孙黎[1]2011年在《猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用》文中指出猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是当前影响养猪业发展的3种重要的病原。由于PPV、PRV、PCV-2单独感染或混合感染均能引起猪发病,造成母猪的繁殖障碍或(和)感染猪的免疫抑制,为其他病原的继发感染提供了便利,甚至会造成猪群中疫病的流行,使养殖效益蒙受损失。聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)具有快速、敏感、特异等优点,自发明以来在病原的特异性检测方面表现出明显的优势,在动物疫病诊断和病原检测上也得到广泛地应用,对疫病防控起到了重要的作用。由于当前养猪业中猪群中多种病原混合感染病例的增多,单一病原PCR检测方法也表现出自身的不足,需要对一种病料进行多次PCR检测,使得检测时间延长,耗费人力,成本也高。多重PCR不仅保持了普通PCR敏感性高和特异性强的优点,而且还具有一个PCR反应就同时检测多种病原,具有简便、快捷、灵敏等优点,能满足生产上同时对多种疾病进行快速诊断的要求。本研究基于前期对陕西省部分养殖企业猪群中病毒性病原的调查检测,发现常有PPV、PRV和PCV-2的单纯或混合感染,为此我们拟建立PPV、PRV和PCV-2检测的多重PCR方法,以期为生产中这3种病原的快速检测提供可用方法。本研究获得了以下结果:(1)根据GenBank中已经发表的PPV、PRV和PCV-2的全基因序列,利用DNAStar和Oligo6.0软件,针对病毒的保守性基因序列,分别设计了检测引物,通过对引物浓度、退火温度、PCR组分等条件的优化建立起鉴别PPV、PRV和PCV-2多重PCR方法,方法敏感性试验表明,PRV、PCV-2在多重PCR反应中的敏感性到达pg级,而PRV在多重PCR反应中的敏感性少了一个数量级,其最低检测量也达到了10pg级。以PCV-1、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、大肠埃希菌、PPV、PRV、PCV-2为模板分别进行多重PCR检测,结果表明只有PPV、PRV和PCV-2多重PCR及单个病毒的PCR均扩增出各自的特异性条带。(2)用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行病毒检测,从临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果来看,PCV-2在正常猪群中有一定比例的存在,同时在个别猪场也存在PRV和PCV-2双重感染的现象;从临床患病猪病料中进行检测发现,PRV和PCV-2混合感染较严重,并有PPV+PRV+PCV-2叁重感染发生;多重PCR检测结果与单项PCR检测结果的符合率达99%以上,说明建立的多重PCR检测方法可用于临床样品的检测,为这3种疫病的诊断提供依据。
聂昂[2]2016年在《猪精液中PCV_2、PRV、PPV荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要DNA病毒,都可以通过公猪精液传播,进行扩散和流行,严重威胁养猪业的健康发展。实时定量PCR方法已经广泛运用于疾病检测,但较少运用于猪精液中病毒的检测。本研究建立了检测PRV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法和PCV2、PPV的TaqMan荧光定量PCR方法和可以监测反应中有无抑制物的PCV2内标双TaqMan探针荧光定量PCR方法,旨在为检测猪精液中的PCV2、PRV、PPV提供简便灵敏、特异准确的定量PCR检测方法。1、PRV SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立根据GenBank上发表的PRV gH基因序列进行比对,找出保守区域,用Primer Premier 5.0设计特异性引物,构建重组质粒作标准品,建立SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。构建的方法的标准曲线线性关系良好：R2：0.998；E=103.854%；特异性强,检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪乙脑病毒和猪瘟病毒等只对阳性模板有特异性扩增曲线；灵敏度高,最低能够检测到27.9copies/μL重组质粒,在公猪精液中可检测的病毒最低稀释度为16TCID50/100μL,比PRV国标普通PCR法灵敏度高；重复性好,变异系数均低于3.5%。