骆叶[1]2007年在《小檗碱抑制肿瘤细胞Cyclin D1相关信号通路的研究》文中进行了进一步梳理目前,肿瘤的发病率和死亡率在中国乃至世界仍居高不下,它不仅给患者本人及其家庭带来巨大的痛苦,同时也对整个社会的发展与进步造成极大的威胁。因此,寻求安全、有效、低毒的抗肿瘤药物一直受到国内外医药界专家学者的重视,而从天然化合物中开发此类药物也成为研究热点。所有癌细胞的一个特异性表型异常是细胞周期调控失调,细胞周期的调控与多种细胞内信号通路有关,阻断细胞内信号通路从而抑制细胞周期正调控相关蛋白表达是抑制肿瘤细胞异常增殖的关键。本研究在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制,为阐明小檗碱阻滞肿瘤细胞周期进展、抑制肿瘤细胞增殖的作用机理提供实验依据,并为小檗碱抗肿瘤的临床应用提供理论依据。第一部分:研究小檗碱对人高转移性肺癌PG细胞周期进展和Cyclin D1表达的影响。1.培养人高转移性肺癌PG细胞,采用MTT法检测小檗碱对PG细胞增殖的作用。与对照组相比,经不同浓度(10μg/ml, 20μg/ml, 40μg/ml)的小檗碱处理24小时和48小时,PG细胞生长明显受到抑制。2.流式细胞仪检测小檗碱对PG细胞周期进展的影响,结果表明,小檗碱可使G0/G1期细胞增多,而S期和G2/M期细胞减少,与对照组相比有显着差异(P <0.01);小檗碱高低剂量组间有明显差异(P <0.05)。3.RT-PCR结果显示,经不同浓度小檗碱处理后24小时,PG细胞Cyclin D1的mRNA水平较对照组明显降低。小檗碱对PG细胞Cyclin D1的表达有抑制作用。第二部分:研究小檗碱对PG细胞Cyclin D1相关信号通路的作用。在确定小檗碱对肿瘤细胞周期的阻滞作用和对周期进展关键蛋白Cyclin D1的抑制作用的基础上,研究其对Cyclin D1相关信号通路的作用,探讨小檗碱抑制Cyclin D1转录的分子机制。1.双荧光素酶报告基因结果显示,小檗碱对PG细胞AP-1, Wnt信号通路活性有明显抑制作用,而对NF-κB信号通路影响不明显。进一步实验表明,经PDB+Ionomysin处理的PG细胞AP-1信号通路被激活,小檗碱能有效抑制这种激活,其作用呈剂量依赖性。2. Western Blot检测表明,经不同浓度小檗碱处理后,PG细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun蛋白含量明显降低,降低的水平与小檗碱浓度相关。3. EMSA结果显示,不同浓度的小檗碱均能抑制PG细胞核提取物与带有野生型AP-1位点的寡核苷酸结合;经小檗碱处理后PG细胞核提取物与Cyclin D1上游启动子区带有AP-1位点的寡核苷酸结合减少。实验结果提示:1.小檗碱通过抑制周期进展关键蛋白Cyclin D1,阻滞PG细胞周期进展,从而抑制PG细胞增殖。2.小檗碱对Cyclin D1相关信号通路AP-1和Wnt的活性具有抑制作用,对NF-κB通路活性影响不明显。小檗碱对异常激活的AP-1信号通路活性仍有显着的抑制作用。3.小檗碱能降低细胞内与Cyclin D1转录密切相关的AP-1转录因子组分c-Jun含量,并抑制Cyclin D1基因启动子区与AP-1转录因子的结合,从而抑制Cyclin D1基因的转录水平,降低Cyclin D1的表达。这是小檗碱抑制Cyclin D1表达、进而阻滞肿瘤细胞周期的机制之一。
陈程[2]2015年在《巨噬细胞源性TNF-α在肝前体细胞恶性转化中的作用及机制研究》文中研究说明第一部分巨噬细胞源性TNF-α在肝前体细胞恶性转化中的作用及机制研究研究背景和目的原发性肝癌按照细胞来源通常分为三种类型：肝细胞癌(HCC)、肝内胆管癌(ICC)和混合型肝癌(CHC)。目前研究认为HCC与ICC分别来源于肝细胞和胆管细胞,CHC主要来源于肝前体细胞。然而,HCC的高度异质性及部分HCC表达干细胞标志物支持部分HCC来源于肝前体细胞的假说。研究人员对HCC的基因表达谱聚类分析发现,部分HCC具有肝母细胞或肝前体细胞样表达谱,提示肝前体细胞可能是HCC的来源之一。然而,目前对HCC的细胞来源尚存争议,缺乏充足的科学证据。因此,HCC的细胞来源仍有待阐明,从而优化HCC的病理分型,促进肝癌的治疗特别是个性化治疗。肝前体细胞,也叫卵圆细胞,具有分化为肝细胞和胆管细胞的双向分化潜能。当肝脏发生慢性损伤时,如病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝病等,肝前体细胞会代偿性活化。研究发现,从p53缺失小鼠分离的肝前体细胞能在裸鼠皮下形成肿瘤;过表达Ras能使小鼠原代肝前体细胞恶性转化为肝癌起始细胞,均证明肝前体细胞可以作为肝癌起始细胞的来源。本科室前期研究也发现,TGF-β长期刺激能使肝前体细胞发生恶性转化,成为肝癌起始细胞,从而促进肝硬化引起的肝癌发生。然而,肝前体细胞是否参与了慢性炎症引起的肝癌发生仍不清楚,有待阐明。慢性非可控性炎症是肝癌发生的显着特征及致病因素。越来越多的研究表明,炎症在肿瘤发生过程中有多种作用,但其分子机制尚不十分清楚。枯否细胞即肝脏组织中的巨噬细胞,是参与炎症反应最主要的炎性细胞,是重要的炎性因子TNF-α、IL-6的主要来源。Pikarsky等报道了在小鼠肝炎模型中TNF-a引起的NF-κB活化介导了肝细胞恶性转化。Karin等证明了IL-6/STAT3通路在肝癌发生中的重要作用。然而,巨噬细胞及其分泌的TNF-α、IL-6在肝前体细胞恶性转化中的作用尚不十分清楚。本课题的研究目的是探讨巨噬细胞及其分泌的炎性因子TNF-α、IL-6在肝前体细胞恶性转化中的作用及分子机制,不仅为肝癌发生提供新的思路,并且提出肝癌新的分子分型,为肝癌的个性化治疗提供重要参考。研究方法：1.对CK19阳性HCC病人组织进行肝前体细胞标志物OV6的免疫组织化学染色,统计CK19阳性病人中OV6阳性的比例。2.收集整理上述病人的临床病理信息和预后随访信息,统计分析OV6表达与CK19+肝癌病人的临床病理和预后的相关性。