王洪燕 林 雁 杨福俊
威海市立医院肿瘤分院化疗一科 山东威海 264200
摘要：目的 探讨PTTG mRNA及其蛋白和bFGF蛋白的表达及PTTG和bFGF对食管鳞癌发生和发展作用机制。方法 采用RT-PCR技术检测40例食管癌及相应的40例癌旁组织中PTTG mRNA的表达，同时采用免疫组织化学SP法检测相应标本中PTTG和bFGF蛋白的表达。结果 在食管癌组织中PTTG基因呈过度表达，食管癌组织中PTTG mRNA的阳性表达率及平均表达水平（分别是37/40和0.71±0.08）显著高于相应的癌旁正常组织（分别为22/40和0.32±0.06）。两组比较，差异有显著性（P<0.01）。免疫组化结果显示，PTTG蛋白在食管癌组织中的表达（34/40）明显高于在癌旁组织中的阳性表达（9/40）（p<0.01）。食管癌组织中，bFGF蛋白表达阳性、阴性标本中，PTTG mRNA表达水平分别为0.75±0.03和0.63±0.07。结论 PTTG基因和bFGF基因的异常表达可对食管癌的发生和发展起重要作用，它们可能为食管癌的早期诊断和基因治疗提供新的靶点。
关键词：PTTG；bFGF；RT-PCR；食管癌
OBJECTIVE To observe the expression of pituitary tumor-transforming gene（PTTG）and its relationship with the expression of basic fibroblast growth factor（bFGF）in esophageal cancer.METHODS Expression of PTTGmRNA and protein were assessed by semi-quantitive RT-PCR and immunohistochemistry methods respectively in 40 case of esophageal cancer and 40 corresponding normal esophageal tissue.Expression of bFGFprotein were detected by immunohistochemistry.RESULTS The expression rate and average quantity of PTTG mRNA were detected in a significantly greater proportion esophageal cancer（34/40 and 0.71±0.08）than in corresponding normal esophageal tissue（22/40 and 0.32±0.06）.The expression of PTTG protein in esophageal cancer（85%）was significantly higher than in corresponding normal esophageal tissue（22.5%）.The expression of PTTG was related to suigecal-pathological stage，myometrial infiltration depth，lymphatic metastasis and pathological subtype（p<0.05，respectively），but was irrelevant to patients’ age and pathological grade（p>0.05，respectively）.The average quantity of PTTG mRNA and expression rate of PTTG protein in tissues with bFGF protein coexpression（0.75±0.03）were higher than in those without bFGF protein coexpression（0.63±0.07）.CONCLUSIONS PTTG may play an important role in carcinogenesis and development of esophageal cancer.PTTG induces an angiogenesis through FGF which is a key determinant step in tumor progression and metastatic spread.
[KEYWORDS]PTTG bFGF RT-PCR esophageal cancer
食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2％。垂体瘤转化基因（PTTG）是一种新近发现的强有力的肿瘤转化基因[1]，因其表达具有肿瘤特异性，因此被认为是一种极具潜在价值的肿瘤标记物，有可能成为肿瘤治疗的靶点。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）是体内生物学功能较广泛的多肽因子之一[2]，是广泛存在于人体内多种组织的一类多肽生长因子，血管形成，创伤修复过程中起着重要的作用，与肿瘤的生长，浸润，转移和预后有密切关系。
1.材料与方法
1.1标本来源
从2006-03-27至2011-10-28收集山东威海市立医院（10例）食管癌组织标本40例，另取相应的癌旁正常组织（距癌组织5cm）40例作为对照。所有患者术前未经放疗和化疗，标本为手术切除后1小时内获得，获得后立即放入液氮中保存。所有标本均经过病理验证，组织病理学分级和TNM分期按国际抗癌联盟（UICC 1997年）标准。包括男性37例，女性3例，平均年龄61.2岁（40-78岁），中位年龄69岁。高分化鳞癌16例，中低分化鳞癌24例。
