摘要|：目的：通过对Pin1和CyclinD1在鼻腔的正常上皮、鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤（NIP）、鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有中到重度不典型增生以及鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有恶变组织中表达的比较，探讨它们在NIP的发生及恶变过程中的作用及其之间的关系，从而对临床治疗起到启发和指导的作用。方法：实验组：收集佳木斯大学附属第一医院自2000年4月至2013年10月间手术和活检的NIP病例40例，NIP伴中到重度不典型增生（伴不典型增生组）25例，NIP伴有癌变（恶变组）16例标本，共计81例。对照组：收集非NIP以及排除鼻腔其他肿瘤患者的下鼻甲或中鼻甲粘膜标本9例。结果：对照组和各个病变组的Pin1阳性表达数量，经Fisher确切概率检验具有统计学意义（P<0.05）；NIP、NIP伴中重度不典型增生组以及伴有恶变组中的Pin1蛋白阳性表达比例及表达的程度逐级增高。CyclinD1和Pin1两种蛋白在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤的表达经过spearman秩相关检验：（P<0.05），二者在合并中重度不典型增生的和合并癌变的鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤中的表达经spearman秩相关检验：rs=0.533，P<0.01，二者之间呈正相关。结论：Pin1和CyclinD1在鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤、鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴中重度不典型增生以及其伴癌变的组织中表达逐渐增强，具有显著的正相关性，提示这两种蛋白可能在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤的恶变过程中起到较为关键的作用，Pin1的表达对CyclinD1蛋白表达的上调，可能是鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤恶变的重要机制。
关键词：鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤；Pin1；CyclinD1；免疫组化
鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤（IP）是鼻腔鼻窦的良性肿瘤，其发病率为0.2～1.5，每100000人每年发病率为0.5%～4%。起源于鼻窦上皮的侧鼻壁或上颌窦。有男性占优势，男女比例为3.4∶1。虽然IP的形态学特征和临床特征已得到很好的描述，但其病因和危险因素仍存在争议[1]。其相关的因素，包括人乳头瘤病毒（HPV）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）、吸烟、职业、环境和工业暴露、细胞周期相关蛋白、血管生成因子和慢性炎症将被讨论。根据世界卫生组织（WHO），鼻腔鼻窦乳头状瘤分为三种不同的组织病理学类型：外生性乳头状瘤（蕈状、间隔和鳞状乳头状瘤）、倒置（乳头状乳头状瘤）和嗜酸性细胞乳头状瘤（柱状细胞和柱状乳头状瘤）。IP是这些组中最常见的，并且通常表现为一个大的息肉状肿块，具有灰色的颜色和不均匀的多结节表面。组织学上，肿瘤上皮增厚，基底层完整，倒置到结缔组织中。肿瘤上皮由高度分化的柱状或纤毛的呼吸上皮组成，鳞状上皮可分化。呼吸道上皮的上皮化生是乳头状瘤组织发生的第一步，发生于假复层柱状纤毛上皮和扁平鳞状上皮之间的中间阶段，IP表现出明显的倒置或内生生长。角化的移行细胞。上皮然后进行鳞状上皮成熟，并反转成基质，具有明显的基底膜，将上皮与下层结缔组织基质分隔开来。表面角质化和颗粒细胞层已被描述，但不常见。IP的组织病理学特征与肿瘤的临床行为密切相关，炎性浸润通常表现为良性、低级别病变[2]。本实验通过对两种蛋白Pin1和CyclinD1在鼻腔的正常上皮、鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤（NIP）、鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有中到重度不典型增生以及鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有恶变组织中定位地表达的比较，探讨它们在NIP的发生及恶变过程中的可能的作用及其之间的关系。
1、资料与方法：
1.1材料