3.建立大鼠DEN诱癌模型,通过免疫组化染色研究在肝脏炎症过程中肝前体细胞的活化情况,通过RT-PCR分析肝脏中炎性因子表达与肝癌起始细胞(T-IC)标志物表达的相关性。4.采用免疫磁分选方法,从DEN大鼠第15周的肝脏中分选OV6阳性的肝前体细胞,进行NOD-SCID鼠皮下接种,观察肝前体细胞是否发生恶性转化。5.在大鼠DEN诱癌的基础上,建立GdCl3清除巨噬细胞模型,研究在肝癌发生中巨噬细胞对肝前体细胞的影响。6.采用免疫磁分选方法,从DEN/saline组和DEN/GdCl3组大鼠第15周的肝脏中分选肝前体细胞,研究清除巨噬细胞对肝前体细胞的影响。7.分离大鼠腹腔巨噬细胞,将LPS活化的巨噬细胞与大鼠肝前体细胞系进行Transwell共培养,研究巨噬细胞分泌的炎性因子对肝前体细胞自我更新的影响。8.用含巨噬细胞上清的条件培养基对肝前体细胞系进行长期刺激,通过体外克隆形成实验观察其对肝前体细胞恶性转化的影响。9.分别用细胞因子TNF-α、IL-6长期刺激肝前体细胞系,通过NOD-SCID鼠皮下荷瘤观察TNF-α、IL-6是否引起肝前体细胞恶性转化。10.通过检测TNF-α长期刺激的肝前体细胞的T-IC标志物表达、克隆形成、成球能力等,研究TNF-α长期刺激是否使肝前体细胞恶性转化为T-IC。11.利用慢病毒建立干扰TNFR1的肝前体细胞系,验证巨噬细胞分泌的TNF-α对肝前体细胞恶性转化的影响。12.通过核型分析,研究TNF-α长期刺激的肝前体细胞是否具有染色体不稳定性。13.通过细胞免疫荧光检测中心体的数目和结构、RT-PCR检测染色体不稳定性关键调控分子的表达,研究TNF-α引起肝前体细胞染色体不稳定性的机制。14.通过RT-PCR、western blot实验,检测TNF-α长期刺激的肝前体细胞中干性调控基因和信号通路关键分子的表达。15.通过染色质免疫共沉淀实验,证明p-STAT3对Nanog、Lin28启动子区的结合。16.用STAT3抑制剂验证STAT3对TNF-a长期刺激的肝前体细胞自我更新的影响。17.通过western blot实验检测调控STAT3的上游分子,并用Src抑制剂验证Src对STAT3的调控。研究结果：1.在CK19阳性的HCC中,OV6阳性比例为65%左右。2. CK19+OV6+肝癌比CK19+OV6-肝癌具有更侵袭性的病理特征,并且病人术后复发率更高。3.在大鼠DEN诱癌模型中,肝前体细胞随着时间明显扩增：肝脏中T-IC标志物的表达与炎性因子TNF-α的表达呈正相关。4.从DEN大鼠第15周肝脏中分选的OV6阳性肝前体细胞能在NOD-SCID鼠皮下形成肿瘤,且肿瘤组织表达AFP、CK19。5.与从DEN/saline组分选的肝前体细胞相比,DEN/GdCl3组分选的肝前体细胞的T-IC标志物表达降低；干性调控基因和自我更新能力降低。DEN/GdCl3组肝脏肿瘤数目少于DEN/saline组,且DEN/GdCl3组肿瘤中未检测到OV6表达。6.与巨噬细胞Transwell共培养促进了肝前体细胞的自我更新能力；含巨噬细胞上清的条件培养基长期刺激肝前体细胞系,使肝前体细胞获得了体外形成克隆的能力。7. TNF-a长期刺激使肝前体细胞发生恶性转化,并且形成的肿瘤表达AFP、CK19、 OV6、CD133。IL-6长期刺激未引起肝前体细胞的恶性转化。8. TNF-a长期刺激使肝前体细胞获得了T-ICs的特征,包括T-IC标志物表达升高、自我更新能力增强。9.干扰TNFR1抑制了巨噬细胞上清刺激引起的肝前体细胞的恶性表型。10. TNF-a长期刺激引起肝前体细胞的染色体不稳定性。11.UBD、Chk2异常表达参与了TNF-a引起的肝前体细胞染色体不稳定性。12. STAT3的活化介导了TNF-a长期刺激引起的肝前体细胞自我更新能力增强。13.Src参与了TNF-a长期刺激引起的STAT3的活化。结论：本研究将CK19和OV6联合应用作为肝癌的分子分型标志物,提示肝前体细胞来源的HCC,并指导肝癌病人预后。利用体内巨噬细胞清除模型和体外共培养模型证明了巨噬细胞在肝前体细胞恶性转化中发挥促进作用。巨噬细胞分泌的TNF-a引起UBD、Chk2异常表达使肝前体细胞发生染色体不稳定性,并活化Src/STAT3信号通路增强肝前体细胞自我更新能力,导致肝前体细胞向肝癌起始细胞恶性转化。研究结果为炎症促进肝癌发生提供了新的思路。第二部分Cyclin G1对肝癌起始细胞的调控及机制研究研究背景和目的原发性肝癌是一种恶性程度极高、预后极差的肿瘤,肝癌的5年内复发率高达70%。由于大部分肝癌病人诊断时已处于晚期,失去手术机会,故只能采用化疗或靶向治疗。但是,由于肝癌具有化疗抵抗的特征,常规化疗或动脉化疗栓塞均不能完全杀死肝癌细胞。因此,阐明肝癌复发与化疗抵抗的分子机制对提出新的治疗策略具有重要作用。近年来,越来越多的研究支持肿瘤干细胞理论,即肿瘤来源于一小群具有自我更新能力和多项分化潜能的肿瘤干细胞或肿瘤起始细胞。目前在多种肿瘤中均检测到肿瘤起始细胞的存在,如白血病、胶质瘤、乳腺癌、肝癌等。肝癌起始细胞可以被特定的细胞表面标志物所鉴定,如CD133、CD90、EpCAM、CD24、OV6等。肿瘤起始细胞具有起始肿瘤和化疗抵抗的特性。研究认为肝癌起始细胞可能是目前治疗效果差的最主要原因,清除肝癌起始细胞对肝癌长期消退甚至治愈十分关键。然而,目前肝癌起始细胞的调控机制尚不十分清楚,缺乏特异靶向肝癌起始细胞的治疗。因此,阐明肝癌起始细胞扩增的分子机制十分迫切。Cyclin G1(细胞周期蛋白G1)是细胞周期蛋白家族成员之一,与c-src具有同源性。研究报道cyclin G1受p53转录激活并对p53家族蛋白产生负反馈调节。在肝癌发生模型中,cyclin G1的缺失可导致肿瘤形成减少。本实验室前期研究表明cyclin G1能促进肝癌细胞发生EMT从而促进肝癌转移。然而,cyclin G1对肝癌起始细胞的调控及其在肝癌化疗抵抗、复发中的作用尚不清楚。本课题的研究目的是探讨cyclin G1对肝癌起始细胞的调控作用和分子机制,以及其在肝癌化疗抵抗和复发中的临床意义,为肝癌治疗提供新的策略。