2、PCV2、PPV TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立根据PCV2 ORF2基因和PPV VP2基因设计特异性引物和TaqMan探针,建立了检测猪圆环病毒2型和猪细小病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,建立的标准曲线具有良好的线性关系,PCV2:R2=0.999, E=102.061%; PPV:R2=0.998, E=99.112%;特异性强,只对阳性模板特异性扩增；灵敏度高,PCV2最低可检测到10copies/μL重组质粒,在公猪精液中可检测的病毒最低稀释度为1TCID50/1mL,比PCV2国标普通PCR法灵敏度高；PPV最低可检测到的阳性质粒拷贝数为13.9copies/μL,高于常规PCR；且重复性好,变异系数均低于3%。3、PCV2内标TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立根据PCV2 ORF2基因设计特异性引物和TaqMan探针,利用DNA序列随机编排软件,设计内标TaqMan探针,通过搭桥法PCR扩增,构建内标重组质粒,优化共扩增荧光定量PCR体系,建立了检测猪圆环病毒2型的双TaqMan探针荧光定量PCR方法。该方法标准曲线具有良好的线性关系：R2：0.991,E=106.0%；特异性强,无相互交叉反应；灵敏度高,最低可检测到100 copies/μL重组质粒,在公猪精液中可检测的病毒最低稀释度为1TCID50/1mL,与单重TaqMan探针荧光定量PCR方法相同,比PCV2国标普通PCR法灵敏度高,且重复性良好。能够对荧光定量PCR扩增过程进行监测,提供了一种可以准确定量检测PCV2的方法,,避免了PCR抑制物对检测结果的影响,减少假阴性结果。4、公猪精液中PCV2.PRV和PPV的临床监测及应用运用构建的方法对15个猪场和公猪站的109份临床精液样品进行3种病毒的检测,检测出精液中病毒阳性结果的猪场达93.33%(14/15),在检测的109份猪精液中,有69.72%(76/109)的精液样品被检测出病毒单独或混合感染。在这些样品中,PCV2阳性率最高为51.37%(56/109),病毒载量为1.71×106～1.00×103cOpies/ml；PRV阳性率为18.35%(20/109),病毒载量为1.13×104～2.25×10.copies/ml；PPV阳性率为28.44%(31/109),病毒载量为1.84×10～8.44×102copies/ml。在不同混合感染类型中,PCV2与PRV混合感染率为9.17%(10/109),PCV2与PPV混合感染率为12.84%(14/109),PPV与PRV混合感染率为14.68%(16/109),PCV2.PRV和PPV叁种病毒混合感染率为8.26%(9/109),总的混合感染率为44.95%(49/109)。结果表明PCV2、 PRV和PPV在猪场公猪精液中带毒现象严重,应该引起重视。结论：本研究建立了有效检测猪精液中PCV2.PRV.PPV的荧光定量PCR检测方法,临床上可用于监测公猪精液载毒情况,为预测和控制疫病的流行提供技术支持。
吴淑芳[3]2005年在《人用猪源性生物制品中猪细小病毒检测方法的建立》文中研究指明为保证人用猪源性生物制品的的质量和安全性，有必要对潜在污染的相关病毒进行检测。本论文旨在建立猪细小病毒(PPV)的分子生物学及血清学检测方法，并对相关生物材料进行检测。 通过GeneBank查出所有已发表的PPV基因组序列，其它细小病毒科细小病毒属病毒及其它猪源性病毒基因组序列，利用DNAStar软件进行序列同源性分析，利用Primer primier5.0及Oligo6.0引物设计软件按照引物设计原则设计一对针对PPV的特异引物，能够扩增出一条531bp的特异片段，经方阵滴定法确定了PCR检测的最佳条件，经过寡核苷酸探针对PCR产物进行斑点杂交鉴定，并对特异片段连接pGEM-T-easy载体，通过对于重组质粒测序结果进行软件分析证明为PPV的特异片段。对已知TICD_(50)为10~(3.6)的病毒培养物提取模板以10倍等级倍比稀释，进行PCR扩增，以鉴定PCR方法的敏感性，我们建立的PCR方法所能检测的最小TCID_(50)值为0.398。通过对来自北京各大屠宰场的猪源性脏器及建立的PPV—猪肾组织混合感染PK-15细胞模型进行检测，进行PCR检测方法验证。 将以PK-15细胞为宿主大量培养的PPVAV7909株通过蔗糖密度梯度离心进行纯化后获得的PPV抗原，免疫五只6-8周龄雌性BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备单克隆抗体，经HAT、HT选择培养，有限稀释法克隆，经3-4次克隆，共获得7株稳定分泌抗体的单克隆细胞株，经过IFA、WB及HI等方法鉴定其特异性，发现此七株抗体并非针对PPV，而是针对PK-15细胞抗原的单克隆抗体，分析其原因，很可能是因为免疫和检测抗原纯度不够(混杂有PK-15细胞成