实验组：收集佳木斯大学附属第一医院的病理科自2000年4月至2013年10月期间住院并手术治疗确诊的保存有完整临床资料的鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤组织存档蜡块81例，选择其中排除其他鼻腔鼻窦疾病的NIP患者40例，男性22例，女性18例，年龄从45-77岁，平均60.31±2.38岁，为NIP组。伴有中重度不典型增生的NIP患者25例，男性16例，女性9例，年龄从39-74岁，平均年龄54.12±2.62岁，NIP伴有癌变（恶变组）患者16例，男性9例，女性7例，年龄从44-79岁，平均59.28±3.54岁。对照组：收集非NIP或排除鼻腔其他肿瘤患者的下鼻甲或中鼻甲粘膜标本9例，男性6例，女性3例，年龄从28-69岁，平均年龄48.23±3.42岁。对照组标本经过4%甲醛固定，进行石蜡包埋制成蜡块，并制做成4μm厚的切片。以上所有标本的收集均获得患者知情同意，并经过佳木斯大学伦理学委员会审查通过。
1.2主要试剂及来源
浓缩型图抗人Pin1多克隆抗体（SC-15340）购自美SantaCruz公司。浓缩型兔抗人CyclinD1单克隆抗体（ZA-0101）、即用型S-P超敏免疫组化试剂盒（SP-900）、DAB显色试剂盒（ZLI-9032）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。二甲苯、苏木素、梯度酒精等试剂。温箱、冰箱、Olympus光学显微镜、显微图像采集系统等。
1.3 实验方法
标本经常规甲醛固定，石蜡包埋，常规切片，厚度约4微米。将每例蜡块的一张切片做HE染色以验证原病理诊断。应用免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（S-P）法，实验中以PBS代替一抗作为阴性对照，以Pin1和CyclinD1阳性切片作为阳性对照，显微镜下观察结果。
1.4结果判定
（1）Pin1在正常组织中一般呈阴性表达，或在细胞核中弱阳性表达，表达时细胞核和细胞质均着色。将阳性细胞的染色程度（A）分为几个等级：无染色0分；细胞内可见蛋黄色颗粒，为1分；可见棕黄色的，为2分；呈棕褐色或棕红色的，为3分。500个细胞染色阳性细胞数分级为：阳性细胞比率（B）0%为0分；1%-33%者为1分；阳性率达34%-66%者为2分；≥67%者为3分。A*B≤2分的为阴性；≥3分的为阳性表达。
（2）CyclinD1将肿瘤细胞胞核中出现淡黄色或棕黄色颗粒的定为阳性细胞，在盲法下，每个切片随机选取观察5个视野，取平均值进行分析，阳性细胞率>10%的为阳性。
1.5 统计学处理
采用SPSS 17.0软件完成，计数资料采用χ2检验。不满足χ2检验条件的用Fisher精确检验法。两蛋白间相关性用Spearman秩相关分析法，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。
2、实验结果
2.1 Pin1在对照组和各个病变组中的表达情况
Pin1在正常鼻腔鼻窦粘膜组织中不显色或仅有微弱的显色，阳性细胞染色程度的等级基本为1分，显色细胞比率约为13%；在NIP、NIP伴有中到重度不典型增生和NIP伴癌变组织中，Pin1的阳性细胞染色程度等级（A）分别为1-2分，2-3分和2-3分。在12.50%的鼻腔-鼻窦乳头状瘤组（5例）、44.00%的伴中、重度不典型增生组（11例）和87.50%的恶变组（14例）中显示阳性表达。对照组和各个病变组的Pin1阳性表达数量，经Fisher确切概率检验具有统计学意义（P<0.05见表A）；NIP、NIP伴中重度不典型增生组以及伴有恶变组中的Pin1蛋白阳性表达比例及表达的程度逐级增高，经过多样本χ2检验三个病变组中Pin1蛋白表达的阳性率不相等（α=0.05，P<0.05），通过χ2分割检验发现各组之间差异具有显著性（α’=0.0125，P<0.0125），见表A。
表a APin1和CyclinD1在对照组和所有病变组总和的表达情况
2.2 CyclinD1在对照组和各个病变组中的表达情况
CyclinD1在鼻腔和鼻窦粘膜未发生病变时不表达，在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤和其伴有中重度不典型增生以及伴有癌变的组织中，随诊病变程度的进展各组之间染色逐渐加深，在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤中的显色为淡黄色，在其伴由中重度不典型增生的组织中显色为棕黄色，伴恶变的则为棕褐色；着色范围也随着病变的进展而变大，除胞核着色，细胞质也着色。其中6例鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤（15.0%）呈现CyclinD1阳性表达、10例伴不典型增生组（40.0%）及13例恶变组（81.5%）呈阳性表达。正常组与病变组的表达经Fisher确切概率检验具有统计学意义（P<0.05见表A）。经多样本率χ2检验在各个病变组中CyclinD1表达的阳性率不等。，经χ2分割法检验鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤组和伴有不典型增生组之间表达不具有显著性（α’=0.0125，P=0.023>0.0125），其余各组之间差异具有显著性（α’=0。0125，P>0.0125），见表B。
表C Pin1和CyclinD1在病变组表达情况的相关性
3、实验结论
3.1通过本实验分析
