李鹰飞[1]2004年在《四物汤化学成分配伍的补血作用及其机理研究》文中认为中药作用机理研究是中药现代化的重点。但中药复杂的化学成分和多靶点、多途径的作用特点给作用机理的研究带来很大困难。本研究通过对细胞学和动物学实验指标的考察，结合基因芯片技术研究四物汤化学成分配伍对细胞因子基因表达谱的影响，阐明了四物汤化学成分与造血相关细胞因子基因表达变化的关系，并为中药作用机理研究、有效成分群的确认提供可行的技术路线和技术平台。主要结果摘要如下：1． 四物汤化学成分配伍1、 配伍2对人骨髓基质细胞系HFCL细胞均有促增殖作用，应用新制备的人造血相关细胞因子寡核苷酸表达谱芯片研究其机理，发现配伍1作用于HFCL细胞12h后IL-2R、NF-κb、TPO的基因表达上调，这叁者的作用可能与四物汤促进骨髓造血干祖细胞的增殖，抑制骨髓造血干祖细胞的凋亡作用相关。配伍2作用于HFCL细胞12h后NF-κb、G-CSF-R、IL-13、 VEGF、IL-5、 GM-CSFR-α的基因表达上调。结合四物汤的作用机理发现，发现四物汤作用机制不但与其所含的化学成分而且和化学成分比例也存在一定的相关性。还发现葡萄糖和蔗糖、芍药苷和川芎嗪对促HFCL细胞的增殖分别有交互作用2． 四物汤化学成分配伍1、 配伍2可显着升高血虚小鼠外周血中的白细胞，促进粒系(CFU GM)、红系(BFUE，CFUE)、混合系(CFU mix)造血祖细胞集落的增殖。实验结果表明配伍1是四物汤作用的物质基础，但可能由于四物汤仍含有其它有效成分，所以配伍1对CFU E、CFU mix的促增殖作用显着弱于四物汤。小鼠骨髓表达谱芯片结果与细胞实验结果一致，即四物汤作用机制不但与其所含的化学成分而且和化学成分比例也存在一定的相关性。综上所述，四物汤作用机制与其所含的化学成分、化学成分的比例存在一定的相关性。基因芯片技术可用于研究中药作用机理及有效成分群的确认。
王玉华[2]2004年在《中药方剂四物汤补血作用有效部位的研究》文中指出目的在四物汤已有的研究结果基础上，确定四物汤全方的补血有效部位。对“有效部位”建立完整的质量控制体系，并进行补血作用机理研究。方法立足于四物汤全方，将全方的成分分离为叁个大的有关部位。研究过程将中药化学、中药质量控制以及药理学学科紧密结合。通过血清药理学、血清药化学和药代动力学实验，对四物汤补血作用机理进行研究。成果完成了CO2超临界萃取部位、醇提部位以及多糖部位的分离、分析；建立了与四物汤治疗血虚证的血象特点相对应的血虚模型；确定了四物汤补血有效部位；对有效部位建立了完整的质量控制体系，并进行了指纹图谱研究；对有效部位开展了血清药化学、血清药理学和药代动力学研究。结论本文确定了四物汤的补血有效部位，其化学成分主要包括多糖、苷类、有机酸类和生物碱类。有效部位的质量标准为确保用药的有效性提供了依据。血清药化学实验确定了阿魏酸是有效成分之一。血清药理学研究结果表明，四物汤及其有效部位均可以显着促进骨髓细胞的分化和增殖。药代动力学参数为临床用药提供了依据。
沈军[3]2008年在《四物汤治疗月经不调研究进展》文中研究指明月经不调是指妇女月经的周期、经量、经色、经质等改变。临床上常见月经先期、月经后期、经行先后无定期、月经量多或量少,即月经不调的现象。月经不调是女性的常见病、多发病,育龄期女性大多有过月经不调史。其主要见于西医的排卵性功能失调性子宫出血。国内各地在1980年前后进行的女性月经生理常数表明,月经不调的发病率大体在10%左右。月经周期异常,以月经后期多于月经先期,青春期、绝经期发病率高于生育期。月经过多发病率在10%左右,因标准不一,各家报道差异较大,以宫内置放节育器者发病率更高一些。月经过少者1%-2%,月经先期1.6%-4.1%,月经后期7%-13.8%,经期延长不足3.3%-4.3%。月经不调因其高发病率,已成为妇科常见病,给妇女身心健康带来巨大伤害,引起国内外学者的普遍关注。四物汤从宋代起就广泛应用于妇产科临床,以治疗经带胎产杂病诸疾。经元、明代的医家进一步引申发展,至今更加广泛运用于临床,甚至被称为妇科之圣方,是治疗妇科疾病的基础方。基本所有的月经不调都可以通过四物汤加减变化来实现治疗的目的。本研究采用文献综述分析的方法,进行了四物汤治疗月经不调的分类和归纳,回顾了四物汤的源流、临床的置方原理,四物汤古代的应用以及在妇科月经不调方面的发挥,从古及今,进一步从临床上阐述了现代医家在月经不调方面对四物汤的应用和发展,对四物汤原理的重新认识和理解,同时在四物汤的功能主治上、四物汤的配伍上进一步阐述,对四物汤治疗月经不调进行系统归纳总结;就四物汤治疗月经不调相关性认识及研究进展上,探讨现代科学研究四物汤治疗月经不调的可行性做出全面综述,并对进一步揭示四物汤调经的原理以及四物汤治疗月经病的研究做出展望。