罗济冠[4]2012年在《牛细小病毒检测试剂的制备及快速检测方法的建立》文中提出牛细小病毒感染(Bovine parvovirus infection)是由牛细小病毒(Bovine parvovirus, BPV)引起牛的一种主要以母牛生殖机能障碍和犊牛消化道、呼吸道症状为特征的传染性疾病。1961年Abinanti和Warfield首次从健康犊牛粪便中分离出细小病毒。因其具有血细胞吸附性能,故又称血细胞吸附肠病毒(Hemadsorbing enteric, HADEN)。其后从暴发BPV感染的牛群中进行病毒的分离鉴定和血清学调查,结果表明在一些牛群中BPV感染发病率较高,亦有血清学调查报道目前该病属全球范围流行。目前,我国对牛细小病毒及其感染研究较少,我国牛群是否存在细小病毒感染,其感染和危害的程度如何,尚缺乏较为清晰的背景资料。实践中缺乏检测BPV感染的抗原与抗体试剂也制约了我国对该病的检测。因此研究开发出检测BPV感染特异性强、敏感性高的病原和血清检测试剂显得尤为重要。首先,本研究根据GenBanK上公布的BPV基因组序列,选取VP2基因高度保守区域作为靶基因,通过生物学软件设计筛选出1套LAMP引物。以BPV原代细胞培养物提取DNA为模板,建立BPV-LAMP检测方法,并对反应温度、时间、镁离子浓度等条件进行优化。结果表明,LAMP最佳反应温度是63℃,反应时间为60min,镁离子浓度为8mM/L,甜菜碱浓度为1.2mM/L, FIP和BIP的浓度分别为1.6μM/L, F3和B3的浓度分别为0.2μM/L,内外游引物浓度比为8：1。经过优化后初步建立的BPV-LAMP方法,最低可检测到9个拷贝的BPVDNA,是普通PCR方法敏感性的100倍。与可能存在交叉反应的病毒进行特异性试验,只有BPV扩增出特异性条带,而其他病毒(BRY、BVDV、BHV、GPV、PPV)均为阴性,无交叉反应。表明建立的BPV-LAMP方法具有良好的敏感性和特异性。此方法可根据反应后的扩增产物是否变浑浊判定结果,或加入SYBR Green I染料,在自然光或紫外光下判定结果。采用LAMP和PCR同时检测59份粪便样本,两种方法检测结果的符合率为94.9%。结果表明,建立的BPV-LAMP具有快速、敏感、特异、重复性好等优点,可用于临床BPV感染的检测。本研究根据GenBanK上公布的BPVVP2基因设计引物,以BPV-VR767株的DNA为模板,采用PCR扩增出2019bp的VP2基因,利用生物学软件对VP2基因序列进行抗原性预测分析,选择抗原性优势区域,将VP2基因分为叁段(34-263aa,300-451aa和484-633aa),分别克隆到原核表达载体pET-28a上,获得了重组质粒pET-28a-VP2-1、pET-28a-VP2-2和pET-28a-VP2-3,将其分别转化E.coli BL21或Rosetta,经IPTG诱导后,分别得到大小为30.2ku、22.7ku和22.9ku的目的蛋白。经Western-blot和间接ELISA分别检测叁个重组蛋白的反应原性；用纯化的叁个重组蛋白分别免疫昆明鼠,利用间接ELISA检测抗体产生的效价和特异性识别重组抗原的能力,评价其免疫原性。结果显示,Western-blot和间接ELISA证实BPV阳性血清均能够识别叁个重组蛋白,表明表达的叁个重组蛋白均具有抗原性；免疫小鼠中均产生特异性抗体,血清效价最高可达1.28×105,制备的叁种重组蛋白抗血清均可与BPV全病毒抗原发生特异性反应,说明制备的抗血清均可识别BPV抗原,叁个重组蛋白均具有良好的免疫原性。其中VP2-3(484-633aa)基因片段所表达的重组蛋白抗原性最好,表明分段表达并纯化的VP2蛋白具有病毒天然蛋白抗原反应活性。利用纯化后的重组VP2-3蛋白作为包被抗原,建立了检测BPV抗体的间接ELISA方法。通过试验确定了最佳反应条件,抗原的最适包被浓度为20μg/mL、血清最佳稀释倍数为1:40、血清最适作用时间为lh、最适封闭液为2.5%脱脂乳、酶标抗体最佳稀释倍数为1:5000、酶标抗体最适作用时间为Ih. OPD-H202最佳显色时间为10min。判定标准为OD490nm≥0.185者判为抗体阳性,否则判为抗体阴性。包被的重组抗原不与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒(BHV)、牛副流感病毒3型(BPI3)和牛布鲁氏菌病(B.abortus)的阳性血清发生交叉反应,表明建立的间接ELISA方法具有良好的特异性。批内重复试验和批间重复试验变异系数均小于10%,表明该方法具有良好的重复性。该方法与血凝抑制试验相比较,符合率为91.38%。用该方法对黑龙江省部分地区采集到的678份牛血清样品进行检测,结果有353份血清为阳性,总阳性率为52.1%。上述结果显示,建立的检测牛细小病毒抗体的间接ELISA方法可为该病的诊断与流行病学调查提供有效的技术手段。