Pin1在正常组织中不表达，在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤中出现阳性表达，在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有中重度不典型增生以及伴有恶变时表达的程度更高、阳性率也更高，表达的程度和阳性率随着病变程度的发展而增高。
3.2通过本实验分析
CyclinD1在正常组织中不表达，在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤中出现阳性表达，在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有中重度不典型增生的组织中的表达的强度更高，但与前者比较差异不算显著，但在伴有恶变时表达的程度明显更高，表达的阳性率也更高，表达的程度和阳性率随着病变程度的发展而增高。
3.3 Pin1与CyclinD1在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤组织及其伴有中重度不典型增生和恶变的组织的表达中存在正相关的关系。
4.讨论
Pin1基因是第一个被发现的在酵母和人类细胞的有丝分裂中所必需的肽基脯氨酰顺反异构酶，Pin1蛋白可特异地催化磷酸化后的丝/苏-脯氨酸间肽键发生顺反异构，从而诱导蛋白质构象及功能发生改变[3]，通过研究2 041个人类肿瘤样本和609个正常组织的样本发现：Pin1在60种不同肿瘤中的38种中呈高表达，这些肿瘤包含了大部分常见的肿瘤，如前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌等。Cyclin D1基因是一种致癌基因，对细胞周期的调控起重要作用，研究表明Cyclin D1在多种肿瘤组织中过度表达。Cyclin D1是Pin1的重要靶基因之一。Pin1可通过多种途径使Cyclin D1表达增加，包括通过Ras/NeuJun信号转导通路、wnt/β-catenin信号转导通路和NF-κB信号转导通路诱导Cyclin D1转录的增加，通过直接结合Cyclin D1减少其分解，增加Cyclin D1的稳定性及其在核内的聚积，从而调节细胞周期。NIP 镜下多表现为分化好的、细胞层次为多层的上皮源性肿瘤细胞，呈巢团状或条索状向黏膜下推进性、内翻性生长，Katori 等发现 P21、P53 蛋白的表达阳性率在 NIP 中均有所增高。内翻性乳头状瘤是一种罕见的鼻腔鼻窦肿瘤，三特点使肿瘤的其他鼻腔鼻窦肿瘤非常不同：局部破坏相对强劲的潜力，复发率高，与癌性演变的风险。治疗的选择是手术，经鼻内镜或外部的方法，根据扩展和肿瘤特征。跟进是关键，诊断局部复发，这往往是早期治疗的关键。该病的严重性在于其与癌的关联，这可能在一开始就确诊或复发随访。它在诊断复发使早期治疗中非常重要，尤其是在相关的癌或恶性案件。该项研究讨论了Pin1与CyclinD1两种蛋白在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤、鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤伴有中重度不典型增生以及其伴有恶变的组织的表达，探讨了该两种蛋白在上述组织中表达的相关性。这在国内文献中尚未见报道。实验的结果证明这两种蛋白在鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤组织中表达并且随着其向恶变方向发展的过程，表达的强度增高。推测Pin1的阳性表达可能时鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤的恶变的过程的标志检验物，其表达上调CyclinD1的表达，可能是鼻腔-鼻窦内翻性乳头状瘤恶变的重要机制。
参考文献：
[1]Govindaraj S.，Wang H. Does human papilloma virus play a role in sinonasal inverted papilloma?Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg.?2014；22：47–51.
[2]Wang MJ，Noel JE.World J Otorhinolaryngol Head Neck Surg. 2016 Dec 21；3（1）：54-58. doi：10.1016/j.wjorl.2016.11.004. eCollection 2017 Mar. Review.
[3]ATABAY KD，YILDIZ MT，AVSAR T，et al.Knockdown of Pin1leads to reduced angiogenic potential and tumorigenicity in glioblastoma cells[J].Oncol Lett，2015，10（4）：2385-2389.DOI：10.3892/ol.2015.3512.
论文作者:郑鹏举,李江华,刘杰,路通
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第30期
论文发表时间:2018/12/3
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