朱力军[4]2003年在《四物汤及其拆方补血作用机理和物质基础的研究》文中研究指明血虚证是中医临床的常见证候，主要是由于脾胃生化不足以及急慢性失血所致。四物汤临床上主要用于补血、活血、调经，是治疗血虚证的首选药之一。本研究在国家自然科学基金课题《中医血虚证模型的分子基础研究》和《四物汤组成原理的基础研究》的基础上，对四物汤及其拆方补血的作用机理及物质基础进行了系统研究。 在体实验检测了血虚证小鼠骨髓、脾脏的细胞凋亡，外周血像，骨髓细胞周期，CD34~+抗原表达等指标；离体实验则利用四物汤及其拆方诱生的NIH3T3细胞上清检测了其对NFS60细胞增殖的影响。结果显示：四物汤全方的效果优于各配伍组方，揭示了其在拆方中的主导地位；而本研究所侧重的两味药拆方在不同指标上表现各异。如白芍相关组方诱生的NIH3T3细胞上清对NFS60细胞的增殖效果明显，以当归白芍作用最佳，说明白芍可以促进G-CSF或类似因子的产生；地黄当归、地黄川芎组方促进BFU-E、CFU-Mix的效果与全方差异不显着，且对CFU-E有明显作用，表明地黄主要促进红系和混合系造血祖细胞的增殖；当归相关组方对骨髓各系造血祖细胞均有作用，并且具有明显的升高外周血白细胞的作用；白芍川芎组对BFU-E基本无作用;而川芍相关组方则在抗凋亡和调节细胞周期方面发挥主要作用。 在物质基础分析方面，通过比较并选择活性最强的成分进行连续追踪，并同步进行物质分离和活性分离，发现四物汤补血作用的活性物质可能含有芍药试、部分多糖、寡聚糖、以及一些与单双糖极性相近的成分。 对四物汤及其全部拆方实验结果进行聚类分析证实，白芍在诱导N工H3T3细胞上清对NFS6O细胞的增殖中对全方的贡献最大，并在促进BFU一E增殖方面属反佐之品;当归对升高血虚证小鼠外周血白细胞发挥主要作用，并对骨髓各系造血祖细胞均有促进效果;地黄则侧重于促进CFU一Mix和CFU一E的增殖。 利用现代生物科学技术的新进展，本课题从整体、器官、细胞、分子等多个层面对该复方展开深入探讨，旨在阐明四物汤补血作用的配伍机制和物质基础，从而为复方现代化奠定基础。
谭有能[5]2006年在《四物汤的纯化工艺及其补血作用的研究》文中认为研究背景 四物汤源于《仙授理伤续断秘方》，由熟地黄、当归、川芎、白芍四味药组成，是补血与活血兼顾的经典方剂。原方为汤剂，现在也有颗粒剂，中国药典收载为合剂，现有剂型都存在传统的中药复方制剂所谓的“粗、大、黑”等问题，造成了服用剂量大，稳定性较差，疗效不稳定，携带不便等缺点。 目的 在保留四物汤中有效成分的同时，除去杂质，研制出服用剂量小，疗效稳定的新剂型。 方法 对四物汤的提取纯化工艺进行了研究，以芍药苷、阿魏酸和收膏率叁个为指标，分别考察了醇沉、ZTC澄清剂、D101大孔吸附树脂叁种工艺，并以外周血象中的红细胞、血红蛋白、红细胞压积、白细胞、血小板为指标，利用乙酰苯肼和环磷酰胺联合造成小鼠血虚模型来评价不同工艺和同种工艺不同剂量的补血作用。 结果 醇沉、ZTC澄清剂虽然对有效成分芍药苷和阿魏酸具有很好的保留率，但是两者都不能显着的降低四物汤的收膏率，而D101大孔吸附树脂既能对芍药苷和阿魏酸具有很高的保留率，又能显着的降低四物汤的收膏率。补血药理实验发现四物汤原液、醇沉上清液能显着的提高血虚小鼠的外周血象中的红细胞、血红蛋白、红细胞压积，具有补血作用；而D101大孔吸附树脂的40％醇冲液部位不能显着地提高血虚小鼠的外周血象的红细胞、血红蛋白、红细胞压积，提示补血作用不显着，四物汤中的各种工艺纯化后的药液都能提高血虚小鼠的白细胞，对血小板没有影响。 结论 四物汤原液、乙醇沉淀工艺对血虚症小鼠有补血疗效，而大孔树脂工艺对血虚症小鼠补血作用不明显，补血作用强弱依次为原液＞55％醇沉组＞D101组。 创新及意义：对四物汤进行了纯化工艺的考察，并建立了用乙酰苯肼和环磷酰胺联合造成稳定的小鼠血虚模型，利用血虚模型来评价各种工艺的补血作用，发现55％醇沉上清液、原液、具有补血作用，而D101大孔吸附树脂40％醇冲液补血作用不显着，为研制服用剂量小，疗效稳定的剂型提供参考。
刘培[6]2011年在《四物汤类方用于妇科血瘀证原发性痛经的物质基础与配伍规律研究》文中研究表明本论文研究工作为“江苏省高校自然基金重大基础研究资助项目—四物汤类方治疗妇科血瘀证原发性痛经的物质基础与配伍规律研究”的部分研究内容。论文分六个章节讨论。一、文献研究。该部分对相关文献进行整理,较系统地综述了四物汤类方治疗妇科血瘀证原发性痛经的传统与现代认识,并对香附四物汤配伍效应及其物质基础研究进展进行综述。二、在综合分析文献的基础上,理出研究思路,设计可行的实验方案和技术路线。叁、通过知识挖掘描述香附四物汤的组方结构与特点。基于文献数据挖掘,对香附四物汤组方原则及配伍规律进行探讨分析；从中医方剂数据库中检索出包含香附-延胡索等五个药对治疗痛经的方剂,建立数据库,对其出现频率进行统计分析。结果,香附四物汤方中的当归、香附和延胡索相似度较高,是本方主要组成单元；在154首治疗痛经的方剂中,香附-当归药对使用频次较高,香附-延胡索药对最常与四物汤配合运用。四、香附四物汤的的效应评价与物质基础研究。研究内容包括以下几个方面：(一)气滞血瘀证原发性痛经效应评价体系的建立与应用。