赵艳[1]2003年在《基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究》文中进行了进一步梳理利用bar作为筛选标记基因，cecropinB为非筛选基因，基因枪法介导将不含质粒载体主干序列的bar和cecropinB表达框(包括启动子、基因开放阅读框和终止子)以及携带bar和cecropinB基因的质粒pCB1和pCB4导入了两个粳稻品种秀水04和嘉59。研究了基因枪介导外源基因表达框转化水稻的影响因素，比较研究了外源基因表达框和完整质粒在水稻基因组中的整合特征和遗传表达规律，并分析了外源基因在杂交转育中的遗传和表达行为。结果表明： 1 基因枪介导外源基因表达框转化水稻的频率约在0.1～0.5％之间，非选择标记基因的共转化频率约为50～60％；非选择标记基因cecropinB表达框在水稻基因组内整合模式简单，仅有1～3个拷贝：筛选标记基因bar表达框却比完整质粒转化后的整合模式复杂，插入拷贝数在4～14个之间。 2 基因枪介导转化线性bar基因表达框DNA在水稻基因组内整合时易发生重组和截断。bar基因表达框在水稻基因组内存在头接头、头接尾、和尾接尾叁种重组串联方式，多个拷贝的bar基因表达框DNA通过重组连接形成了1～3个转基因串联子整合在水稻基因组内的一个较大的相互临近染色体区域。含DNA重组热点相似序列的CaMV35S启动子可能是bar基因重组的重要原因。 3 多拷贝bar基因表达框之间的遗传分离和表达互作使得转基因水稻株系的Basta抗性分离行为比含bar基因质粒转化的株系复杂，但基因表达框转化时约30％的(3株纯合/10个株系)株系在T_1代就能得到纯合体。 4 相互独立的bar和cecropinB基因表达框共转化的水稻株系中，50％以上(4/7)的株系在T_1代筛选标记基因和非筛选基因连锁遗传的频率较低。Basta抗性易于检测，因此标记基因bar剔除极为方便，利用遗传分离策略，在转基因植株T_1代对Basta敏感植株PCR筛选，获得2株无bar标记基因的cecropinB基因表达框转化植株，这两个植株除cecropinB基因表达框外不含任何垃圾DNA，是真正安全的转基因植株。因此，基因枪介导基因表达框共转化后应用遗传分离策略剔除标记基因，为培育安全转基因植株开创了有效新途径，是本研究的创新点之一。 5 cecropinB基因的表达水平受位置效应的影响较大，与转化时采用质粒或表达框形式、Actin或rbcS启动子驱动以及植株是四倍体或二倍体之间并无直接对应的关系，cecroplnB基因的mRNA转录水平和转基因植株的抗白叶枯病能力之间也不存在显着的对应关系。 6单拷贝外源bar基因在秀水04四倍体突变株系X工P一1中的遗传行为比较复杂，但主要符合巧:1分离。在四倍体株系后代中，b二和cecr口pl万B基因的Southern整合模式出现了与T。代完全不同的新杂交带，可能是四倍体植株减数分裂过程中转基因所在位点的染色体结构发生断裂重组造成的。这是首次报道外源基因在水稻四倍体变异株中的遗传行为，是本研究的创新点之二。 7在bar基因表达框转化的植株中存在可遗传的发芽率降低和白化苗突变性状，这些性状变异可能主要由组织培养引起。8基因枪介导高世代群体分析，和表达。pCBI质粒转化获得的京引119转基因株，通过连续世代跟踪和表明bar和cec厂口户了褚基因在自交高世代(T0订6)能稳定遗传 9在杂交转育中，水稻基因组中的外源非筛选基因cecroPll7B的Southern整合模式十分稳定，筛选标记基因加r却与转基因供体不完全相同。筛选标记基因bar在连续筛选压下，能随着杂交传递稳定表达，非筛选基因cecroP了昭表达行为因转基因供体的不同表现出较大差异。转基因供体中表达的cecroPjnB基因在杂交植株后代中可能发生沉默，转基因供体中沉默的cecr口户1’nB基因经杂交转移后也可能活化表达。自交高世代稳定表达的京引119转基因株为供体的杂交群体中，bar和cec厂口刀了nB基因也能稳定表达。这是首次系统研究基因枪介导转化的外源基因基因在杂交转育中的整合模式的遗传和表达行为，是本研究的创新点之乡