研究方法：1.通过RT-PCR检测化疗抵抗的移植瘤中cyclin G1的表达情况。2.采用Annexin V凋亡检测试剂盒,检测过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞对sorafenib引起凋亡的反应。3.将含138例肝癌病人的组织芯片进行cyclin G1的免疫组织化学染色,结合病人随访信息分析cyclin G1与病人术后复发的相关性；多因素分析评判cyclin G1作为术后复发的独立风险因素的可能性。4.分离病人原代肝癌细胞进行成球实验,比较贴壁原代肝癌细胞与sphere中cyclin G1的表达水平。5.在从sphere中分选的CD133+或OV6+的肝癌起始细胞与阴性细胞中检测cyclinG1的表达水平。6.通过RT-PCR检测30例肝癌病人原代sphere中cyclin G1、CD133、CD90的表达情况,并对cyclin G1和CD133或CD90的表达进行相关性分析。7.比较过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞中CD133、CD90的表达水平和形成sphere的能力。8.通过体外和体内有限稀释实验,比较过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞中肝癌起始细胞的比例。9.通过RT-PCR比较过表达cyclin G1的肝癌细胞和对照细胞中干性相关基因的表达水平。10.通过RT-PCR检测肝癌病人原代sphere中cyclin G1和Sox2的表达情况,并对cyclin G1和Sox2的表达进行相关性分析。11.利用siRNA干扰Sox2表达,分析其对cyclin G1促进肝癌起始细胞扩增的影响。12.将Akt、mTOR抑制剂联合应用,检测其对cyclin G1促进Sox2表达和成球能力的影响。13.将Akt、mTOR抑制剂联合应用,检测其对cyclin G1过表达抵抗sorafenib引起的凋亡的影响。14.将Akt、mTOR抑制剂联合应用,检测其对cyclin G1促进肿瘤起始的影响。研究结果：1.与对照相比,在化疗抵抗的移植瘤中cyclin G1的表达升高。2.过表达cyclin G1使肝癌细胞对sorafenib引起的凋亡不敏感。3. Cyclin G1高表达组病人术后复发率高于低表达组,且cyclin G1可以作为判断复发的独立风险因素。4.病人原代sphere中cyclin G1的表达水平高于贴壁细胞。5.在从sphere中分选的CD133+或OV6+的肝癌起始细胞中,cyclin G1的表达水平高于CD133-或OV6-细胞。6.与对照细胞相比,过表达cyclin G1的肝癌细胞中CD133、CD90的表达升高,且成球能力增强。7.与对照细胞相比,过表达cyclin G1的肝癌细胞中肝癌起始细胞的比例增多。8.过表达cyclin G1促进干性调控基因Sox2表达升高。9.敲低Sox2表达抑制了cyclin G1促进的肝癌起始细胞扩增。10. Akt/mTOR抑制剂抑制了cyclin G1对Sox2表达和成球能力的促进作用。11.Akt/mTOR抑制剂抑制了cyclin G1过表达对sorafenib引起的凋亡的抵抗作用。12.Akt/mTOR抑制剂抑制了cyclin G1促进肿瘤起始的作用。结论：本研究揭示了cyclin G1与肝癌复发、化疗抵抗的相关性。首次提出cyclin G1在促进肝癌起始细胞扩增中的作用,以及cyclin G1通过Akt/mTOR/Sox2信号通路调控肝癌起始细胞的扩增。本研究的结果为肝癌的个性化治疗提供了新的靶点。
陈楚杰[3]2017年在《细胞周期相关蛋白在人结肠癌组织中的表达及其临床意义的探讨》文中研究说明目的:检测结肠癌患者组织中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白E(cyclin E)以及NIK-IKK结合蛋白(NIBP)的表达,探讨其与临床、病理特征之间的关系,并分析叁者在结肠癌组织中表达的相关性。为结肠癌的早期诊断和预后提供一个可靠的分子生物学指标。方法:收集从2015年2月到2015年12月之间广西医科大学第一附属医院结直肠外科经外科手术切除及消化内科肠镜活检的部分标本130例,正常结肠黏膜、结肠癌各65例,所有的患者均未接受放化疗。采用免疫组织化学SP法分别检测并分析NIBP、cyclin E和cyclinD1的表达和相关性,并分析上述蛋白的表达与结肠癌患者肿瘤的浸润深度、TNM临床分期、淋巴结转移和远处转移相关性。结果:(1)NIBP在结肠癌组织中高表达阳性率为60.00%(39/65),明显高于正常结肠粘膜组织中的阳性表达率[18.46%(12/65),P<0.05],差异具有统计学意义;Cyclin E在结肠癌组织中高表达阳性率为56.92%(37/65),显着高于正常结肠粘膜组织中的阳性表达率[3.08%(2/65),P<0.05],差异具有统计学意义;CyclinD1在结肠癌组织中高表达阳性率为89.23%(58/65),显着高于正常结肠粘膜组织中的阳性表达率[43.08%(28/65),P<0.05],差异具有统计学意义。(2)结肠癌组织中CyclinE、NIBP和Cyclin D1的表达与肿瘤浸润深度、TNM临床分期、淋巴结转移和远处转移明显相关(p<0.05)。(3)结肠癌组织中NIBP和Cyclin D1表达之间呈正相(r=0.32,P<0.05),NIBP和CyclinE表达之间呈正相关(r=0.43,P<0.05),CyclinD1和CyclinE表达之间呈正相关(r=0.23,P<0.05)。结论:(1)NIBP、Cyclin E、Cyclin D1在结肠癌中高表达,叁者可能参与了结肠癌的发生发展;(2)叁者在结肠癌中的高表达都可促进肿瘤细胞的浸润与转移,其表达越高,浸润深度越深,淋巴结及远处转移可能性越大。(3)NIBP可能促进CyclinE和Cyclin D1的高表达而导致细胞周期调控异常,叁者可能共同参与了结肠癌的发生发展。