1.以香附四物汤临床传统用药形式—汤剂为研究对象,采用水煎煮的方法进行提取,并对其挥发性成分进行收集；在强调汤剂作为方剂整体作用物质的基础上,又采用现代分离技术大孔吸附树脂法对其不同化合物类型进行纯化富集,制备得15个样品供生物效应评价及成分分析,以期探讨生物效应、效应物质及其两者之间的关系。2.选择离体器官模型(离体子宫收缩模型)、整体动物模型(原发性痛经模型)对香附四物汤及各分离部位进行生物效应评价,香附四物汤、醇沉上清液部位和60%乙醇洗脱部位均呈现出对子宫收缩的明显抑制活性。采用HPLC法对60%乙醇洗脱效应部位中主要化学成分进行定量分析,结果分析测定了效应部位中6个主要化学成分(即四氢非洲防己碱、普鲁托品、紫堇碱、延胡索乙素、四氢黄连碱、小檗碱)的含量。通过离体子宫收缩模型的效应验证,表明化合物组能够较好的代表效应部位的效应,提示香附四物汤治疗气滞血瘀证原发性痛经的效应部位中抑制小鼠离体子宫收缩的主要效应成分主要为生物碱类化合物,小檗碱对缩宫素诱导的离体子宫收缩抑制效应最强。3.选择小鼠脾淋巴细胞增殖与转化实验对香附四物汤及各分离部位进行免疫相关的生物效应评价,香附四物汤、醇沉上清液部位和30%乙醇洗脱部位具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖与转化作用。采用HPLC法对30%乙醇洗脱效应部位中主要化学成分进行定量分析,结果分析测定了效应部位中4个主要化学成分(即芍药内酯苷,芍药苷,阿魏酸和洋川芎内酯Ⅰ)的含量。将化合物组与活性部位进行效应验证,表明化合物组能够较好的代表效应部位的效应,提示芍药内酯苷,芍药苷,阿魏酸和洋川芎内酯Ⅰ是该活性部位的主要活性成分,香附四物汤与四物汤在免疫增强活性中有共同的物质基础。4.选择急性血瘀大鼠模型从血液流变学、内分泌激素等多方面对香附四物汤及分离部位进行生物效应评价,主要研究结果有香附四物汤及其醇溶部位能有效改善急性血瘀SD大鼠全血黏度、血浆黏度、血沉等病理变化,延长TT、APTT,降低纤维蛋白原含量,对卵巢功能也具有一定改善作用,而醇沉部位对血液流变性各项指标影响较弱。5.通过脑微透析色谱联用技术研究香附四物汤对痛经模型大鼠脑神经递质的影响,结果表明香附四物汤在下丘脑阻断5-HT转变为5-HIAA。(二)香附四物汤与基本方用于妇科血瘀证原发性痛经的配伍特点分析。选择整体动物模型(气滞血瘀大鼠模型,血虚小鼠模型,热板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型,原发性痛经小鼠模型)等从血液流变学、内分泌激素、动物行为学等多方面对香附四物汤和基本方进行生物效应评价和比较分析。主要研究结果为：1.气滞血瘀SD大鼠模型研究结果表明,香附四物汤能够明显改善气滞血瘀模型大鼠血液流变学指标,而基本方干预的气滞血瘀模型大鼠血液流变学指标改善不明显。2.血虚小鼠模型研究结果表明：香附四物汤干预的血虚小鼠模型改善外周血象作用不明显,基本方更有利于调节机体免疫功能,促进造血功能的恢复。3.热板致痛小鼠模型,醋酸致痛小鼠模型和原发性痛经小鼠模型研究结果表明：香附四物汤在这叁个模型上表现的生物效应优于基本方,香附四物汤在抑制痛经作用中以镇痛为主。(叁)香附四物汤方药物质基础研究。1.香附四物汤组成药味之一—香附的水溶性成分分离与鉴定,通过色谱分离技术,从香附60%乙醇提取物中分离得到一个新的脑苷,对其波谱数据进行分析,该化合物被鉴定为1-O-(β-D)-glucopyranosyloxy)-(2S,3R,4E,8Z)-2-[(2'R)-2'-hydroxylignoceranoylamino]-4, 8-tetradecene-3-diol,并具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。2.采用UHPLC-DAD-ESI-MS法、通过标准化合物对照及质谱特征分析对香附四物汤中的主要色谱峰进行了归属和指认,分析鉴定了其中包括芳香酸、苯酞类、含氮化合物、萜类、糖等化合物类型的34个化合物,为阐明香附四物汤的效应物质提供了依据。3.采用HPLC法对香附四物汤醇沉上清部位小分子活性成分进行定量分析,结果分析测定了没食子酸、绿原酸、芍药内酯苷、咖啡酸、芍药苷、四氢非洲防己碱、普鲁托品、阿魏酸、延胡索乙素、小檗碱等10个化学成分的含量,为进一步阐明活性部位中各成分与药效相关性研究提供参考。4.通过苯酚／咔唑-硫酸法测定了香附四物汤醇沉沉淀部位的多糖含量,为明晰部位与药效相关性研究提供参考。五、香附四物汤用于模型动物与人体的效应机理与代谢特征研究。(一)香附四物汤对模型动物与人体的神经-内分泌-免疫网络指标的影响。1.通过临床试验,得出结论：香附四物汤对气滞血瘀证原发性痛经患者有治疗作用,血瘀证原发性痛经的发生与神经-内分泌-免疫网络的各因子变化密切相关,香附四物汤对网络内的(β-EP.E2、T、外周血象等指标具有调控作用。2.