吴雪莉[2]2009年在《基因枪法和农杆菌介导二穗短柄草（Brachypodium distachyon）成熟胚愈伤组织的遗传转化》文中研究说明二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是一种广泛分布于温带地区的禾本科植物,基因组小、染色体少、DNA重复序列少、植株较矮、生育期短、不需要严格的生长条件和栽培措施,与小麦族植物一样具有二倍体、四倍体和六倍体,是一种新型的禾草模式植物。在禾谷类转基因研究中,成熟胚因其取材方便,生理状态一致,而成为组织培养和遗传转化理想的外植体。本实验采用农杆菌介导法和基因枪转化法同时应用于二穗短柄草成熟胚愈伤组织的遗传转化上,并对其转化效率以及转基因在植物中的表达情况进行了研究。主要结果如下：1.二穗短柄草高效离体再生体系的建立以二穗短柄草叁个品系BD21,BD21-3和BDR018成熟胚为外植体,研究了2,4-D浓度和硫酸铜对愈伤组织诱导率的影响及愈伤组织年龄对再生的影响。结果表明：添加0.6mg/L CuSO4和2.5mg/L2,4-D的MS2.5+Cu诱导培养基上,胚性愈伤组织的诱导率最高,叁个品系的诱导率分别为86.2%,85.0%和72.3%。愈伤组织年龄为7周时再生率最高,分别为98.1%,99.3%和83.3%。随愈伤组织年龄的增加,再生率降低,白化率升高。2.二穗短柄草遗传转化体系的建立选取年龄75d的BD21和BD21-3品系的胚性愈伤组织为受体材料。用包被有质粒pDM803,J34和J53的金粉-DNA混合液轰击,经过抗性愈伤组织的筛选和抗性植株再生,统计转化率。结果表明：在基因枪转化法中,BD21和BD21-3用质粒J34轰击的平均转化率最高分别为7.2%和13.5%,而质粒pDM803转化率最低。农杆菌介导转化的最高转化率为13.8%。0.01%Silwet L-77、真空处理及添加AS均可显着提高转化率。3.抗性植株的检测通过GUS组织化学染色,农杆菌介导的植株中有62.7%的植株能够在植物体内稳定表达。而基因枪转化的植株中只有30%。经过PCR检测,除了非转基因对照植株以外,所有的抗性植株均扩增出了357bp的bar基因DNA片断。利用Basta除草剂对T1代植株进行喷洒筛选,初步确定bar基因的分离规律完全符合孟德尔遗传分离规律。
杨海洋[3]2013年在《植物抗病抗逆相关基因表达载体的构建》文中研究说明通过基因工程技术将抗性基因转入植物受体中,是创新种质资源、培育抗病抗逆新品种的有效途径。植物表达载体直接关系到外源基因的转化效率、遗传稳定性和表达情况,同时也与转基因植物的安全性等问题密切相关,因此,表达载体的构建在植物基因工程研究中占据重要地位,是获得有应用价值转基因植株的基础。本研究克隆了大量不同来源和作用机理的抗病抗逆相关基因,如抗穗发芽基因、不同的赤霉病菌特异抗体与抗菌肽或脱毒蛋白构建的融合蛋白抗病脱毒基因等,分别构建到小麦和拟南芥的遗传转化载体,为进一步研究这些基因的功能和创造新的抗性种质资源奠定了基础。同时,还通过添加合适的表达元件、构建含有不同启动子的最小表达框载体等策略,对表达载体进行多方面的优化,为外源基因表达水平的提高和具有更高安全性转基因植株的获得提供了新的思路。本研究所构建的部分表达载体已在本实验室进行的相关研究中得到应用,并己筛选到了表型性状明显改善的转基因植株,在作物分子育种研究中具有重要的应用价值和发展潜力。本研究的主要成果如下：1.