（1成都市龙泉驿区第一人民医院 四川 成都 610100）（2四川大学华西医院龙泉医院 四川 成都 610100）
【摘要】目的：探讨分析高通量检测技术对假肥大型肌营养不良分子诊断结果。方法：通过选取2017年1月至2018年4月期间的100例临床诊断，疑似为假肥大型肌营养不良患者，通过借助CNV plex（高通量）检测技术，针对致病诱因拷贝数变异研究，并且借助靶向获得及高通量检测技术的测序，完成致病基因单核苷酸的细胞水平变异检测，实现精准分子诊断。结果：经研究发现高通量检测技术，监测发现其中85例患者，都存在假肥大型营养不良分子基因致病变异，其中主要包括了60例不同大小外显子缺失重复，8例单核苷酸水平小缺失及重复情况，7例无义变异，以及分别2例剪接位点变异、错义变异情况。结论：通过对假肥大型肌营养不良因素进行临床诊断，具有极为重要的临床确诊意义，借助高通量监测技术能够实现对不同类型致病基因变异完成检测，达到对患者及时确诊的临床诊断意义。
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【关键词】高通量监测技术；假肥大型营养不良分子；基因突变
【中图分类号】R746.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）25-0038-02
The results of high - throughput assay on the molecular diagnosis of dystrophy in large muscle of false fertilizer were observed
Wang Xiantao1,Liu Jing2 (Communication author).1 The first people's Hospital of Chengdu Longquanyi District; 2 Sichuan University West China Hospital Longquan hospital Sichuan Chengdu 610100, China
【Abstract】Objective To explore and analyze the diagnostic results of high-throughput detection technology for large muscle dystrophy with fake fertilizer. Methods By choosing between January 2017 and April 2017, during the period of 100 cases of clinical diagnosis of suspected false fat big, muscular dystrophy patients by using CNV place (high throughput) detection technology, study pathogenic cause copy number variation, and with the help of target and the sequencing of high-throughput detection technology, complete the pathogenic gene single nucleotide level of cell mutation detection, realize accurate molecular diagnosis. Results The study found that high flux detection technology, including 85 patients, found there are fake fat malnutrition in large molecular gene pathogenic mutations, which mainly includes the 60 cases of different size lack exon repeat, 8 cases of absence and repeated small single nucleotide level, 7 cases of nonsense mutations, and 2 cases respectively splice site mutation, missense mutation. Conclusion based on the false fertilizer large muscular dystrophy factors in clinical diagnosis, has very important significance to diagnosis, with the aid of high flux monitoring technology can achieve complete testing on different types of pathogenic gene variants, reach the significance to the clinical diagnosis of patients diagnosed in time.