对模型动物的实验研究,得出以下结果：香附四物汤(1)在下丘脑阻断5-HT转变为5-HIAA;(2)促进卵巢颗粒细胞的增殖；(3)直接抑制OT诱导的在体/离体子宫强烈收缩,显着升高痛经小鼠子宫组织中NO水平,且降低子宫组织中钙离子水平,提高SOD酶活力；(4)改善血瘀大鼠血液流变学病理变化,抗凝血酶活性；(5)在内分泌系统,纠正病理状态下机体的E2,P异常水平,抑制COX-2酶活性；(6)在免疫系统,促进脾淋巴细胞增殖,抑制LPS诱导的巨噬细胞NO释放。临床试验与模式动物实验的结果相互补充,证实了课题假说：四物汤活血类方具有特定的配伍关系及内在规律,其治疗妇科血瘀证痛经是通过共有/各异性效应物质对神经—内分泌—免疫网络的调控和/或直接作用于靶器官而实现其整体调节作用,达到标本兼治的目的。(二)香附四物汤用于原发性痛经模型动物的UHPLC-MS代谢组学初步研究。在缩宫素诱导的原发性痛经大鼠模型中,前列腺素和类花生酸类物质含量升高,溶血磷脂降低,香附四物汤对原发性痛经的抑制作用与LPC代谢通路有关。(叁)香附四物汤在模式动物与人体内的代谢过程与特征研究。1.使用UHPLC-Q-TOF-MS联用技术,通过MetaboLynxTM软件处理快速分析了香附四物汤醇沉上清部位在大鼠血浆、尿液、胆汁中的代谢物,从香附四物汤给药后大鼠的尿液、胆汁和血浆中找到45个代谢物,包括羟化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、半胱氨酸化、去甲基化、失氧等多种类型；快速分析了香附四物汤60%乙醇洗脱部位中部分生物碱在大鼠组织中的代谢组分。从大鼠组织中共鉴定分析了包括原型化合物在内的16个成分,从结果可以看出,该部位中的生物碱原型及其代谢物广泛分布于各组织器官,甲基化、去甲基化、磺化、单葡糖醛酸化、磺化与葡糖醛酸化结合是该部位中生物碱的主要代谢类型；2.使用UHPLC-Q-TOF-MS联用技术,通过MetaboLynxTM软件处理快速分析了香附四物汤在人尿液和血浆中的代谢组分,从服用香附四物汤配方颗粒的气滞血瘀证原发性痛经患者的尿液、和血浆中找到60个代谢物,包括羟化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、半胱氨酸化、去甲基化、失氧等多种类型,人和大鼠在代谢过程中有一定的相似,使用大鼠的代谢转化实验对临床人体代谢实验有一定的指导意义。六、类方配伍及其规律的关联研究。(一)组方配伍规律研究。1.采用计算机聚类分析方法,结合实验研究结果对香附四物汤效应物质基础和配伍效应的相关性进行关联分析。2.采用正/反向效应评价相结合的研究思路与方法探讨香附四物汤中主要药对的作用特点及对整方的贡献。通过整体动物模型(小鼠热板法、醋酸致小鼠扭体反应、小鼠原发性痛经模型和小鼠血虚模型),评价各给药组对不同模型小鼠的影响。结果香附-延胡索药对表现出很强的镇痛效果,当其在香附四物汤组方中被剔除后作用明显减弱或消失,而香附-当归药对的镇痛效果相对较弱,当其在香附四物汤组方中被剔除后作用没有明显减弱,有的甚至有所提高。香附-当归药对具有很强的补血效应,而香附四物汤以及当其在香附四物汤组方中被剔除后,其均未表现出明显的补血作用。在香附四物汤中,香附-当归的补血作用减弱,而香附-延胡索的镇痛作用依然显着。采用HPLC-PAD法分析药对配伍对香附四物汤中芳香酸类和含氮化合物溶出的影响,通过比较各组响应峰面积,可以看出,香附四物汤中的生物碱类化合物主要由香附-延胡索药对提供,该药对与方中其他药味配伍之后,部分生物碱含量有所增加,叔胺型生物碱在配伍前后量的变化不显着。香附-延胡索药对配伍抑制了有机酸类成分的溶出而香附-当归药对配伍则促进其溶出。(二)四物汤类方治疗不同证型原发性痛经的作用特点分析。四物汤类方(少腹逐瘀汤和香附四物汤)针对不同证型原发性痛经(寒凝血瘀证和气滞血瘀证)的治疗中,对神经-内分泌-免疫网络内的效应指标的作用具有共有规律,其对各自证型的效应指标的影响具有各异性。
马增春, 高月, 谭洪玲, 梁乾德, 王升启[7]2005年在《用分子中药组学技术研究四物汤补血的作用机理》文中研究表明从中药复方的多重作用及中医的整体治疗观出发,作者提出“分子中药组学”的概念,认为中药复方是通过化学成分组合影响到信号分子组合,使紊乱的信号分子网络恢复平衡,从而达到治疗中医的证和相关疾病的作用和效果。分子中药组学的关键技术是化学组学、基因组学和蛋白质组学。用分子中药组学策略发现了四物汤补血的物质基础是多糖、川芎嗪、阿魏酸和芍药苷, 补血作用的分子机理是影响造血相关细胞因子的表达。