陈光达[5]2012年在《猪六种病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用》文中研究表明猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型（PorcinecircovirusⅡ, PCV-2)、猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）、猪伪狂犬病病毒（porcinepseudorabies virus, PRV）、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原，给养猪业造成了严重的经济损失。由于六种病毒常呈混合感染，增加了临床快速诊断的难度。目前，常规的诊断方法如病毒分离、血清学诊断方法等存在着耗时长、敏感度低的缺陷，已不能满足现实临床诊断需要。多重PCR方法具有敏感性高且可以一次检测多种病原的优势，更适于混合感染的快速诊断。本研究针对六种病毒的保守基因设计了特异性引物，建立能够同时检测猪六种常见病毒感染的多重PCR方法并初步应用于临床样品的检测。研究取得如下结果：1.检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用合成了叁对特异性引物分别用于扩增CSFV C基因、PRRSV ORF6基因及JEV M-E基因。通过优化多重RT-PCR反应条件，建立了同时检测CSFV、PRRSV和JEV多重RT-PCR方法。多重RT-PCR特异性、敏感性及重复性试验结果显示，该检测方法敏感性达到pg级水平且特异性、重复性良好。使用该方法同时检测了52份临床病料，展示了该方法的应用前景。2.检测PCV-2、PPV和PRV叁种DNA病毒感染的多重PCR方法建立根据GenBank收录的PCV-2、PPV和PRV的基因组序列，设计3对引物,分别用于扩增PCV-2ORF2基因、PPV NS1基因和PRV gB基因。通过优化多重PCR反应条件，建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重PCR检测方法。特异性试验表明，该方法可分别从PCV-2、PPV和PRV病毒及叁种病毒混合物中扩增出大小分别为353bp、265bp、198bp的目的片段；敏感性试验表明，该多重PCR最低检测限达到pg级水平；应用该方法检测了39份临床病料，其中PCV-2阳性率达53.8%。3.猪六种常见病毒感染多重PCR检测方法的建立及应用在检测叁种DNA病毒多重PCR方法及检测叁种RNA病毒检测方法的基础上，通过优化多重PCR反应条件，建立了同时检测CSFV、PRRSV、JEV、PCV-2、PPV和PRV六种病毒感染的多重PCR方法，对该方法进行特异性、敏感性及重复性检测表明，该方法可一次性同时检出六种病毒，对其他病毒扩增结果呈阴性；最低检测限达到450pg且重复性良好。将该方法初步应用于39份临床样品检测，结果显示, PCV-2与PRRSV混合感染率达25.6%，推测PCV-2与PRRSV可能是引起母猪繁殖障碍的主要病原。
胡瑞丽[6]2016年在《基于LAMP和荧光定量PCR技术的猪圆环病毒2型和猪细小病毒检测试剂盒的研制》文中研究表明断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)是由猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)引起的一种重要疾病,严重发病地区死亡率高达40%以上,残存下来的病猪也极少康复。由于PCV2严重破坏猪的免疫系统,导致各种疫苗接种应答效果差,免疫失败,并且诱发其他疾病暴发。因此,PCV2感染的早期诊断和病猪的淘汰成为PMWS防治的重点。有必要开发出一种猪PCV2的定性、定量快速检测方法用于PMWS的防控。猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)引起的以初产母猪发生流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等为特征的猪的主要繁殖障碍性疾病之一,此外,PPV能增强猪圆环病毒引起的断奶仔猪多系统衰竭综合征。PPV分布广泛,通过水源、食物、交配、胎盘等途径感染猪,并能在外界环境长时间存活且对大部分消毒剂不敏感,难于防治,给养猪业带来巨大危害。