根据拟南芥、小麦、大麦和禾谷镰刀菌的密码子偏爱性,优化并合成牛乳铁蛋白基因BLF以及脱毒基因FUMI、FUMD和LAC从小麦和拟南芥cDNA中分别克隆受体蛋白基因FS1和FS9,以及G蛋白α亚基编码基因GPA1；通过SOE-PCR技术,扩增得到Lfcin B、MSI99、D4E1、Hvchi和UECH42等抗菌肽基因,并与赤霉病菌等真菌的特异单链抗体进行融合,得到抗菌肽-抗体融合基因(如Hvchi-G7、 Hvchi-FGMab、UECH42-G7)。2.优化合成组织特异性表达启动子amt和leml；对实验室已有CaMV35S启动子进行改造,使其B区重复四次,并添加intron和Ω序列等表达元件,为植物表达载体提供更多的启动子选择。3.将不同来源和作用机理的抗病抗逆基因、脱毒基因或抗体融合蛋白基因分别构建到含amt、cmps、leml.lem2、Q35S、ubi和vp1启动子的表达载体中,并完成农杆菌转化载体的根癌农杆菌转化鉴定工作,这些植物表达载体将用于小麦的基因枪转化或农杆菌介导转化。4.构建脱毒基因或脱毒蛋白-抗体融合基因的拟南芥表达载体,并完成农杆菌的转化。主要包括：伏马菌素脱毒基因FUMI和FUMD与伏马菌素特异抗体H2融合的双表达框农杆菌转化载体；黄曲霉脱毒基因LAC与黄曲霉特异抗体AFTB1的融合表达载体；解毒基因Epo和NHTD的表达载体。5.构建一系列抗菌肽-抗体融合蛋白相关基因的拟南芥转化载体,其中A6、B3、D2、E9、H2、G7、F11、ScFv1、20.51、AFTB1、FGMab和PIPP等抗体构建了单独的抗体表达载体,D4E1、MsrA1、AFP2和MSI99构建了单独的抗菌肽表达载体；抗菌肽与抗体组合构建的融合蛋白表达载体有D4E1-G7、D4E1-PIPP、D4E1-F11、 MsrAl-G7、MsrAl-PIPP、MsrAl-F11、AFP2-ScFv1、AFP2-20.51、AFP2-FGMab、 MSI99-ScFvl、MSI99-20.51和MSI99-FGMab,这些表达载体已完成根癌农杆菌的转化,将利用模式植物拟南芥研究这些外源基因的抗病性,探寻新的抗性种质资源。6.将克隆的受体蛋白基因FS1和FS9分别与报告基因GFP融合,构建到植物表达载体中,将用于遗传转化拟南芥研究受体基因的功能。
颜美仙, 黄大年, 钱前[4]2008年在《外源基因转水稻的途径、遗传行为和表达》文中研究指明随着分子生物学和转基因技术的快速发展,人类对外源基因在植物体内的遗传和表达有了进一步的认识。本文着重介绍了水稻转基因技术以及外源基因在水稻中的遗传、表达行为。
关峰[5]2012年在《几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究》文中研究表明水稻是最主要的粮食作物之一,在全世界广泛种植。全球有80%的人口以水稻作为主粮。在我国,水稻更是第一大粮食作物,对国民经济发展起着重要的支撑作用。也是粮食安全的重要保障。近年来,随着植物遗传转化技术的迅猛发展,各国育种学家愈来愈广泛地把基因工程等现代技术手段应用于育种研究中,试图将一些控制优良性状的外源基因导入水稻,以培育优质、高产、抗逆性强的水稻新品种。由于水稻品种繁多,而且植株再生和遗传转化的复杂性和随机性很大,针对某一个特定的水稻品种建立高效、稳定的再生体系和转化系统非常必要,而提高愈伤组织的再生能力一直是水稻组织培养技术需要突破的技术关键。由于不同水稻品种愈伤组织分化、再生的频率不同,这种状况严重地制约了以水稻组织培养为基础的植物遗传转化工程的发展。因此针对特定品种建立一套适合其高效遗传转化的体系,对创制新的水稻种质资源以及培育优良水稻品种具有重要意义。本研究以吉林省主栽水稻品种吉农大808为研究对象,建立了针对农大808的高频再生体系,优化了遗传转化系统,用农杆菌介导法和基因枪转化法等不同手段将Tch基因导入吉林省主栽水稻品种中,经过含有10mg/L除草剂的培养基中筛选后,获得了转基因抗性植株。