黄开福[8]2014年在《四物汤有效成分代表性组分药代动力学相互作用研究》文中认为中药复方四物汤是中医补血活血的经典良方，由于其具有补血养肝和活血调经的显着功效，临床上常用于血虚、血滞之证和妇科疾病的治疗。四物汤由熟地黄、当归、白芍和川芎四味药材组成，分别为四物汤的“君臣佐使”药。研究表明四物汤中果糖（熟地黄）、阿魏酸（当归和川芎）、芍药苷（白芍）和川芎嗪（川芎）4个成分在受60Co辐射致贫血的小鼠体内具有生血的作用；同时，当4个成分同时配伍给药后，芍药苷和阿魏酸两个单体引起的体重减轻作用消失，而这种作用可能是一种不良的反应。本课题的研究目的是通过四物汤有效成分代表性组分在大鼠体内的药代动力学相互研究，探讨其与中医“君臣佐使”理论的相关性，为四物汤有效成分组方制剂的研究与开发提供具有重要指导意义的数据信息。根据文献数据挖掘和前期的研究，从熟地黄、当归、白芍和川芎中分别选出1～3个有效成分，通过测定有效成分在药材中的含量以及考察四物汤和四物合剂在体内活性成分吸收入血的情况，从而确定了熟地黄、当归、白芍和川芎的有效成分中各自具有代表性的组分。最终，通过代表性组分的组合配伍，研究代表性组分在大鼠体内的药代动力学相互作用。第一部分HPLC法测定四物汤配伍药材提取液中9个有效成分的含量经前期的研究和文献数据的挖掘，从四味药材中分别选择以下9个有效成分作为研究对象，即：5-羟甲基糠醛、梓醇和毛蕊花糖苷(熟地黄)；丁苯酞、藁本内酯和阿魏酸（当归）；芍药苷和芍药内酯苷（白芍）；丁苯酞、藁本内酯和阿魏酸川芎嗪（川芎）。建立9个有效成分的高效液相色谱分离方法，分别对四味药材的提取液中对应各有效成分的含量进行分析。熟地黄和川芎嗪采用50%甲醇水进行超声提取，当归和白芍分别采用70%甲醇水和50%乙醇水进行超声提取。以乙腈：水（0.5%H3PO4）为流动相，色谱柱Agilent HC-C18（4.6×250mm；5μm）进行分离，对提取液进行HPLC分析。结果表明，5-羟甲基糠醛和毛蕊花糖苷在熟地黄中的含量约为0.14%和0.07%；丁苯酞、藁本内酯和阿魏酸在当归中的含量约分别为0.01%、2.05%和0.04%，芍药苷和芍药内酯苷在白芍中的含量约分别为2.27%和0.41%；5-羟甲基糠醛、川芎嗪和阿魏酸在川芎中的含量约分别为0.02%、0.02%和0.06%。综上所述，9个有效成分在药材中的含量差异较大，其中藁本内酯、芍药苷和芍药内酯苷的含量较高，可作为重点关注的有效成分。第二部分四物汤和四物合剂在大鼠体内的入血有效成分及其药动学性质建立该9个有效成分的液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）的分离检测方法，研究口服给药后，四物汤和四物合剂在大鼠体内吸收入血的有效成分及其药代动力学性质。分别将四物汤和四物合剂临床用水煎液进行冻干，并用LC-MS/MS测定了各有效成分的含量。Wistar大鼠随机成四物汤组和四物合剂组，于给药前、给药后不同时间点采集血样。大鼠血浆样品用乙腈进行蛋白沉淀处理，用LC-MS/MS检测血浆样品中的各有效成分含量。血药浓度-时间数据由WinNonlin5.2统计软件进行药代参数的计算，统计学分析由SAS9.2软件进行处理。经LC-MS/MS方法测定，在两个方剂冻干后的水复溶液中都检测到了梓醇、藁本内酯、丁苯酞、芍药苷和芍药内酯苷，其在四物汤和四物合剂中的浓度分别为2.94、244.67、4.24、1411.65、261.83mg L-1和3.64、255.50、4.68、1456.65、297.00mg L-1。毛蕊花糖苷、阿魏酸和川芎嗪两个方剂中的含量都低于其检测限。灌胃给药四物汤和四物合剂后，在大鼠血浆中可以检测到少量梓醇，但无法准确定量；含量偏高且能够准确定量的成分是芍药苷和芍药内酯苷。四物汤组与四物合剂组中芍药苷和芍药内酯苷在大鼠体内吸收和消除均较快。二者的主要药动学参数（T1/2，Tmax，Cmax和AUC等）在四物汤组和四物合剂组之间的无显着差异。综上所述，梓醇、芍药苷和芍药内酯苷均可作为四物汤有效成分代表性组分；药材配伍比例的变化对芍药苷和芍药内酯苷的药动学性质无显着影响。第叁部分测定生物样品中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪含量的LC-MS/MS方法建立和确证依上述结果，梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪可作为四物汤有效成分的代表性组分。本部分的目的是建立测定大鼠血浆中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法，为研究临床血虚患者口服中药复方四物汤和四物合剂后梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪在人血清的含量，以及研究梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪等5个有效成分组合配伍给药前后在大鼠体内的药代动力学相互作用提供检测分析手段。梓醇以甲醇和水（含5mM甲酸铵）作为流动相，色谱柱为Diamonsil C18(2.1×150mm；5μm)进行分离，采用MRM（多反应监测）和正离子模式的检测方式，内标为桃叶珊瑚苷。