所以非常有必要建立一种快速、特异并适合在基层推广的检测方法。本实验旨在建立PCV2环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和荧光定量PCR检测方法以及PPV环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,研制PCV2和PPV的LAMP现场可视化快速定性检测试剂盒和PCV2荧光定量PCR定量检测试剂盒,并对反应体系和参数进行优化以及对制备工艺进行研究。主要内容及结果如下:1、猪细小病毒(PPV)LAMP可视化快速检测方法建立及试剂盒的研制本研究旨在建立有效的针对猪细小病毒(PPV)的诊断技术及开发试剂盒。建立一种快速、敏感、特异的检测猪细小病毒(PPV)的环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪细小病毒提供准确可靠工具。根据Gen Bank公布的PPV序列,利用Primer Explorer V3在其保守序列区域设计了LAMP引物,通过对引物比例、反应温度、反应时间、PCR各组分等条件的优化,建立了对PPV病毒DNA进行特异扩增的LAMP检测方法,研制LAMP检测试剂盒,并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等指标进行评价。该方法在60℃恒温下作用50 min,PPV病毒DNA获得了高效率的特异性扩增;用该检测试剂盒对临床样品进行检测,LAMP检测对PPV的检测限为10拷贝/μL,而常规PCR检测法的检测限为1 000拷贝/μL,表明LAMP检测法灵敏度高。该检测法不会与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪瘟病毒(CSFV)发生交叉反应。用该检测试剂盒对1 100个临床样品进行检测,320个样品被检测出为阳性样品。稳定性试验表明该试剂盒可以耐受至少40次的反复冻融。结果显示,本实验建立的方法和研制的猪细小病毒检测试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性好,为猪细小病毒的检测和流行病学的调查提供了一种简单快速的诊断方法。2、猪圆环病毒2型(PCV2)LAMP可视化快速检测方法建立及试剂盒的研制本研究旨在建立有效的针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及开发试剂盒。建立一种快速、敏感、特异的检测猪圆环病毒2型(PCV2)环介导等温扩增(LAMP)方法,为诊断猪圆环病毒2型提供准确可靠工具。根据Gen Bank公布的PCV2序列,利用Primer Explorer V3在其保守序列区域设计了LAMP引物,通过对引物比例、反应温度、反应时间、PCR各组分等条件的优化,建立了对PCV2病毒DNA进行特异扩增的LAMP检测方法,研制LAMP检测试剂盒,并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等性能进行评价。该方法在59℃恒温下作用45 min,PCV2病毒DNA获得了高效率的特异性扩增。用该检测试剂盒对临床样品进行检测,LAMP检测对PCV2的检测限为10拷贝/μL,而常规PCR检测法的检测限为1 000拷贝/μL,表明该试剂盒灵敏度高。该检测试剂盒不会与猪瘟病毒(CSFV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。用研制的试剂盒对1 100个临床样品进行检测,950个样品被检测出为阳性样品。稳定性试验表明该试剂盒可以耐受至少40次的反复冻融。成功建立了特异性检测PCV2的LAMP方法,试剂盒具有良好的特异性、重复性和敏感性,可用于临床PCV2感染的快速检测及分子流行病学调查。3、猪圆环病毒2型(PCV2)Taq Man荧光定量PCR检测方法建立及试剂盒的研制本研究旨在建立有效的针对猪圆环病毒2型(PCV2)的诊断技术及开发试剂盒。根据Gen Bank公布的PCV2序列,对PCV2的ORF2基因设计相应的特异性引物和探针,通过体系优化,以重组质粒建立10倍系列稀释的质粒标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了对PCV2病毒DNA进行特异扩增的荧光定量PCR检测方法,研制荧光定量PCR检测试剂盒,并对试剂盒敏感性、特异性、重复性和保存期等性能进行评价。该检测试剂盒循环阈值(Ct)与标准DNA模板在101-107拷贝/μL浓度范围内具有极好的线性关系,相关系数为0.9999。本实验重复性好,批内实验中Ct值的变异系数在0.59%到1.05%之间,批间实验的Ct值变异系数为1.9%到4.2%。本实验研制的检测试剂盒与猪瘟病毒(CSFV)、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)不发生交叉反应,检测极限和定量极限分别为10和100拷贝数。用该试剂盒对1000个临床样品进行检测,结果710个被检测为阳性。结果显示,该方法和所研制的猪圆环病毒2型检测试剂盒灵敏度高,特异性强,稳定性好,实现了对PCV2早期诊断和感染程度定量分析检测,为PCV2的防制和疫苗研制奠定了一定基础。