【Key words】High-throughput monitoring technology; Large macromolutrical dystrophy; Genetic mutations
假肥大型营养不良主要包括了两种不同病症疾病：Duchenne型肌营养不良、Becker型肌营养不良。DMD基因作为人体的机体内部最大基因之一，而DMD/BMD患者的变异类型，绝大多数都是外显子组的水平重复及缺失[1]。对此对假肥大型肌营养不良分子诊断尤为重要，本次研究探讨分析高通量检测技术对假肥大型肌营养不良分子诊断结果。现报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
通过选取2017年1月至2018年4月期间的100例临床诊断，疑似为假肥大型肌营养不良患者，所有患者均为男性，采集自愿参与本次研究的患者及其家属（母亲）2ml外周血EDTA抗凝，置于4℃保存待检。使用核酸抽提试剂盒检测，经琼脂糖凝胶电泳以及紫外分光光度法完成检测质量，治疗质量均符合实验需求，且相关研究参与患者及其家属均签署知情同意书。
1.2 方法
通过借助CNV plex（高通量）检测技术，采用CNV plex试剂盒连接反应连接产物多重荧光PCR扩增，所扩增的产物荧光毛细管电泳分离，均参照试剂盒的相关说明书。PCR扩增产物通过借助ABI313OXL（美国ABI公司）完成毛细管电泳，进而对样本DMD基因区域内的拷贝数完成确定分析，针对致病诱因拷贝数变异研究，并且借助靶向获得及高通量检测技术的测序，完成致病基因单核苷酸的细胞水平变异检测，实现精准分子诊断。
1.3 统计学方法
本文数据利用SPSS 20.0统计学软件分析和处理，计数资料利用（%）表示，检验通过χ2，数据差异具有统计学意义为P＜0.05。
2.结果
经研究发现高通量检测技术，监测发现其中85例患者，都存在假肥大型营养不良分子基因致病变异，其中主要包括了60例（60.00%）不同大小外显子缺失重复，8（0.08%）例单核苷酸水平小缺失及重复情况，7（0.07%）例无义变异，以及分别2（0.02%）例剪接位点变异、错义变异情况。在研究中通过针对母亲血样的家系患者展开致病变异验证，发现其中有5名患者的母亲均为先证者等同变异的杂合携带者。
3.讨论
假肥大型营养不良作为临床中较为常见的累及骨骼肌的神经肌肉疾病，DMD患者整体疾病发展较为迅速，超出3岁左右无法出现独立行走及依靠轮椅代步，通常死于心肌病及呼吸道并发症，寿命通常在20岁以内[2]。BMD患者整体疾病发展相对较轻，且病情发展也较为迟缓。对此类疾病实现分子诊断，不仅能够有利于早期诊断疾病，作为临床中对家属炎症是否遗传的有力验证证据。DMD基因所致的病性变异，主要是针对横纹肌组织中的抗肌萎缩蛋白，最终致使近端骨骼肌进行性萎缩无力，以及腓肠肌代偿性肥大。FastTarget技术针对性区域设计多重PCR扩增体系，针对多重研究者感兴趣基因组区域性富集，以及实现高通量测序，达到了相对较为成熟的测量方法[3]。
相较于Sanger测序法检测更加简便、操作、快速，等同于高通量测序建库方法，更加简便省略了建库这一复杂化检测过程。在本次研究中出现8（0.08%）例单核苷酸水平小缺失及重复情况，7（0.07%）例无义变异，均由于出现终止密码异常编码，因而所致的截短蛋白，最终引发DMD病发。在临床中Monaco等研究者，基于DMD基因假说，提出认为临床症状严重的DMD患者，绝大多数都是框外突变所致使，整体症状较轻的BMD患者，则主要是由于并未影响阅读框的狂外突变遵循阅读框原则。在本次研究中发现有10例框内突变患者，在后期均经临床确诊为BMD。经本次研究发现其中85例患者，都存在假肥大型营养不良分子基因致病变异，其中主要包括了60例（60.00%）不同大小外显子缺失重复，8（0.08%）例单核苷酸水平小缺失及重复情况，7（0.07%）例无义变异，以及分别2（0.02%）例剪接位点变异、错义变异情况。且其中有5名患者的母亲均为先证者等同变异的杂合携带者。与临床研究结果相符，证实了高通量检测技术对假肥大型营养不良因子的检测诊断可靠性。在临床中针对假肥大型营养不良最为传统的临床治疗方法，就是借助糖皮质激素配合康复理疗加以治疗，不仅能够对患者的肌力及肌肉功能逐步衰退情况加以延缓，同时还能够引发更多不良反应出现。对此可以借助近些年的新型DMD/BMD治疗方法，且经德州大学的最新临床研究，借助老鼠模型发现此种治疗方法，为假肥大型营养不良的治疗提供新思路。
综上所述，通过对假肥大型肌营养不良因素进行临床诊断，具有极为重要的临床确诊意义，借助高通量监测技术能够实现对不同类型致病基因变异完成检测，达到对患者及时确诊的临床诊断意义。
【参考文献】
[1]钟青燕,罗世强,郑敏,等.应用多重连接依赖式探针扩增技术对假肥大型肌营养不良进行分子诊断和产前诊断[C]//第十四次全国医学遗传学学术会议论文汇编.2015.
[2]严提珍,李伍高,李哲涛,等.二代测序技术检测假肥大型肌营养不良Dystrophin基因突变[C]//第十四次全国医学遗传学学术会议论文汇编.2015.
[3]贺静,王蕾,唐新华,等.一个Xq部分缺失伴假肥大型肌营养不良家系的遗传学分析与产前诊断[J].中华医学遗传学杂志, 2015,32(5):687-690.
论文作者:汪先桃1,刘静2（通讯作者）
论文发表刊物:《医药前沿》2018年9月第25期
论文发表时间:2018/9/6
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