1.2主要试剂与RT-PCR相关试剂
兔抗人PTTG1单克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司，兔抗人bFGF多克隆抗体购自美国SIGMA公司，SP试剂盒购自美国SIGMA公司。DAB显色液试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。
快速RNA（微量）抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司，AMV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，琼脂糖：购自上海生物工程公司分装，PCR试剂盒：购自北京天为时代科技有限公司，100bp DNA Ladder 购自北京天为时代科技有限公司，RT-PCR引物设计采用Primer 5.0 软件完成，PCR引物：由上海生物工程公司合成，引物序列：上游引物为5' AAATGGAGAACCAGGCACC 3'；下游引物为5'TGCTCTTCAGGCAGGTCAA 3'。
1.3 方法
1.3.1免疫组化：采用免疫组化SP法。染色过程按照试剂盒要求操作，每次实验均设阳性对照和阴性对照，以试剂说明书指定的结肠癌切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。结果判断：PTTG蛋白与bFGF蛋白的计分方法采用sinicrope等改良法，计数至少5个400倍视野中染色细胞所占比例[3]并判别为阴性与阳性，即染色阳性肿瘤细胞占所计数肿瘤细胞的比例＜5%为阴性，≥5%为阳性。
1.3.2 RT-PCR：组织总RNA的提取及定量，应用微量快速抽提试剂盒提取总RNA，提取组织总RNA，加无RNAse水30ul溶解，测OD值定量。反转录体系包括mRNA 1mg，dT 1ul，5×buffer 4ul，Rnase inhibitor 1ul，dNTP 2ul，M-MuLV Reverse Transcriptase 1ul，总体积20ul，37℃ 60分钟。PCR反应体系包括cDNA 0.5ug，上游引物1ul，下游1ul，2×Master Mix 12.5ul，反应总体积为25ul。变性94℃ 30s，退火56℃ 40s，延伸72℃ 1min，共30个循环，最后72℃延长10min。产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳，对电泳条带做半定量分析。
统计学方法
1.4 统计学方法
采用SPSS11.5软件包进行 ±s的t检验，记数资料的卡方检验，Fisher确切概率检验，Spearman相关分析，检验水准a＝0.05。
2．结果
2.1食管癌组织中PTTG mRNA存在表达差异
在40对食管癌及癌旁配对标本中，其中22对食管癌及癌旁组织中PTTG基因均表达阳性，而且在食管癌组织中表达量明显高于癌旁组织。有12对标本中PTTG只在食管癌组织中表达而在癌旁组织中不表达，有6对食管癌组织和癌旁组织中均不表达，PTTG基因在食管癌组织和癌旁组织中表达量分别为（0.71±0.08）和（0.31±0.05）。差异有统计学意义（P＜0.01）。16例高分化鳞癌组织中有3例没表达，24例中低分化鳞癌组织均有表达，表达量分别是（0.63±0.07）和（0.75±0.03）。差异有统计学意义（P＜0.01）。
2.2食管癌组织和癌旁组织中 PTTG和bFGF蛋白的表达及与临床病理特征的关系
PTTG蛋白在肿瘤细胞胞浆和胞核中均有表达，为粗细不一的棕黄色颗粒，在40例食管癌组织中PTTG蛋白的阳性表达率为为85%（34/40），在相应的癌旁组织中阳性表达率为22.5%（9/40）。有极显著性统计差异（P＜0.01）。bFGF蛋白阳性表达主要定位于肿瘤细胞的胞浆中，食管癌组织中bFGF的阳性表达率为72.5%（29/40），癌旁组织为12.5%（5/40），有极显著性统计学差异（P＜0.01）。同时实验结果表明PTTG蛋白的阳性表达率与年龄、饮食习惯、肿瘤是否侵及肌层无关，差异无显著性（P＞0.05），与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），其中在TNM分期中PTTG蛋白的Ⅱ期、Ⅲ期与Ⅰ期比较有统计学差异（P＜0.05）。bFGF蛋白在食管癌中的表达与年龄、饮食习惯无关（P＞0.05），与肿瘤分化程度、是否侵及肌层、TNM分期，淋巴结转移有关，差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3 PTTG蛋白和PTTG mRNA与bFGF蛋白表达的相关性
34例PTTG蛋白阳性食管癌组织中27例bFGF蛋白阳性，占79.4%，在11例bFGF阴性表达的食管癌组织中PTTG阳性表达7例，占63.6%。Spearmen等级相关分析表明二者呈正相关（P＜0.01）。
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在29例bFGF高表达的癌组织中PTTG mRNA的表达量是（0.74±0.03），6例bFGF不表达的癌旁组织中的表达量是（0.59±0.02），差异有统计学意义（P＜0.01）。
3．讨论
3.1 PTTG在食道癌中的表达及意义