孔苗苗[7]2016年在《PPV和PRV诊断方法的建立及PPV-PRV二联灭活疫苗免疫效力试验》文中研究表明猪细小病毒病和伪狂犬病都是引起母猪繁殖障碍的主要疾病。猪细小病毒病是由猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)引起的,猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的。这两种疾病在世界范围内广泛分布,给养猪业造成巨大的经济损失。为了有效预防这两种疾病,本试验建立了检测PPV和PRV的TaqMan荧光定量PCR方法以及检测PPV抗体的ELISA方法,并利用猪细小病毒BQ-C株和猪伪狂犬病毒ΔgE株,试制了PPV-PRV二联灭活疫苗,对试制的疫苗免疫效力进行了初步试验。本研究针对PPV VP2基因和PRV gB基因序列,建立了检测PPV和PRV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法敏感性较高,特异性较好,批间、批内变异系数均小于3%,其中针对PPV VP2基因的荧光定量PCR方法可检测到13拷贝的初始模板,针对PRV gB基因的荧光定量PCR方法可检测到167拷贝的初始模板,敏感性是常规PCR方法的100倍。本研究利用杆状病毒载体表达系统表达VP2蛋白(rVP2)作为抗原,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。经条件优化其最佳抗原包被浓度为10μg/mL,最佳酶标二抗稀释倍数为10000倍,最佳包被液为0.01mol/L碳酸盐缓冲液(PH=9.6),最佳封闭液为5%的脱脂乳-PBS,最佳封闭时间为90 min,最佳血清稀释倍数为200倍,其阳性Cut-off值为0.3。用该方法与商品化ELISA试剂盒分别检测360份临床血清样品,结果表明建立的ELISA方法检测PPV抗体阳性率为75.00%,商业化ELISA试剂盒检测PPV抗体阳性率为75.83%,二者符合率为94.17%。本研究利用本实验室保存的PPV-BQ-C毒株和rPRV-ΔgE毒株制备病毒液作为该二联疫苗的抗原,利用β-丙内酯将病毒液灭活,将上述灭活的两种病毒液以PPV-BQ-C︰rPRV-ΔgE=2︰1的比例混合均匀,以抗原︰佐剂=8.5︰1.5的比例乳化制成疫苗。对疫苗进行初步检验后免疫后备母猪,二联疫苗于免疫后四周PPV HI抗体水平达到高峰,PPV-PRV二联灭活疫苗组HI抗体水平为1﹕776,PPV商业灭活疫苗组HI抗体水平为1︰445,免疫后PPV-PRV二联灭活疫苗组PRV中和抗体水平最高为1︰59.46,PRV商业苗组PRV中和抗体水平最高为1︰32.70。为了研究PPV-PRV二联灭活疫苗的免疫保护效力,对免疫后的后备母猪分别用PPV和PRV强毒攻击,通过检测母猪各组织中的病毒载量来评价疫苗的保护作用。结果显示攻毒后4周,攻PPV强毒后PPV-PRV二联苗组各组织中均检测不到病毒;攻PRV强毒的各组中,PPV-PRV二联苗组在肝脏中能检测到病毒,表明该二联灭活疫苗可抵抗PPV强毒攻击,但不能完全抵抗PRV强毒攻击。
蔺芳[8]2009年在《多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用》文中认为1.以猪伪狂犬病毒(PRV)的基因组序列作为参考,设计了应用在同一个PCR反应体系的3对特异性扩增引物,建立了鉴别诊断PRV疫苗株和流行毒株的多重PCR方法(Multiplex PCR,Multi-PCR)。在相同的PCR扩增条件下,以PRV DNA作为模版,同时加入3对特异性引物,可同时扩增不同长度的PRV gB,gE和Tk基因序片段,其大小分别为427bp(gB),298bp(gE)和208bp(Tk)。利用建立的Multi-PCR方法,对商品化的四种不同基因缺失的PRV疫苗进行检测,其扩增结果与疫苗的基因缺失背景一致。试验结果表明,Multi-PCR可同时区分PRV流行毒株和疫苗毒株,且具有良好的敏感性和特异性,最低检出DNA含量为10-5(13.75pg/μl)。该方法可应用在PRV临床诊断和流行病学调查研究工作中。2.