刘利丹[4]2017年在《GPX7在甲状腺乳头状癌中的研究》文中研究指明研究背景:甲状腺癌是内分泌器官中最常见的恶性肿瘤,主要病理类型有甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡癌、未分化癌和髓样癌等。其中PTC最为常见。一般而言,PTC发展缓慢,病程较长,预后较好,但也有很多PTC患者因没有临床症状,就诊较晚,一经发现,即伴随有淋巴结转移、被膜侵犯等情况,导致患者的预后不佳;故仍需要早发现、早诊断、早治疗PTC。尽管多数文献报道,PTC的发病机制与BRAF基因突变、RET/PTC基因重排等有关,但目前有关PTC的发病机制仍未完全明确,因此深入研究PTC的发病机制有着重要的临床意义。哺乳动物细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPXs)是机体内最主要的氧化还原酶,由8种GPX组成,分别命名为GPX1-GPX8,其中GPX1-GPX4以及GPX6为含硒代半胱氨酸的GPXs,GPX5、GPX7及GPX8则为非含硒代半胱氨酸的GPXs。通常,含硒代半胱氨酸的GPXs能够通过催化还原型谷胱甘肽(GSH)来还原H2O2,以达到降低疾病氧化应激反应的作用。而非含硒代半胱氨酸的GPXs,不同于含硒代半胱氨酸的GPXs,其缺少GSH结合结构域,因此,它们引起过氧化物酶活性的机制还存在争议。活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)包括氧离子和过氧化物等活性含氧分子,是机体正常代谢产生的内在产物。有学者提出氧化应激反应与肿瘤的发生、发展有关。所谓的氧化应激反应是指机体遭受有害刺激时,体内的ROS产生过多,使机体氧化程度超出氧化物的清除,使得氧化系统与抗氧化系统失衡而引起的组织损伤。ROS包括O2-、H2O2、HO2-、-OH等的活性含氧分子。长期持续的氧化应激,会导致自身免疫异常、肿瘤发生、糖尿病、肥胖、神经变性和衰老等等多种疾病。甲状腺的主要生理功能是合成甲状腺激素,其中的h2o2作为甲状腺激素合成的关键酶-甲状腺过氧化物酶的必需底物,对甲状腺激素合成及发挥正常甲状腺生理功能起到非常重要的作用。当机体发生异常时,h2o2可在甲状腺中过度蓄积,使得甲状腺持续暴露在高浓度的h2o2及其附带效应产生的ros环境中,即氧化应激反应中,使甲状腺细胞受到氧化性dna损伤或基因低甲基化。已有研究证实,大量的ros可促进自身细胞的增殖、侵袭、转移及血管生成,并能逃避凋亡的发生。因此,氧化还原反应的异常可能与ptc的发生、发展有关。gpx7是gpxs家族成员之一,主要参与维持机体的氧化还原稳态的作用。近年来研究发现,gpx7异常表达与多种肿瘤(包括食管腺癌、乳腺癌、肝细胞癌等)的发生、发展相关,但有关gpx7在甲状腺癌中的研究尚未见报道。已知nf-κb是一种存在于真核细胞中控制dna转录的重要核转录因子,具有多向转录调节作用,已证实nf-κb与多种恶性肿瘤的发生、发展有关。有文献报道gpx7在食管腺癌(eac)中的作用有可能是通过nf-κb信号通路来发挥作用的。cyclind1能够正性调控细胞周期,是检测细胞增殖活性的指标之一,有报道cyclind1是nf-κbp65的重要下游靶基因。有关gpx7在甲状腺乳头状癌中与nf-κb、cyclind1表达关系的研究,尚未见报道。因此,本研究目的是从组织和细胞水平分别研究gpx7在ptc中的表达,以及与ptc临床病理参数的关系,探讨gpx7在ptc发生、发展过程中的作用及可能机制,为进一步研究gpx7在甲状腺乳头状癌中的作用机制奠定基础。目的:1、从组织和细胞水平研究gpx7在ptc中的表达情况及对ptc细胞增殖和凋亡的影响,探讨gpx7在ptc发生、发展中所起的作用。2、从组织和细胞水平分别研究gpx7与nf-κbp65、cyclind1表达的关系,探讨gpx7参与调控ptc细胞增殖与凋亡的可能机制。3、研究gpx7蛋白在伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌(ptc+ht)组织中的表达,探讨桥本甲状腺炎的炎性微环境对gpx7表达的影响,为进一步研究gpx7在甲状腺乳头状癌中的作用机制奠定基础。方法:1、用免疫组织化学方法检测30例ptc、14例结节性甲状腺肿(结甲)组织中gpx7蛋白的表达情况,并分析gpx7与临床病理特征的关系。2、构建gpx7基因干扰慢病毒载体,用westernblot方法外源验证靶点有效后,用构建成功的gpx7基因干扰慢病毒载体感染甲状腺乳头状癌(k1)细胞,使用qt-pcr的方法检测基因敲减效果;并用多种细胞功能实验(celigo细胞计数、流式细胞仪检测、caspase3/7检测、mtt检测、细胞克隆形成实验)方法,观察gpx7基因敲减与未基因敲减的k1细胞的细胞增殖、凋亡、克隆形成的差异。3、用免疫组织化学方法检测30例ptc、14例结节性甲状腺肿(结甲)组织中nf-κbp65、cyclind1蛋白的表达情况,分析各指标与gpx7表达的关系。4、用gpx7基因干扰慢病毒载体感染k1细胞,并用westernblot方法检测gpx7基因敲减前后nf-κbp65、cyclind1蛋白表达情况。5、用免疫组织化学方法检测29例伴有桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌(ptc+ht组)、31例甲状腺乳头状癌(ptc组)、16例桥本甲状腺炎(ht组)以及14例结节性甲状腺肿(结甲组)组织的gpx7表达情况,结合临床病理参数,探讨桥本甲状腺炎的炎性微环境对gpx7表达的影响及在甲状腺乳头状癌中所起的作用。6、免疫组化评判标准:每例均随机观察5个高倍视野,根据染色细胞百分率和染色强度进行评定和分析。