吉林省主栽水稻品种的组织培养体系的建立和优化,对今后东北地区水稻规模化遗传转化以及水稻转基因研究提供了有利技术支撑。本试验获得的结果如下：1.针对水稻品种吉农大808,建立了高频再生体系并优化了遗传转化系统。(1)继代培养基中外源激素添加量为NAA1mg/L+KT0.5mg/L+2.4-D1mg/L时有利于水稻愈伤组织的分化,愈伤组织的生长速度虽有减缓,但质地紧密、呈颗粒状、圆形、分散性好的胚性愈伤组织数量明显增加,后期绿苗分化率也随之提高。优化后的体系应该是每20天继代一次,连续继代叁次以上,此时愈伤状态最佳,可用作转化受体材料。(2)利用吉农大808水稻成熟胚诱导的愈伤组织,如果在分化前干燥处理4h,可引发愈伤组织细胞产生一些生理生化反应,可以显着提高愈伤组织的分化能力。但干燥处理时间不能超过8h,否则愈伤组织失水严重,其分化能力将明显降低。2.通过农杆菌介导法和基因枪转化法,将位于同一表达载体上的抗病相关目的基因Tch和抗除草剂筛选基因bar导入吉农大808中,筛选后共获得了105株抗性再生植株。PCR检测得到24株Tch和bar共转化的阳性材料,经Basta试纸条和浓度为1g/L的除草剂涂抹试验鉴定,其中2株材料经试纸条检测呈阳性,并表现出明显的Basta抗性,表明筛选基因bar已经整合到水稻基因组中并稳定表达。由于目的基因Tch和筛选基因位于同一个表达载体中,可以间接推测目的基因Tch可能具有相应的较高表达水平,进一步的验证工作正在进行中。
余丽[6]2009年在《水稻Pib启动子中乙烯和茉莉酸响应元件的转基因分析》文中提出植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件,在转录水平上参与调控下游相应基因的表达,是转录调控的核心环节,也是研究基因的表达调控机理的重要内容。通过制备启动子的部分序列缺失并将得到的缺失片段与报告基因构建成融合基因,转化后比较转基因植株中报告基因表达状况来研究启动子中一些分子元件的功能,是启动子结构和功能研究的重要方法。Pib基因是利用图位克隆技术从水稻中克隆出的第一个抗稻瘟病主效基因,属于NBS-LRR抗病基因家族,前人研究Pib基因供体品种植株的抗稻瘟性表达受到乙烯、茉莉酸、水杨酸、氯化钠和黑暗等因素的诱导而不受病原菌接种的诱导。有关水杨酸、氯化钠和黑暗等诱导因素与Pib启动子中分子元件的关系已有了转基因分析的报道。乙烯和茉莉酸是植物防御反应的重要信号分子,在植物对生物性和非生物性因素的抗性以及植物生长和发育过程中的基因调控上发挥着重要的作用。然而,Pib基因的乙烯和茉莉酸诱导响应是否是启动子的响应,以及有关乙烯和茉莉酸诱导因素与启动区域内分子元件的关系还需要实验验证。为了分析Pib启动子中应答乙烯和茉莉酸的分子机制,确定乙烯和茉莉酸诱导的必需序列区域,本文采用了启动子缺失的方法构建了不同长度的5’端pib基因启动子驱动gus基因的双元载体,通过转基因技术平台和报告基因体系来研究该pib启动子中乙烯和茉莉酸诱导响应元件的生物学功能,这将为基因表达调控的研究及抗病育种提供重要的理论依据。1.用PCR法制备了Pib全长启动子-3572～2bp(3575bp)和3个5'端缺失片段-2692bp～2bp(2695bp)、-1335bp～2bp(1338bp)、-761bp～2bp(764bp),得到4个不同长度的Pib启动子分别置换掉双元质粒pCAMBIA1301中gus基因上游的35S构建为重组质粒,构建了pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904四个植物表达载体,重组质粒经过酶切鉴定,用农杆菌冻融转化法转化入农杆菌菌株EHA101中。2.利用农杆菌介导法,将pib全长启动子及其5’端不同缺失体片段驱动gus基因的四个重组双元载体pNAR901、pNAR902、pNAR903和pNAR904和CaMV35S启动子驱动gus基因的pCAMBIA1301对照质粒分别转化粳稻R109。