根据GenBank上猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)的已发表序列分别设计并合成4对特异性扩增引物建立PRV,PCV2,PPV单项PCR检测方法。分别扩增出预期的657bp(PPV),490bp(PCV2),372 bp(PRV-gB)和298bp(PRV-gE)片段,在优化单项PCR反应条件基础上建立了PRV-PCV2-PPV复合PCR检测方法,为预防和控制上述3种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法,PPV、PCV2、PRV-gB、PRV-gE检测敏感性分别为10-5(17.4pg/μl),10-5(14.1pg/μl),10-5(11.7pg/μl),10-5(11.7pg/μl)。3.为促进PCR反应中猪伪狂犬病毒gB基因的扩增效率,研制了含有二甲基亚砜(DMSO)成份的针对gB基因的PCR缓冲液。结果表明:在DMSO作用下,增强了gB基因扩增特异性,4%～10%的DMSO可以获得最佳扩增效果。
戎伟[9]2004年在《猪细小病毒检测方法的建立》文中研究表明本试验通过PK-15细胞增殖猪细小病毒(PPV)，待细胞出现80％病变时，收获病毒细胞培养物，经反复冻融、超声波处理后，利用聚乙二醇6000浓缩病毒，葡聚糖G-200凝胶过滤的方法纯化病毒，得到了纯度较高的PPV。将纯化的PPV分别免疫家兔和豚鼠，制备了兔抗及豚鼠抗PPV的高免血清。经饱和硫酸铵沉淀、葡聚糖G-25脱盐后，获得了羊抗兔、兔抗及豚鼠抗PPV免疫球蛋白IgG的粗提物，DEAE-32离子交换层析纯化了羊抗兔IgG。以过碘酸钠法和柠檬酸叁钠一鞣酸混合还原法分别制备了高纯度的羊抗兔辣根过氧化物酶标记抗体及胶体金标记抗体。 依据方阵测定法，通过对兔抗PPV IgG、豚鼠抗PPV IgG及标记抗体的最佳使用浓度的确定，建立了双夹心ELISA、Dot-ELISA和免疫金银染色法(IGSS)3种用于检测PPV抗原的免疫学方法。经重复性试验、特异性阻断及交叉试验，结果表明：3种检测方法具有特异性强、重复性高的优点。通过敏感性试验及其与血凝试验(HAT)的比较，结果发现Dot-ELISA检测PPV的敏感性较低，PPV最低检出量为0.1病毒血凝(HA)单位，双夹心ELISA和IGSS敏感性较高，PPV最低检出量能达到0.05HA单位。 根据编码猪细小病毒结构蛋白VP2基因序列，合成了一对寡核苷酸引物，分别利用酚-氯仿一次抽提法、酚-氯仿二次抽提法及煮沸法制备模板DNA，减少病毒核酸的提取时间、费用，成功地从猪细小病毒(PPV)感染的细胞中扩增出预期的158bp片段，经EcoR Ⅰ酶切鉴定，证实了该扩增片段的特异性。经敏感性试验测定，PCR的最低检出量为0.008HA单位。由于PPV基因组结构为单股负链DNA病毒，且扩增片段仅有158bp，本试验省去了模板的预变性，直接进入PCR循环，其扩增结果与原来基本一致，通过缩短PCR循环中变性、退火及聚合的时间，同样也扩增出了特异性条带，但经敏感性测定比原来减少了一个病毒滴度。 应用本试验建立的4种不同的检测方法及HAT对26例临床样本进行检测，阳性检出率由高到低的顺序依次为：PCR最高，其次是双夹心ELISA和IGSS，最后为间接Dot-ELISA。10例PPV感染阳性病例，其中6例胎盘坐高小于16厘米，双夹心ELISA、IGSS和PCR检测结果全部为阳性，间接Dot-ELISA能检测出5例、HAT能检测出3例；其余4例只有PCR才能检测到病毒的存在。
何玉[10]2015年在《猪细小病毒2型分子流行病学调查、结构蛋白免疫原性分析和抗体检测ELISA方法的建立》文中认为猪细小病毒(PPV)是细小病毒科中以猪为宿主的一类能导致猪群流产、腹泻以及呼吸道等症状的病毒的统称。近年来国内外陆续报道出PPV2等多种新型的猪细小病毒,且以PPV2为代表的新型猪细小病毒在猪群中的阳性率居高不下,给世界养猪业带来重大的威胁。本研究利用PCR方法调查了 PPV2等新型细小病毒在我国不同地区的流行情况,并对PPV2 ORF2基因进行了测序分析;利用原核的大肠杆菌经典表达系统和真核的昆虫细胞/杆状病毒表达系统同时表达了 PPV2VP蛋白主要抗原表位区,并对其免疫原性进行了研究;同时还利用原核表达的PPV2VPb蛋白建立间接ELISA检测方法,为PPV2的血清学检测提供了支持。具体研究内容如下:1.新型猪细小病毒的检测及猪细小病毒2型ORF2基因的序列分析本研究对2013-2014年本实验室采集保存的253份组织样品进行了 PCR检测;并对PPV2进行ORF2基因的扩增与测序。结果显示PPV2、PPV3、PPV4和PBoV 的检出率分别为 54.5%、11.1%、8.7%和 9.9%,且 PPV2、PPV3、PPV4 存在着一定的季节性流行;对PPV2基因测序显示,不同地区来源的PPV2 ORF2基因之间的同源性为92.6%-100%,对其进行进化分析,结果显示,PPV2和PPV3以及人细小病毒4、5型一同归入PARV4-like virus。