阳性细胞百分率计分标准:<10%为0分,11%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分;染色强度计分:无染色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。将阳性细胞率得分和染色强度得分相乘即为最后得分,0分为阴性(-),1~4分为弱阳性(+),5~8分为中度阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。7、统计学方法:采用spss20.0统计软件进行统计分析,计量资料采用均数±标准差表示,组间差异比较采用独立样本t检验,如方差不齐则采用t’检验。计数资料采用例(百分率)表示,组间比较采用卡方检验。相关性分析采用pearson相关性分析。p<0.05为差异具有统计学意义。结果:1、gpx7对甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡影响的研究(1)免疫组化结果:(1)gpx7表达于甲状腺细胞胞质中。gpx7在ptc组表达阳性率为100.0%,以中-强阳性为主;结甲组gpx7表达表达阳性率为30.0%,以弱阳性为主,ptc组gpx7表达明显高于结甲组(p<0.05)。(2)gpx7的表达与肿瘤最大径呈正相关关系(r=0.601,p<0.05),且gpx7高表达组肿瘤最大径(1.56±0.56cm)明显大于gpx7低表达组(0.56±0.13cm)(p<0.05)。(2)细胞实验结果:(1)选取两种人甲状腺乳头状癌细胞系tpc-1和k1。qt-pcr结果显示gpx7基因在tpc-1和k1细胞中都有较高的表达丰度。相比较k1细胞表达丰度更高,故选取k1细胞进行后续实验研究。(2)gpx7基因干扰慢病毒载体制备后,采用westernblot外源验证,发现gpx7基因敲减后gpx7的表达明显减少,说明靶点对gpx7基因的外源表达有敲减作用,是有效靶点。(3)gpx7基因干扰慢病毒载体感染k1细胞后通过普通显微镜和荧光显微镜下观察,发现细胞感染效率达到80%以上,且细胞状态正常,采用qpcr的法证实经shrna慢病毒感染后,k1细胞中gpx7基因在mrna水平的表达量受到抑制,敲减效率达到81.5%,说明载体感染k1细胞效果好,可以进行后续的实验观察。(4)celigo细胞计数结果显示,gpx7基因敲减组细胞增殖数明显减少,培养第5天较第1天仅增殖(5.00±0.32)倍,与对照组的(8.44±0.26)相比较,增殖速率明显减慢。(5)流式细胞仪检测发现,gpx7基因敲减组细胞凋亡百分比(24.08±0.28)%,与对照组的(4.33±0.15)%相比较,凋亡比例明显增多。(6)caspase3/7活性检测发现,gpx7基因敲减组的caspase3/7活性值为(257.82±21.28),与对照组的(100.00±5.38)相比较,明显增加。(7)mtt检测发现,gpx7基因敲减组培养第5天od490值较第1天增长(3.081±0.160)倍,与对照组(增长4.897±0.091倍)相比较,gpx7基因敲减组细胞增长倍数明显减少。(8)细胞克隆形成检测实验发现,gpx7基因敲减组克隆形成数(283±6)与对照组克隆形成数(710±10)相比较,明显减少。2、gpx7在甲状腺乳头状癌中的可能作用机制(1)免疫组化结果(1)nf-κbp65表达于甲状腺细胞胞质和(或)细胞核中。ptc组表达明显高于结甲组。ptc组nf-κbp65的阳性表达率达83.3%,以中度阳性为主。(2)cyclind1表达于甲状腺细胞核。ptc组表达明显高于结甲组。ptc组cyclind1阳性表达率达到96.7%,以中度阳性为主。(3)gpx7、nf-κbp65、cyclind1蛋白表达呈显着正相关(r值分别为0.721、0.589、0.703,p值均<0.05)。(4)ptc组gpx7与nf-κbp65联合检测阳性率为83.3%,与cyclind1联合检测阳性率为100.0%,叁者联合检测阳性率为83.3%。(2)细胞实验结果(1)慢病毒感染目的细胞效率较高,qpcr证实gpx7基因被有效敲减。(2)westernblot实验结果显示,敲减甲状腺乳头状癌细胞(k1细胞系)的gpx7基因后,nf-κbp65蛋白表达量无明显变化,cyclind1蛋白表达量增高,与敲减前比较,差异有统计学意义(p<0.05)。3、炎性微环境对gpx7在ptc中表达的影响结果(1)免疫组化结果显示,伴桥本甲状腺炎的甲状腺乳头状癌组织gpx7蛋白表达评分(6.21±2.29)低于甲状腺乳头状癌(8.52±2.41),差异有统计学意义(p<0.05)。(2)单因素分析发现影响gpx7表达的因素有合并ht、tg-ab、tpo-ab、肿瘤部位和被膜侵犯情况,其中gpx7与合并ht、tg-ab和tpo-ab水平呈负相关,与肿瘤部位、被膜侵犯情况呈正相关。(3)多因素线性回归分析发现影响gpx7表达的因素为有合并ht。(4)临床病理特征分析,发现合并ht炎性环境的ptc肿瘤多局限于单侧,被膜侵犯发生率低。结论:1、免疫组化和细胞实验结果显示GPX7在甲状腺乳头状癌中高表达。2、免疫组化和细胞实验结果提示GPX7具有促进甲状腺乳头状癌细胞增殖、减少细胞凋亡的作用。3、GPX7、NF-κB p65、Cyclin D1蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达呈正相关,提示叁者在甲状腺乳头状癌的发生、发展中可能有关联。4、GPX7基因敲减后NF-κB p65蛋白表达无变化,提示GPX7对甲状腺乳头状癌的作用与NF-κB信号通路无关或不是通过调节其蛋白表达量来实现的。5、GPX7基因敲减后Cyclin D1蛋白表达增高,机制不清。6、通过单因素和多因素线性回归分析,发现是否合并桥本甲状腺炎是影响甲状腺乳头状癌组织中GPX7表达的因素,提示桥本甲状腺炎的炎性环境能抑制甲状腺乳头状癌组织中GPX7的表达。