经农杆菌侵染、潮霉素筛选、分化、壮苗,获得pNAR901转化植株22株、pNAR902转化植株27株、pNAR903转化植株20株、pNAR904转化植株30株,pCAMBIA1301转化植株5株,阳性率达到74.8%,对转基因植株进行PCR, Southern blot和潮霉素抗性鉴定,结果表明目的基因已经整合到水稻基因组中,且外源基因大部分以单拷贝插入植物基因组。3.以Pib全长启动子及3个5'端不同长度缺失的Pib启动子片段驱动gus基因的水稻转基因植株为材料,对转基因水稻中GUS活性进行的蛋白质水平和mRNA水平的定性和定量分析结果表明,全长Pib启动子(-3572～2bp,pNAR901)启动活性最强,茉莉酸或乙烯诱导6h后,其驱动下的gus基因在转基因植株各部组织中的表达量明显上升。而-3572～-2692bp区段序列缺失后不但Pib启动子启动活性显着降低而且也丧失了对茉莉酸和乙烯的诱导活性。pNAR902(-2692～2bp)与pNAR903(-1335～2bp)和pNAR904(-761～2bp)中的Pib启动子序列的缺失长度相差达2倍和3倍以上,但其对茉莉酸和乙烯的诱导响应没有区别。这些结果显示这叁个Pib启动子缺失体构建中,其共同的缺失序列即-3572bp～-2692bp区域是Pib启动子的乙烯和茉莉酸诱导响应的必需区域。软件检索证实,Pib启动子序列中只在上述共同缺失区段之内的-2722bp处有一个GCCGCC基序。本文报导的转基因试验表明,GCCGCC基序可能是Pib基因中有关乙烯和茉莉酸诱导响应的顺式分子元件。
郭明殊[7]2010年在《人参皂苷合成关键酶βAS基因转化水稻的研究》文中提出人参属于五加科人参属植物,是传统的名贵药材之一,具有增强免疫力、抗肿瘤、抗动脉硬化保护心肌等作用。其主要功能成分是人参皂苷,即达玛烷型四环叁萜类或香树脂烷型五环叁萜类化合物,至今人参皂苷尚未能人工合成。水稻具有与人参相似的代谢途径,含有共同的前体物质——角鲨烯,水稻中的角鲨烯经环阿屯醇合成酶(CS)等的催化合成甾醇类化合物,而人参中的角鲨烯经β-香树脂醇合成酶(βAS)等的催化合成皂苷等叁萜类化合物。因此,将人参中皂苷合成的关键酶基因,遗传转化到水稻中,有望创建出含有皂苷成分的水稻优异种质。本研究的主要结果如下:1、采用PCR方法,从总皂苷含量高达15%以上的竹节人参根中克隆出人参皂苷合成关键酶βAS基因的开放阅读框(2286bp),编码762个氨基酸。2、采用双T-DNA共转化的安全性转基因策略,将βAS基因和选择标记基因分别构建在同一载体上两个不同的T-DNA区,其中一个T-DNA区含有选择标记基因hpt,另一个T-DNA区含有βAS基因,选用的是GluB-1启动子,在βAS基因表达框的两侧连有两段正向重复的烟草Rb7 MARs,以增强βAS基因的表达。从而获得能在水稻胚乳中高效特异性表达的βAS基因植物表达载体“pCDMAR-βAS-hpt”。3、采用农杆菌介导法,将重组载体“pCDMAR-βAS-hpt”导入优质水稻品种“台粳9号”,经潮霉素抗性筛选,共获得20株抗性植株;利用PCR对抗性植株进行检测,有6株呈阳性。
钱炳俊[8]2007年在《乙型肝炎新型植物口服疫苗的研究》文中研究表明乙型肝炎(Hepatitis B,HB)是一种由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染所引起的传染性疾病,我国大约有10%的人群是乙肝病毒携带者。目前仍然缺乏有效的治疗手段治疗HB,因此,主要靠接种疫苗来进行预防HB。由于现在使用商业化HBV疫苗主要通过酵母表达系统生产,存在较高的生产成本,而且需要冷藏,因此对边远和经济不发达地区人群疫苗接种普及带来困难。