藁本内酯和川芎嗪以甲醇:0.1%甲酸（78:28）作为流动相恒梯度洗脱，色谱柱为Thermo Syncronis C18(2.1×150mm；3.7μm)进行分离，采用MRM（多反应监测）和正离子模式的检测方式，内标为地西泮。芍药苷和阿魏酸以乙腈和水（0.1%甲酸）作为流动相，色谱柱为Thermo Syncronis C18(2.1×150mm；3.7μm)进行分离，采用MRM（多反应监测）和负离子模式的检测方式，内标为葛根素。血浆样品前处理采用乙腈沉淀蛋白，对测定大鼠血浆中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法进行全确证，内容包括方法的专属性、方法的精密度和准确度、稀释效应、基质效应、回收率和稳定性。结果表明，大鼠血浆中的内源性物质不干扰梓醇等有效成分的测定；批内和批间精密度和准确度均在±15%以内，精密度和准确度良好，符合生物样品分析的要求；梓醇和藁本内酯的标准血浆样品稀释5倍（5000→1000；500→100）后，精密度和准确度均在±15%以内，表明无明显稀释效应；梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的基质效应均在85.73%～107.19%的范围内，回收率则在90.93%～108.63%的范围内，表明方法无明显的基质效应，回收率符合生物样品分析的要求；大鼠血浆中的梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪分别进行室温放置4h、样品处理后4℃进样器放置24h、反复冻（-20℃）融（室温）3次和长期冻存后，所测得的RSD%和RE%值均在±15%以内，表明梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪在上述条件下稳定性良好。综上所述，实验建立了可同时检测大鼠血浆中藁本内酯和川芎嗪、可同时检测大鼠血浆中芍药苷和阿魏酸以及大鼠血浆中梓醇的3个LC-MS/MS方法，该3个方法专属性强、灵敏度高和重复性好，适用于梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的体内研究。第四部分临床受试者口服四物汤和四物合剂后血清中代表性有效成分的分析利用所建立的测定生物样品中梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪的LC-MS/MS方法，测定该5个有效成分在临床受试者口服四物汤和四物合剂后所采集的血清中的含量，为四物汤有效成分代表性组分的选择提供重要依据。35位临床血虚患者随机分为四物汤组（n=17）和四物合剂组（n=18），按照临床用药剂量早晚各服用一包四物汤或者四物合剂，连续服用22天。于服药前及连续服药的第22天清晨服药后1h和2h采集血清样品。血清样品前处理采用1.5倍体积的乙腈沉淀蛋白，随后用LC-MS/MS进行分析。结果表明，临床血虚证患者服用中药复方四物汤或四物合剂后，在其血清中均检测到了芍药苷和藁本内酯，两者含量分别在2.12～18.44和2.18～7.20ng·mL-1的范围内，而梓醇、阿魏酸和川芎嗪则低于检测限。因此，芍药苷和藁本内酯可作为四物汤有效成分代表性的组分。同时，藁本内酯和芍药苷在四物汤组中可检测到的病例数要明显多于四物合剂组，推测四物汤更利于有效成分在体内的吸收。这些有效成分在体内吸收差异是否体现了四物汤和四物合剂的疗效优劣，对于这个问题，本课题组欲通过高分辨质谱的技术和代谢组学的方法进行研究，目前这部分实验正在进行中。第五部分四物汤5个有效成分代表性组分组合配伍后在大鼠体内的相互作用通过将四物汤有效成分代表性组分梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪进行组合配伍，考察其在大鼠体内的药代动力学相互作用。将Wistar大鼠随机分组为梓醇组、藁本内酯组、阿魏酸组、芍药苷组、川芎嗪组、（梓醇+藁本内酯+阿魏酸）组、（梓醇+芍药苷）组、（梓醇+川芎嗪）组、（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷）组、（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+川芎嗪）组、（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组和（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷+川芎嗪）组，给药剂量分别为3.5mg·kg-1（梓醇）、100mg·kg-1（藁本内酯）、3mg·kg-1（阿魏酸）、100mg·kg-1（芍药苷）和1mg·kg-1（川芎嗪）。采用灌胃给药的方式，于给药前、给药后不同时间点采集大鼠血样。用LC-MS/MS检测血浆样品中的有效成分代表性组分的含量。