PTTG是一种强有力的肿瘤转化基因，但PTTG表达增高通过何种机制导致肿瘤生成还不是很清楚。可能通过以下多种机制参与肿瘤的形成与发展：（1）PTTG可通过编码封闭素蛋白，对姊妹染色体正常分离起着重要的作用，是一种细胞周期相关因子。过度表达的PTTG会导致“Cut”现象：在细胞有丝分裂时，姊妹染色体在子代细胞中分配不均衡，并可能完全不分离，但是细胞质仍然可以发生分裂，进而发生染色体异常，产生异倍体；，使子代细胞非整倍体化，增加突变几率，促进肿瘤表型恶化[4，5]。（2）PTTG蛋白含一个氨基末端的碱性区和一个含羧基末端的酸性区。酸性区的脯氨酸富集区含有两个PXXP花簇（Pro157-Pro158- Ser159-Pro160），通过同系序列3（SH3）中介的信号传导通路，与多种细胞内接头蛋白的SH3域结合，通过募集多种肿瘤相关基因的表达，使细胞发生转化[6]；。（3）PTTG刺激bFGF分泌，二者相互促进，共同促使肿瘤进一步发展；（4）PTTG调控p53的活性，p53也调节DNA损伤引起的PTTG转录抑制。而且，PTTG活化p53过表达的能力依赖细胞中p53的情况，并揭示p53基因被活化是直接调控PTTG表达的间接效应[7]。（5）c-myc作为PTTG mRNA下游的目的基因，体外实验已发现PTTG通过激活c-myc导致细胞的扩增，PTTG可在转录起始位点附近与c-myc结合，激活c-myc转录[8，9]。
本实验采用半定量RT-PCR技术及免疫组化检测了食管鳞癌和相应癌旁组织中PTTG mRNA和蛋白的表达，结果显示食管鳞癌组织中PTTG mRNA和蛋白的表达均显著高于癌旁组织，表明PTTG基因的激活可能是食管癌变过程中的重要因素，PTTG基因的过度表达可能促进了食管黏膜细胞的增殖和恶性转化。但RT-PCR技术及免疫组化的检测结果也存在一些不同之处，即RT-PCR技术检测到的PTTG mRNA的阳性表达率高于免疫组化检测的PTTG蛋白的阳性表达率，这种差别可能是由于基因的转录和表达过程受到了某种因素的干扰或调控造成了PTTG mRNA和蛋白表达的不同，具体机制有待于进一步研究证实。结合食管癌组织的临床病理学特征分析发现，PTTG mRNA和蛋白的表达与分化程度、手术病理分期及淋巴结转移密切相关，提示PTTG基因过度表达可能在食管癌侵润演进中发挥一定作用，并有希望成为预测食管癌患者预后的指标之一。这与国内学者在原发性胆囊癌、原发性肝癌、以及肾癌中研究得出的结论一致[10-12]。
3.2 bFGF在食管鳞癌中的表达及意义
bFGF是1975年Grospodarowicz首先从牛垂体中分离出一种能引起成纤维细胞增生的多肽物质，并命名为bFGF。现今研究bFGF的生物学活性主要针对18 ku的亚型[13]。
bFGF的作用主要有以下几方面：（1）刺激所有中胚层来源的细胞，以及许多外胚层和内胚层来源的细胞的增殖；（2）在体内对内皮细胞有趋化和促有丝分裂作用，促进血管形成；（3）介导神经元的分化、存活和再生，刺激神经胶质细胞的移行；（4）参与由细胞过度增殖和血管过度形成所引起的多种病理损害。bFGF可能通过以下两种主要机制参与肿瘤的形成和发展：一方面过表达的bFGF以自分泌或旁分泌方式促进细胞过度增殖和肿瘤生长；另一方面通过促进新生血管形成，为肿瘤细胞生长提供丰富营养[14]。
本实验中30例癌组织中bFGF蛋白阳性表达率为70%，相应的癌旁组织阳性表达率为10%，癌组织的阳性表达率显著高于相应的癌旁组织（P＜0.01），说明bFGF是在绝大多数食管癌中有高表达的癌基因，与食管癌的发生发展密切相关。同时本实验还发现bFGF蛋白在食管癌中的表达与年龄、饮食习惯无关，与是否侵及肌层、分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关。
3.3 PTTG与bFGF之间的关系
bFGF与PTTG的关系密切，研究显示PTTG可刺激bFGF的表达和细胞外分泌，体外实验结果证实，PTTG能直接引起bFGF mRNA 及其蛋白质水平增加，刺激bFGF蛋白合成和分泌[15]，形成自分泌与旁分泌的反馈环路，致体外细胞转化和体内实体肿瘤形成。临床研究发现PTTG相关因素，bFGF在垂体瘤中是升高的，并与PTTG的水平紧密相关，也进一步证实了PTTG在肿瘤血管形成机制中的作用[16 17]。
本实验采用RT-PCR方法检测食道癌和癌旁组织中PTTG mRNA的表达，同时用免疫组织化学的方法对PTTG、bFGF基因进行蛋白水平的检测，结果显示：在 25例PTTG蛋白阳性中21例bFGF蛋白阳性，占84%，在9例bFGF阴性表达中PTTG阳性表达4例，占44%。spearman等级相关分析表明二者呈正相关（r=0.930 P＜0.05）。在21例bFGF高表达的癌组织中PTTG mRNA的表达量是（0.39±0.02），7例bFGF不表达的癌旁组织中PTTG mRNA的表达量是（0.25±0.14）。该结果提示高表达的PTTG和bFGF可能与食管癌的发生、发展密切相关，其机制可能与高表达的PTTG刺激了bFGF的合成与分泌，而后者又反过来增强了PTTG的表达有关。
综上所述，作为癌基因，PTTG具有转化功能，参与细胞周期的调控，调节bFGF的表达，与bFGF协同参与肿瘤的发生、发展及侵袭过程。我们认为PTTG和bFGF在食管癌的发生、发展以及转移过程中起促进作用，而且二者有相互促进使肿瘤进一步发展，可能成为反映食管癌生物学行为及侵袭性的重要指标，针对PTTG基因及其表达产物的治疗，将为食管癌的基因治疗提供有效途径。
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作者简介：王洪燕，女，山东荣成人，学士，副主任医师，威海市立医院肿瘤分院化疗一科，主要从事肿瘤临床的研究工作.
论文作者:王洪燕,林雁,杨福俊
论文发表刊物:《健康世界》2015年6期供稿
论文发表时间:2015/10/29
标签：食管癌论文; 组织论文; 阳性论文; 蛋白论文; 肿瘤论文; 细胞论文; 基因论文; 《健康世界》2015年6期供稿论文;