本研究为进一步调查新型猪细小病毒流行病学以及PPV2的遗传进化分析奠定了基础。2.猪细小病毒2型(PPV2)VP蛋白主要抗原表位区的原核表达及其免疫特性研究本实验利用原核表达系统分别表达了 PPV2 ORF2 VP蛋白的第172-412(VPa基因514-1236)位和第713-924(VPb基因,2137-2772)位氨基酸的两段截短蛋白;纯化的蛋白制备成亚单位疫苗免疫小鼠,通过测定抗体效价判定两组蛋白的免疫原性。结果显示,两组蛋白在大肠杆菌中均成功获得表达;小鼠免疫实验表明,两组蛋白均能诱导小鼠产生特异性抗体,但VPb蛋白免疫小鼠产生的抗体效价明显高于VPa,表明VPb蛋白的免疫原性优于VPa蛋白。本实验初步探讨了两种蛋白的免疫原性,为建立PPV2血清学检测方法奠定了基础。3.猪细小病毒2型(PPV2)VP蛋白主要抗原表位区的真核表达及其免疫特性研究本实验将 PPV2 ORF2 的 VPa 基因(514-1236)和 VPb 基因(2137-2772)克隆入转移载体pFastBacTMDual,转化DH10Bac后进行重组,形成重组Bacmid,提取重组Bacmid转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,经Western-blot方法鉴定重组蛋白VPa和VPb在Sf9中的表达。表达的蛋白制备成亚单位疫苗免疫小鼠,通过测定抗体效价判定两组蛋白的免疫原性。结果显示,两组蛋白均成功获得表达;小鼠免疫实验表明,经叁次免疫后VPb蛋白免疫小鼠产生了较高的抗体效价,而VPa蛋白免疫小鼠产生的抗体效价很低,表明VPb蛋白的免疫原性优于VPa蛋白。本研究为进一步研究VPa蛋白和VPb蛋白的免疫特性以及PPV2VP亚单位疫苗的研发奠定了基础。4.猪细小病毒2型间接ELISA抗体检测方法的建立和应用本研究选择了原核表达的VPb蛋白为包被抗原建立了检测PPV2抗体的间接ELISA方法,优化后反应条件为:抗原包被浓度为0.8μg/mL,血清的最佳稀释度为1:100,酶标二抗的工作浓度为1:20 000,检测的临界值为0.4005(OD≥ 0.4005判定为阳性)。特异性试验证明,与猪细小病毒1型(PPV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪口蹄疫病毒(FMDV)血清抗体无交叉反应,批内、批间重复性实验变异系数均小于10%。应用此方法对江苏地区的480份临床血清样本进行了检测,PPV2抗体阳性率为31%。该结果表明,以此pET-32a-VPb蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可以用于临床血清PPV2抗体的检测。本研究为临床新型细小病毒的流行病学研究奠定了理论基础,同时为PPV2的遗传进化分析提供了支持。建立的间接ELISA检测方法,为PPV2血清学检测方法的研究奠定了基础。
参考文献：
[1]. 猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用[D]. 孙黎. 西北农林科技大学. 2011
[2]. 猪精液中PCV_2、PRV、PPV荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 聂昂. 湖南农业大学. 2016
[3]. 人用猪源性生物制品中猪细小病毒检测方法的建立[D]. 吴淑芳. 中国药品生物制品检定所. 2005
[4]. 牛细小病毒检测试剂的制备及快速检测方法的建立[D]. 罗济冠. 东北农业大学. 2012
[5]. 猪六种病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 陈光达. 西北农林科技大学. 2012
[6]. 基于LAMP和荧光定量PCR技术的猪圆环病毒2型和猪细小病毒检测试剂盒的研制[D]. 胡瑞丽. 上海师范大学. 2016
[7]. PPV和PRV诊断方法的建立及PPV-PRV二联灭活疫苗免疫效力试验[D]. 孔苗苗. 中国农业科学院. 2016
[8]. 多重PCR检测猪伪狂犬、细小病毒和猪圆环病毒2型方法的建立和应用[D]. 蔺芳. 甘肃农业大学. 2009
[9]. 猪细小病毒检测方法的建立[D]. 戎伟. 河北农业大学. 2004
[10]. 猪细小病毒2型分子流行病学调查、结构蛋白免疫原性分析和抗体检测ELISA方法的建立[D]. 何玉. 南京农业大学. 2015
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