血药浓度-时间数据由WinNonlin5.2统计软件进行药代动力学参数的计算。药代动力学参数的差异由SAS9.2软件采用单因素方差分析的方法进行统计分析。对于梓醇，与单独给药比较，配伍混合给药后梓醇的Cmax和AUC明显减小（P<0.05）。当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时混合给药时，梓醇的在大鼠体内的平均滞留时间MRT明显长于（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+川芎嗪）组和（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组中梓醇的MRT （P<0.05）。梓醇与其它4个有效成分混合给药前后，梓醇的生物半衰期T1/2和达峰时间Tmax基本保持不变。对于藁本内酯，（梓醇+藁本内酯+阿魏酸）组中藁本内酯的T1/2和Tmax明显短于藁本内酯单独给药组以及含藁本内酯的混合给药组。而当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时混合给药时，藁本内酯的AUC明显大于藁本内酯单独给药组（P<0.05）。混合给药后，藁本内酯的平均滞留时间MRT略短于藁本内酯单独给药组（P<0.05）。藁本内酯与其它4个有效成分混合给药前后，藁本内酯的达峰浓度Cmax无明显变化。对于阿魏酸，混合配伍给药后，阿魏酸的Cmax与阿魏酸单独给药时相比明显减小（P<0.05）。除了（梓醇+藁本内酯+阿魏酸）组之外，其它3个配伍给药组中阿魏酸的AUC明显小于阿魏酸单独给药组（P<0.05）。同时，当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时配伍给药时，阿魏酸的达峰时间Tmax相比阿魏酸单独给药组略显延长（P<0.05），其它配伍给药组则无显着变化。芍药苷与其它4个有效成分配伍给药前后，对芍药苷的主要药动学参数T1/2、Tmax、Cmax和AUC无显着影响。但当梓醇、藁本内酯、阿魏酸、芍药苷和川芎嗪同时配伍给药时，芍药苷在大鼠体内的平均滞留时间MRT明显长于（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷）组中芍药苷的MRT（P<0.05）。对于川芎嗪，与川芎嗪单独给药相比较，川芎嗪与其它4个有效成分组合配伍给药后川芎嗪的Cmax和AUC均明显增大（P<0.05）。（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+芍药苷+川芎嗪）组与（梓醇+川芎嗪）组和（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组相比较，川芎嗪的Cmax和AUC均明显增大（P<0.05）。同时，（梓醇+藁本内酯+阿魏酸+川芎嗪）组与（梓醇+芍药苷+川芎嗪）组相比较，川芎嗪的AUC明显增大（P<0.05）。综上所述，分别来自四物汤的四味配伍药材的5个有效成分代表性组分在大鼠体内存在复杂的药代动力学相互作用，其潜在的作用机制尚不完全明确，需待进一步的研究。本研究为四物汤有效成分组方制剂的研究提供了有价值的信息，对四物汤有效成分组方制剂的研究具有重要的指导意义。
梁淼[9]2014年在《基于P450酶的四物汤配伍规律研究》文中进行了进一步梳理本实验以四物汤为研究对象，以细胞色素P450酶为切入点，研究四物汤复方，熟地、当归、白芍、川芎四味单药对大鼠肝脏P450酶活性的影响，利用药物干预后的大鼠肝微粒体与混合探针药物共孵育，通过LC/MS-MS检测特异性代谢产物来判定对酶活性的影响。并进一步研究了熟地、当归、白芍、川芎四味药两两配伍以及四物汤中的果糖、阿魏酸、芍药苷、川芎嗪四种有效单体成分对大鼠肝脏P450酶活性的影响。同时利用实时定量PCR研究四物汤复方、单药、两两配伍以及四种单体成分对大鼠肝脏P450酶亚型(CYP1A2, CYP2B1, CYP2C11, CYP3A1)mRNA表达的影响。期望为临床合理用药提供依据，并从药物代谢酶的角度研究四物汤的配伍规律。结果显示：四物汤复方组及芍药苷组对CYP1A2酶活性具有诱导作用，熟地+白芍、当归+白芍、当归+川芎、白芍+川芎及果糖、川芎嗪组对CYP1A2酶活性具有抑制作用。四物汤复方、单药、两味药配伍及四种有效单体成分对CYP2B6酶活性均显示抑制作用。熟地组、当归组、白芍+川芎组对CYP2C9酶活性具有诱导作用，当归+川芎组及果糖、阿魏酸、川芎嗪组对CYP2C9酶活性具有抑制作用。熟地+白芍、当归+白芍、当归+川芎、白芍+川芎及果糖、阿魏酸、川芎嗪对CYP2C19酶活性均具有抑制作用。当归+白芍、当归+川芎、白芍+川芎对CYP2D6酶活性具有诱导作用，果糖、芍药苷组对CYP2D6酶活性具有抑制作用。熟地+川芎对CYP3A4具有抑制作用，当归+川芎对CYP3A4具有诱导作用。在mRNA转录水平，四物汤及其配伍、有效组分的的调节有些与酶活性水平一致，提示对酶活性的调节可能是通过调控mRNA转录水平实现的，而有些对mRNA转录的影响与酶活性水平并不具有一致性，提示可能是直接作用于酶活性环节。本实验研究结果一方面显示四物汤对某些亚型酶活性具有一定的调控作用，为临床联合用药提供参考；另一方面从四物汤复方、单药及配伍对某些酶亚型活性的调控可以看出，配伍组或单药组对酶活性有不同程度的诱导或抑制作用，而复方组对酶活性却无影响，说明四物汤复方组方的合理性。对某些亚型活性的调节也可看出熟地和当归组与复方组的作用趋势具有一致性，体现熟地和当归在复方中的位于主要地位。