罗祖强, 庄志泉, 董为松, 涂晓萌[5]2018年在《p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E在男性乳腺癌组织中的表达及其临床意义》文中研究指明目的:探讨p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E在男性乳腺癌(male breast cancer,MBC)组织中的表达及其临床意义。方法:收集2000年1月至2016年12月60例温州医科大学附属第一医院MBC患者的组织标本,分为乳腺浸润性导管癌组(infiltrating ductal carcinoma,IDC)40例、乳腺导管原位癌组(ductal carcinoma in situ,DCIS)20例,选取20例男性乳腺发育症(gynecomastia,GYM)作为对照组。应用RT-PCR、免疫组织化学法分别检测IDC、DCIS、GYM组织中的p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E m RNA及蛋白的表达情况。结果:IDC的p57~(KIP2)mRNA表达水平为0.18±0.07,低于DCIS的0.42±0.05、GYM的0.75±0.04;IDC的p57~(KIP2)蛋白阳性率为25%(10/40),低于DCIS的60%(12/20)、GYM的90%(18/20);p57~(KIP2)mRNA及蛋白表达叁组间两两比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。IDC的cyclin D1、cyclin E mRNA表达水平分别为0.92±0.12、0.96±0.08,高于DCIS的0.72±0.06、0.64±0.01及GYM的0.38±0.03、0.21±0.02;IDC的cyclin D1、cyclin E蛋白阳性率分别为90%(36/40)、88%(35/40),高于DCIS的80%(16/20)、85%(17/20)及GYM的25%(5/20)、20%(4/20),差异均具有统计学意义(P<0.05)。在IDC组织中p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E表达均与临床分期、组织学分级相关(P<0.05),p57~(KIP2)蛋白的表达与淋巴结转移相关(P<0.05);p57~(KIP2)与cyclin D1、p57~(KIP2)与cyclin E呈负相关(P<0.05),cyclin D1与cyclin E呈正相关(P<0.05)。结论:p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E可能参与了MBC的发生发展过程,联合检测p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E可为进一步发现MBC的发病机制及治疗提供重要参考。
毕海连[6]2015年在《DEC1通过稳定cyclin E调节乳腺癌细胞增殖》文中认为全球每年都有数百万人死于癌症,癌症亦称恶性肿瘤,它的无限制、无止境地增生往往与细胞周期紊乱有关。越来越多的数据表明细胞周期蛋白cyclin E过表达或其基因扩增与肿瘤形成密切相关。cyclin E的表达受多种因子的调节,这些因子通过调节cyclinE的转录、翻译及翻译后修饰进而影响肿瘤的发生发展。时钟蛋白DEC1作为一个重要的转录因子,可以调节多种靶基因的表达,参与细胞分化、凋亡、衰老等生物学过程进而调控肿瘤的发生发展。目前的研究结果表明DEC1既可以抑制肿瘤的生长、介导p53诱导的细胞衰老,又可以促进肿瘤细胞的生存起到抗凋亡的作用,但是DEC1如何调节肿瘤细胞生存以及细胞周期进程的分子机理还不清楚。因此本文着重研究了DEC1如何影响乳腺癌细胞的增殖以及对细胞周期蛋白cyclin E稳定性及功能的影响。本文主要工作如下：1.通过克隆形成实验和MTT实验发现DEC1的过表达抑制了MCF-7和T47D细胞的生长。相反,干扰DEC1后明显抑制了细胞集落的大小和数量。2.在MCF-7细胞中通过免疫印迹、流式细胞术等方法研究DEC1表达的变化。实验发现时钟蛋白DEC1在细胞周期的进程中其自身表达存在周期性,主要在G1/S期表达量较高,其表达的变化与细胞周期蛋白cyclin E相似。在MCF-7和T47D两种乳腺癌细胞中,DEC1以剂量依赖的方式上调cyclin E蛋白含量,并且不影响cyclin E的mRNA水平。3.DEC1上调cyclin E的蛋白含量但不影响其转录,因此可能影响cyclin E的降解。通过半衰期实验证实DEC1稳定了cyclin E,延长了cyclin E的半衰期。通过免疫印迹实验,发现DEC1对cyclin E的调节依赖cyclin E的泛素E3酶Fbw7,通过免疫共沉淀实验证实DEC1抑制cyclin E与Fbw7a相互作用,抑制cyclin E的泛素化,进而稳定cyclinE。4.通过免疫共沉淀实验,哺乳动物双杂交实验证实在血清饥饿及正常条件下DEC1与周期蛋白cyclin E存在相互作用。同时,内源的实验也验证了DEC1与cyclin E存在相互作用。通过荧光共定位实验发现,cyclin E与DEC1很好的定位在细胞核中。另外,检测了DEC1与cyclin E相互作用动力学,结果发现DEC1与cyclin E主要是在G1及S期存在相互作用,在恢复培养8h后其相互作用最明显,即G1/S期检测点。5.研究DEC1对cyclin E功能及细胞周期进程的影响。cyclin E通常与Cdk2相互作用之后被降解,实现cyclin A与Cdk2的结合。通过共沉淀结果发现DEC1增加了cyclinE/Cdk2,抑制了随后的cyclin A/Cdk2的结合,引起细胞S期延长,导致细胞周期停滞。最后在裸鼠肿瘤实验中发现DEC1明显抑制了肿瘤的生长。本论文的研究将时钟蛋白DEC1与细胞周期因子cyclin E联系起来,确定DEC1抑制cyclin E泛素化降解过程影响了cyclin E的功能,进而抑制乳腺癌细胞的增殖,本研究为乳腺癌的治疗,特别是cyclin E高表达的乳腺癌的治疗提供理论依据,为选择特异性药物靶点、优化治疗措施提供科学基础。
