧量。设定呼吸小室温度为30 ± 0.5 ℃，空气流量为2000 ml／min。测定前小鼠禁食12 h，放入呼吸室内适应1 h，待小鼠活动稳定后开始记录。计算机控制设置为每间隔5 min采集呼吸小室内及外界新鲜空气的样本（耗氧量及CO2生成量），每15 min循环一次，连续测定60 min。选取2个连续稳定的耗氧代谢率最低值计算BMR。连续测定60 min测定周期内耗氧代谢率的平均值为RMR，所有测试都在9：00 ～ 18：00之间完成，BMR和RMR经标准温度及压力校正后表示为mlO2/g×h。
1.5普通食物或可口食物摄入量测定
本实验选择标准饲料加同等重量的花生酱的混合物作为小鼠的可口食物，小鼠标准饲料（每100 g含有脂肪5 g，其中植物油和猪油各2.5 g）作为普通食物。在测试前一周每日给小鼠1g花生酱，使小鼠熟悉花生酱的味道。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆在实验开始前1 h将小鼠放置于摄食测量笼内，使小鼠适应实验环境。实验当天下午3点清除鼠笼内剩余鼠粮，6h后通过小鼠脑部置管向侧脑室或LHA内注射药物。随后将预先准备好的小鼠标准饲料或花生酱颗粒放入相应鼠笼，通过测量用药前后0-2小时食物容器重量变化，计算0-2小时小鼠摄食量变化情况，在此实验期间小鼠自由饮水。数据搜集采用专有软件进行分析统计。
1.6组织学检查
为了检测核团或侧脑室定位是否准确，实验结束后麻醉小鼠，经套管向小鼠脑核团LHA或侧脑室缓慢注射滂胺天蓝溶液，经心脏以生理盐水（200mL）灌注，后用4％甲醛溶液（200mL）继续灌注。小鼠断头取脑，于4％甲醛溶液中后固定。制备100 μm冰冻切片，在光学显微镜下检查注射部位，以验证脑内置管位置是否准确。
1.7统计学分析
采用SPSS15.0统计软件进行分析，数据表示为平均值±标准差。采用单因素方差分析或t检验方法，并采用Bonferroni事后检验方法检测多组数据间两两关系，两组以上实验数据采用Kruskal-Wallis检验。以P < 0.05为具有统计学意义。
2实验结果
1 LHA微量注射orexin-A对小鼠基础和静息代谢的影响及大麻素受体信号通路调控
与DMSO组比较，LHA微量注射胖素，小鼠基础代谢率（P < 0.05~0.01）和静息代谢率（P < 0.05~0.01）均显著升高，且呈剂量依赖性增加；与NSicv+DMSOLHA组相比，LHA 注射1.0 μg 胖素（NSicv+ 胖素LHA），小鼠基础代谢率（P < 0.05）和静息代谢率（P < 0.05）显著升高。与NSicv+ 胖素LHA组相比，若侧脑室预先注射Rim，LHA再注射胖素（Rimicv+ 胖素LHA），胖素增加基础代谢率（P < 0.05）或静息代谢率（P < 0.05）的效应显著减弱。
2 LHA微量注射胖素对小鼠0-2h选择性摄食的影响及大麻素受体信号通路调控
与DMSO组比较，LHA微量注射胖素，小鼠对普通饲料（P < 0.05~0.01）和花生酱颗粒饲料（P < 0.05）0-2h摄入量均显著增加，尤其是对普通饲料摄入量呈剂量依赖性增加（P < 0.05~0.01）。与NSicv+DMSOLHA组相比，LHA 注射1.0 μg 胖素（NSicv+ 胖素LHA），小鼠对普通饲料（P < 0.05）和花生酱颗粒饲料（P < 0.05）0-2h摄入量均显著增加（P < 0.05）。与NSicv+胖素LHA组相比，若侧脑室预先注射Rim，LHA再注射胖素（Rimicv+ 胖素LHA），胖素促小鼠普通饲料（P < 0.05）或促花生酱颗粒饲料（P < 0.05）0-2h摄入效应明显减弱。
3讨论
本研究通过观察LHA注射胖素对小鼠基础能量代谢以及摄食的影响，并通过中枢注射大麻素受体拮抗剂，探讨大麻素受体信号通路在胖素调控摄食和能量代谢中所扮演的角色。
胖素可强有力地调控摄食行为和基础能量代谢[3]；侧脑室注射胖素可明显提高大鼠基础代谢水平 [4]；本研究发现，LHA注射胖素，小鼠基础代谢率和静息代谢率均显著升高，且呈剂量依赖性增加，进一步证实了胖素有促能量代谢作用。有研究报道，大麻素可影响能量代谢，增加小鼠耗氧量。前期研究显示，胖素和大麻素受体信号在促进肽类释放以及AMP激活蛋白激酶活化等方面存在相互作用。本研究也探究了大麻素受体信号通路对LHA注射胖素诱导的能量代谢促进作用的影响。结果显示LHA注射胖素，小鼠基础代谢率和静息代谢率均显著升高。若侧脑室预先注射Rim，LHA再注射胖素，胖素增加基础代谢率或静息代谢率的效应显著减弱。提示，胖素对小鼠能量代谢的促进作用可能与大麻素信号系统活动有关。
选择性摄食研究发现，腹侧被盖区大麻素1受体信号通路可调节摄食奖赏机制，且LHA大麻素1受体信号通路阻断可减少大鼠酒精摄入的偏好，而且LHA注射大麻素1受体抑制剂Rim可阻碍条件性位置偏好摄食。本研究发现，LHA注射胖素，小鼠对普通饲料和花生酱颗粒饲料0-2h摄入量均显著增加，尤其是对普通饲料摄入量呈剂量依赖性增加。另外本研究还发现，LHA注射胖素，小鼠对普通饲料和花生酱颗粒饲料0-2h摄入量均显著增加，若侧脑室预先注射Rim，LHA再注射胖素，胖素的促小鼠普通饲料或促花生酱颗粒饲料摄入效应明显减弱。提示，胖素可促进小鼠摄食，且大麻素受体信号通路阻抑参与胖素促小鼠摄食过程的调控。大麻素1受体信号通路之所以能够参与调节胖素的促摄食效应，有可能是因为LHA内两种受体的异二聚化。有研究表明，OX-1R和CB-1R在整个大脑中都存在共定位，并参与各种生理功能的调控。
总而言之，LHA胖素可剂量依赖性地促进小鼠基础能量代谢，增加小鼠摄食，阻抑大麻素受体信号系统可参与该过程的调控。
参考文献
[1]N.D. Volkow, A.J. Hampson, R. Baler, et al. Don't worry, be happy: endocannabinoids and cannabis at the intersection of stress and reward [J]. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, 2016, 57(8): 285–308.
[2]K.B.J. Franklin, G. Paxinos. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press, San Diego, 1997.
[3]Inutsuka A, Inui A, Tabuchi S, et al. Concurrent and robust regulation of feeding behaviors and metabolism by orexin neurons [J]. Neuropharmacology, 2014, 85(5): 451-460.
[4]Alexandre C, Andermann ML, Scammell TE. Control of arousal by the orexin neurons [J]. Curr Opin Neurobiol, 2013, 23(5): 752-759.
[5]
论文作者:刘金政1,2，刘金菊3
论文发表刊物:《医师在线》2019年第19期
论文发表时间:2019/12/4
标签：小鼠论文; 受体论文; 大麻论文; 脑室论文; 和静论文; 饲料论文; 花生酱论文; 《医师在线》2019年第19期论文;