此外,大约有10%的接种人群对现在商业化HB疫苗不产生明显免疫反应。因此,探索研制新型价廉的HB疫苗成为疫苗研究关注的焦点。本研究在国内外已有工作基础上,对人新型HBV表面抗原融合基因SS1进行了改造,并将SS1基因转入植物中,开展了相关研究,取得以下主要结果。1、为了分析新型乙肝表面抗原SS1(在乙肝主要表面抗原(S)的C端融合了乙肝表面抗原前体肽preS1(21-47aa))是否具有preS1的免疫原性,并在体内激起针对preS1的抗体反应,我们依照大肠杆菌B株系的密码子偏爱特性改造和合成了全长的adr血清型preS1基因(spreS1)并在大肠杆菌进行了表达。结果显示表达产物以可溶性形式存在,表达量占到总蛋白的44%,经过Ni-NTA亲和层析纯化,纯化的蛋白纯度达到98%以上,western blot和间接ELISA结果表明该重组蛋白具有preS1的抗原性,而且抗原性与现在商业化的preS1相当。这些克服了以往在表达全长preS1蛋白时遇到的包涵体、表达产物不稳定或低表达的难题。2、为了探索生产一种新型的HB口服疫苗形式,我们选择了水稻作为新型乙肝表面抗原SS1的表达宿主。我们通过目前的文献报道选取了水稻种子表达的高效表达启动子P_(GluB-4),构建乙型肝炎抗原基因SS1的水稻种子高效表达载体p1300GSS1,通过农杆菌转化,实现了其在水稻种子中的表达。重组蛋白的表达量为31.5 ng/g DW种子,且能够自组装成病毒样颗粒结构(virus-like particles,VLP),颗粒的粒径大约为22±2 nm,沉降系数为1.25 g.cm~(-3)。Western blot结果显示同时具有S和preS1抗原性。动物免疫试验显示重组蛋白能够在小鼠体内激起针对S和preS1的抗体反应,这些为今后的临床评价提供理论基础。3、为了进一步提高新型乙肝表面抗原SS1在植物体内的表达水平,我们首次尝试利用植物叶绿体表达系统进行这种新型乙肝表面抗原的表达。越来越多的研究表明植物叶绿体表达系统具有诸多优越性,其中外源基因的高效表达最引人注目。乙肝表面抗原是一种糖蛋白,而且它的糖基化程度与其抗原性直接相关,本研究构建了其烟草的叶绿体表达载体并进行了烟草的遗传转化,结果显示外源基因被正确地整合到叶绿体基因组中预定的位点,表达的重组蛋白经乙肝表面抗原检测试剂盒检测具有抗原性,相关的研究还在继续中。4、为了提高口服疫苗的免疫效果,我们对目前常用的免疫佐剂分子霍乱毒素B亚基蛋白(cholera toxin B,CTB)进行了大肠杆菌表达。本研究首先克隆了去除信号肽编码序列的霍乱毒素B亚基基因CTB,构建了大肠杆菌表达载体,进行表达,结果显示表达产物以包函体的形式出现,表达量占到总蛋白的25%,经过包函体的变性和复性,纯化的蛋白纯度达到98%,体外生活性试验表明纯化的蛋白主要以五聚体的形式出现,western blot结果显示五聚体大约占到总纯化蛋白的66.8%。由于现在商业化的疫苗中还没有添加任何佐剂成份,尤其是CTB蛋白,所以口服免疫佐剂表达系统的建立为今后水稻表达的新型乙肝表面抗原的动物口服试验提供了基础。
别晓敏[9]2011年在《果聚糖合成酶基因在烟草和小麦中功能分析》文中研究指明果聚糖(fructan)是果糖基转移酶催化的由蔗糖与一个或多个果糖分子连接而成的水溶性和黏性的高分子多糖,具有多种生理功能和生物活性。干旱等逆境条件下,释放可溶性果糖,调节细胞渗透压,是参与植物抵抗渗透胁迫的重要物质之一。研究小麦中不同果聚糖合成酶基因Ta1-SST、Ta6-SFT和Ta1-FFT及其组合在植物抗逆性中的作用,为研究它们的作用机理提供更多分子生物学证据,为进一步利用基因工程手段改良小麦抗非生物胁迫能力提供理论依据。