王竞伟, 邵先茹, 段秀庆[7]2018年在《Cyclin D1与乳腺癌的相关研究》文中指出细胞周期的失调控是乳腺癌进展的一个早期事件,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是参与细胞周期进展的重要因素之一,它在正常乳腺组织中正常表达,在乳腺癌组织中过表达,导致细胞周期调控失调,它是参与乳腺癌细胞早期形成和生长的癌基因。乳腺癌中β联蛋白的异常表达可通过Cyclin D1来激活,并且Cyclin D1的过表达与雌激素受体阳性表达呈正相关。Cyclin D1在乳腺癌中的表达情况对乳腺癌的分期、分级、乳腺癌的治疗(包括放疗、化疗、靶向治疗)选择以及预后判断均有重要意义。
李维妙[8]2018年在《CREPT对非小细胞肺癌预后的影响及其相关机制的研究》文中研究表明背景:CREPT又被称为RPRD1B或C20ORF77,是新发现的候选癌基因,在多种肿瘤组织中表达,可能参与肿瘤的发生发展过程。然而CREPT对非小细胞肺癌预后的影响及相关生物学机制尚不明确。方法:本研究通过免疫组化,Western Blot及qRT-PCR等方法检测CREPT、Cyclin D3在非小细胞肺癌组织中的表达并分析了二者表达的相关性。统计分析CREPT的表达水平与342例NSCLC患者临床病理因素间的关系。在此基础上采用Kaplan-Meier生存分析和Cox风险模型分析探讨CREPT表达与非小细胞肺癌患者预后的关系。通过siRNA干扰A549细胞中CREPT的表达,并使用质粒转染Calu-1细胞构建CREPT高表达稳转细胞系,在体内和体外水平进一步研究CREPT对非小细胞肺癌细胞生物学功能的作用。结果:1.CREPT在342例NSCLC组织中的阳性表达率为91.5%,在配对癌旁组织中的阳性表达率为39.1%。统计分析显示CREPT在NSCLC组织及其正常组织中的表达差异性显着(p<0.01)。在NSCLC组织中,CREPT蛋白和mRNA的表达量均高于癌旁组织,差异有统计学意义(p<0.01)。2.CREPT在年龄(p=0.128)、性别(p=0.744)、吸烟史(p=0.811)、病理类型(p=0.826)及肿瘤位置(p=0.124)不同的患者组间表达水平无显着性差异,而CREPT在肿瘤大小(p=0.001)、分化程度(p=0.000)、淋巴结转移(p=0.008)及临床分期(p=0.000)不同的患者组间表达水平差异显着。3.在mRNA水平和蛋白水平,非小细胞肺癌组织中Cyclin D3的表达均高于癌旁组织。在NSCLC组织中,CREPT和Cyclin D3的表达密切相关(r_s=0.527,p=0.000);CREPT在不同分化程度、TNM分期及淋巴结转移等病理因素分组中均与Cyclin D3的表达密切相关(p<0.05)。qRT-PCR和Western Blot结果显示在CREPT高表达细胞中,Cyclin D3的蛋白和mRNA水平明显高于对照组(p<0.01);在干扰CREPT表达的NSCLC细胞中,Cyclin D3的蛋白和mRNA水平明显低于对照组(p<0.01)。3.Kaplan-Meier生存分析结果显示CREPT的表达水平越高,非小细胞肺癌患者的RFS(p=0.006)和OS(p=0.01)生存时间越短。通过分层分析显示在鳞癌患者中,CREPT高表达组患者较低表达组患者的生存时间明显缩短(p=0.03);在腺癌患者中,CREPT高表达组患者较低表达组患者的生存时间无明显差别(p=0.3)。在肿瘤直径>5cm的患者中,CREPT高表达与患者的不良预后密切相关(p=0.002);而在肿瘤直径≤5cm的患者中,CREPT高表达组患者较低表达组患者的生存时间无明显差别(p=0.7)。在pTNM III/IV患者中,CREPT高表达患者较低表达患者的生存时间明显缩短(p=0.005);而在pTNMI/II患者中,CREPT高表达组患者较低表达组患者的生存时间无明显差别(p=0.588)。在淋巴结出现转移(p=0.03)和未转移(p=0.01)的患者中,CREPT高表达均与患者的不良预后密切相关。多因素及单因素分析结果显示CREPT可能是影响NSCLC患者预后的独立危险因素(HR:1.223,p=0.013)。4.选取Calu-1细胞上调CREPT表达,CCK8实验显示CREPT高表达组的细胞生长速度明显加快(p<0.01)。流式细胞实验检测细胞分布显示CREPT高表达组较对照组相比,G1期细胞分布比例明显降低(pcDNA3.1-CREPT vs.pcDNA3.1;40.7±1.9%vs.54.5±1.1%),S期细胞分布比例明显增高(32.3±1.1%vs.21.4±1.4%)(p<0.05)。划痕实验和Transwell迁移实验显示上调CREPT表达增强Calu-1细胞的迁移能力(p<0.05)。在Transwell侵袭实验,CREPT高表达组的穿膜细胞数量较对照组增多(p<0.05)。5.选取A549细胞干扰CREPT表达,MTT实验显示CREPT高表达组较对照相比,细胞生长速度明显减慢(p<0.01)。流式细胞实验检测细胞分布显示干扰CREPT表达组与对照组相比,G1期细胞分布比例明显升高(Si-CREPTvs.NC;58.6±4.4%vs46.3±2.1%),S期细胞分布比例明显降低(Si-CREPTvs.NC;19.4±1.7%vs.27.6±3.3%)(p<0.05)。划痕实验和Transwell迁移实验显示干扰CREPT表达抑制A549细胞的迁移能力(p<0.05)。在Transwell侵袭实验,干扰CREPT表达组的穿膜细胞数量较对照组减少(p<0.05)。6.CREPT高表达组的裸鼠移植瘤肿瘤较对照组体积和重量明显增大,生长速度明显加快。在CREPT高表达组的移植瘤组织中,Cyclin D3和Ki67的表达水平较对照组明显升高(p<0.05)。结论:1.CREPT在非小细胞肺癌组织中较癌旁组织明显升高。