高月[10]2003年在《放化损伤致血虚证的分子基础及四物汤反证研究》文中进行了进一步梳理放化损伤致血虚证分子基础及四物汤反证研究 中医“证”的动物模型研究关键有两个方面：一为模型本身是否能体现该“证”的临床意义及其病理生理变化实质，是否能量化?另一为模型本身所体现的病理生理反应本质能否被相对应的代表方剂所逆转。以此验证模型的可靠性及实用性，为同类方剂的现代化研究提供实验基础。 1、血虚证研究 在血虚证的研究方面，系统研究了放化损伤致血虚证发生发展的证本质，提出了放化损伤致血虚证动物与外周血各血液成份改变、骨髓造血干／祖细胞的动态变化、骨髓和脾细胞凋亡、CD34~+细胞的改变、细胞周期和造血相关基因的表达等密切相关。并以此评价了四物汤的作用机制及治疗效果。提出了辐射可造成白细胞下降和骨髓造血损伤，是比较好的一种造模方法。剂量分别为2.5Gy、3.5Gy、5.5Gy和7.5Gy，剂量率为161.2～164.8伦/分，照射剂量是此模型的关键所在，因照射剂量小达不到损伤要求，而剂量大，骨髓造血损伤严重受抑，中医药治疗难以逆转。四物汤可以逆转3.5和5.5Gy照射所致该血虚证小鼠外周血的下降，使照后第5、7、9、11天的白细胞数和第1、5天后的血小板数明显高于对照组，而对7.5Gy照射所致的损伤不能逆转。提出照射损伤模型以3.5和5.5Gy的照射剂量为最佳使用剂量。对化学损伤模型，观察了250mg／kg环磷酰胺一次给药和50mg/kg连续给药5天的造模方法，均可使动物外周血在一定程度上下降，但以白细胞影响最为明显。在对骨髓造血干／祖细胞的影响方面，环磷酰胺给药以250mg/kg一次性给药为宜，药后各造血祖细胞集落均明显受抑。照射和环磷酰胺给药后均能使骨髓细胞周期紊乱，细胞凋亡，但各有其变化特点。得出了化学损伤和照射损伤所致动物血虚证的损伤特点：照射损伤着重在骨髓造血的损伤方面，化学损伤着重表现在外周血各血液成分的下降方面，丰富了该模型的研究内容。 2．1 四物汤研究 2.1在建立的放化损伤致血虚证基础上，系统观察了四物汤及其16个不同配伍组方对血虚证小鼠外周血各血液成份的变化、骨髓中干祖细胞的数量和质量、CO34+细胞表达、细胞周期、细胞凋亡、基因组学和蛋白质组学的改变等影响，分析了四物汤补血的可能途径和作用机理。 2.1在拆方研究方面，通过16个不同配伍组方的拆方研究，揭示四物汤全方在拆方中的主导地位:尽管各配伍组方在不同指标上各有特点，如力I芍对凋亡的影响，白芍川芍对细胞周期的影响，白芍对外周血白细胞的影响等，四物汤全方的效果均优于各配伍组方。而在对外周血的影响方面，白芍确属反佐之品。 2.1在物质基础分析方面，采用活性检测指导下的导向分离研究，比较并选择最强活性成分进行追踪，使物质分离和活性分离同步进行，找到四物汤补血的有效物质基础。提出了四物汤补血作用的活性部位主要含一些多糖、单双糖及与其极性相似的一些成分，还有少量中等极性的小分子物质。对B、CZ、C3尤其是C3部位进行进一步的分离分析，并对不同配伍组方与补血物质基础的变化、补血药理效应的变化结合考察，从化学、生物效应两个方面揭示四物汤配伍组方原理的科学内涵。提出了芍药贰的补血作用地位。 此研究为方剂和证候学的结合研究提供了参考模式。
参考文献：
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[5]. 四物汤的纯化工艺及其补血作用的研究[D]. 谭有能. 四川大学. 2006
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[7]. 用分子中药组学技术研究四物汤补血的作用机理[J]. 马增春, 高月, 谭洪玲, 梁乾德, 王升启. 世界科学技术. 2005
[8]. 四物汤有效成分代表性组分药代动力学相互作用研究[D]. 黄开福. 中国人民解放军军事医学科学院. 2014
[9]. 基于P450酶的四物汤配伍规律研究[D]. 梁淼. 广西医科大学. 2014
[10]. 放化损伤致血虚证的分子基础及四物汤反证研究[D]. 高月. 中国人民解放军军事医学科学院. 2003
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