CREPT的表达水平与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴结转移情况密切相关,提示CREPT在非小细胞肺癌的发生发展中发挥重要作用。2.在非小细胞肺癌组织及细胞中,CREPT的表达与Cyclin D3密切相关,提示CREPT可能通过Cyclin D3共同影响非小细胞肺癌的发生发展。3.CREPT的表达与非小细胞肺癌患者的不良预后密切相关,分层结果提示CREPT的表达与肿瘤体积较大的进展期鳞癌患者的预后生存时间密切相关,提示CREPT可以更加精确的预测患者预后。Cox回归分析结果提示CREPT可能是影响非小细胞肺癌患者预后的独立因素。4.体外实验中,CREPT通过调控细胞周期增强NSCLC细胞的增殖能力,同时可以增强NSCLC细胞的侵袭和转移能力,进一步印证CREPT可能影响NSCLC的肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移。5.体内实验中,CREPT高表达可以显着促进裸鼠移植瘤的生长,进一步证明CREPT可能通过Cyclin D3调控细胞周期增强NSCLC细胞的增殖能力促进肿瘤生长。
夏靖华, 李维妙, 王雪娇, 孙盈, 王武平[9]2016年在《CyclinD1与CyclinD3在非小细胞肺癌中的表达及意义》文中研究表明[目的]探讨细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)与细胞周期蛋白D3(Cyclin D3)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义。[方法]免疫组织化学法检测Cyclin D1、Cyclin D3蛋白在271例NSCLC及相应正常组织中的表达情况,分析其相关性及其与临床特征的关系。[结果 ]Cyclin D1和Cyclin D3定位于细胞质和细胞核中,癌组织与正常组织中阳性表达率差异显着(P均为0.000),同一患者癌组织中Cyclin D3表达高于Cyclin D1。Cyclin D1、Cyclin D3蛋白表达在不同性别、年龄、吸烟史、肿瘤大小及位置、病理分型组中均无统计学差异(P均>0.05)。在不同病理分级、临床TNM分期及淋巴结是否转移组中,Cyclin D1表达均无统计学差异(P>0.05),而Cyclin D3表达差异均显着(P<0.05)。在总NSCLC、腺癌、鳞癌中,Cyclin D1和Cyclin D3表达的相关性检验显示两者均具有正相关性,r分别为0.332、0.377、0.308(P均为0.000)。Cyclin D1低表达患者和高表达患者的中位生存时间接近,无统计学差异(P=0.264);Cyclin D3低表达患者的中位生存时间较高表达者明显延长,差异有统计学意义(P=0.001)。[结论 ]Cyclin D1和Cyclin D3表达可能与NSCLC发生相关,但在NSCLC发展与转移等恶性生物学行为中,Cyclin D3起重要作用,并可作为评估NSCLC恶性生物学行为及预后的参考指标。
曹玉华[10]2008年在《抗cyclin D1人源单链抗体AD9的原核表达、纯化及活性研究》文中提出细胞周期蛋白D1(cyclin D1)作为一种重要的周期蛋白,与肿瘤的发生、发展及患者的预后密切相关,并在多种肿瘤中存在着过度表达。通过反义核酸、导入抗体和降解肿瘤细胞内cyclin D1蛋白均能有效地阻碍肿瘤细胞的增殖。因此cyclin D1被认为是肿瘤基因治疗的重要靶点。单链抗体(single chain variable fragment, scFv)作为具有抗原结合活性的最小的抗体片段,具有分子量小,易于侵入实体瘤,免疫原性较小,能通过基因工程技术大量生产等特点,具有良好的应用前景。为了有效的灭活肿瘤细胞内过度活化的cyclin D1/CDK4的活性,抑制肿瘤细胞的增殖,本研究通过PCR方法对从人源噬菌体抗体库中筛选得到抗cyclin D1单链抗体基因wtAD9中的linker区的终止密码子实行了定点突变,并在原核细胞中进行了诱导表达、纯化,并通过ELISA、Western blot、竞争性抑制、亲和力测定、免疫荧光和免疫共沉淀等实验方法对AD9进行了活性表征。结果表明AD9能够特异性结合重组cyclin D1蛋白和肿瘤细胞内源性的cyclin D1蛋白,并具有较高的亲和力。本实验得到的结果对后续开展抗cyclin D1胞内抗体肿瘤基因治疗的研究奠定了基础。
参考文献：
[1]. 小檗碱抑制肿瘤细胞Cyclin D1相关信号通路的研究[D]. 骆叶. 北京中医药大学. 2007
[2]. 巨噬细胞源性TNF-α在肝前体细胞恶性转化中的作用及机制研究[D]. 陈程. 第二军医大学. 2015
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[4]. GPX7在甲状腺乳头状癌中的研究[D]. 刘利丹. 大连医科大学. 2017
[5]. p57~(KIP2)、cyclin D1、cyclin E在男性乳腺癌组织中的表达及其临床意义[J]. 罗祖强, 庄志泉, 董为松, 涂晓萌. 中国肿瘤临床. 2018
[6]. DEC1通过稳定cyclin E调节乳腺癌细胞增殖[D]. 毕海连. 大连理工大学. 2015
[7]. Cyclin D1与乳腺癌的相关研究[J]. 王竞伟, 邵先茹, 段秀庆. 医学综述. 2018
[8]. CREPT对非小细胞肺癌预后的影响及其相关机制的研究[D]. 李维妙. 中国人民解放军空军军医大学. 2018
[9]. CyclinD1与CyclinD3在非小细胞肺癌中的表达及意义[J]. 夏靖华, 李维妙, 王雪娇, 孙盈, 王武平. 肿瘤学杂志. 2016
[10]. 抗cyclin D1人源单链抗体AD9的原核表达、纯化及活性研究[D]. 曹玉华. 吉林大学. 2008
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