根据本实验室研究结果,从抗旱性较强的小麦品种扬麦6号扩增果聚糖合成酶基因Ta1-SST、Ta1-FFT,构建重组表达载体pBI121-Ta1-SST和pZP211-Ta1-FFT;利用农杆菌介导法将pBI121-Ta1-SST、pZP211-Ta1-FFT和前期构建的pBI121-Ta6-SFT植物表达载体共转化野生型烟草NC89,对抗性再生植株进行PCR、ELISA检测、抗逆鉴定及生理指标测定。结果表明,共转化小麦果聚糖合成酶基因的阳性植株抵抗逆境胁迫能力明显提高。干旱、低温、高盐等逆境胁迫研究发现,阳性植株抗逆性有较大提高;生理指标测定结果分析发现,阳性植株含量优于野生型,且转多基因阳性植株各项指标测定结果优于转单基因阳性植株。在阳性植株生理指标测定结果中,果聚糖含量较高者为转Ta1-SST + Ta6-SFT基因(675.6 mg g~(-1))和转Ta1-SST + Ta1-FFT + Ta6-SFT基因(140.7 mg g~(-1))植株;转Ta1-SST + Ta6-SFT基因和转Ta1-SST + Ta1-FFT + Ta6-SFT基因植株脯氨酸含量分别为184.4μg g~(-1)和201μg g~(-1);转Ta1-SST + Ta6-SFT基因植株丙二醛含量为12.9μmol mg~(-1)FW,转Ta1-SST + Ta1-FFT + Ta6-SFT基因植株为14.9μmol mg~(-1)FW;可溶性糖含量最高为转Ta1-SST + Ta6-SFT基因植株(0.262 %),其次为转Ta1-SST + Ta1-FFT + Ta6-SFT基因植株(0.234 %)。综合上述结果可知,Ta1-SST + Ta6-SFT基因为最优组合,抗逆功能最强。以农杆菌介导法将果聚糖合成酶基因RNA干扰载体pANDA-Ta1-FFT-RNAi转入小麦幼胚和成熟胚愈伤组织获得候选转基因植株,同时对转Ta1-SST-RNAi基因、转Ta6-SFT-RNAi基因沉默片断的T1代植株进行PCR、荧光定量PCR检测。结果表明,筛选标记基因nptII在转基因小麦中能够检测到;荧光定量PCR检测分析发现,转基因植株中目的基因表达量低于受体材料,基因沉默效果明显,其中基因相对表达量最低者仅为阴性对照基因表达量的0.11;通过基因枪介导法将果聚糖合成酶基因过表达载体pRTL2-Ta1-SST、pRTL2-Ta1-FFT分别转入小麦幼胚愈伤组织获得候选转基因植株,并对过表达载体pRTL2-Ta6-SFT的T1代植株进行了PCR检测。结果发现,通过bar基因初次筛选和目的基因二次筛选,目的基因已成功转入小麦。同时,本研究还优化了小麦组织培养体系,为进一步提高小麦再生效率和遗传转化效率奠定了基础。通过系统比较植物激素对小麦幼胚再生效果的影响,明确了dicamba、2, 4, 5-T、picloram最适浓度分别为2.5 mg L~(-1)、3.0 mg L~(-1)和3.0 mg L~(-1),在添加2.0 mg L~(-1) 2, 4-D诱导培养基中额外添加0.3 mg L~(-1) ABA能显着改进愈伤组织质量,提高绿苗诱导率。此外,诱导培养基中添加0.1～4.1μmol L~(-1) CuSO4对CB037成熟胚培养效果无显着差异,当浓度达6.1μmol L~(-1)时植株再生率降低极显着;Fe盐浓度50μmol L~(-1)～60μmol L~(-1)有利于CB037成熟胚愈伤组织再生植株,40μmol L~(-1)处理显着提高CB037幼胚愈伤组织分化,新春9号和Bobwhite幼胚培养适宜Fe盐浓度为20μmol L~(-1)。
周继阳[10]2012年在《面包烘烤品质基因1Dx5在冬小麦新冬-26中的遗传转化及后代检测》文中提出本文以新疆主栽耐盐冬小麦（Triticun aestivum L）品种新冬-26作为研究对象，采用基因工程手段，通过制备面包品质主效基因1Dx5的线性核心片段，采用花粉管通道方法实现线性1Dx5核心片段在新冬-26中遗传转化，获得转基因小麦植株；并利用SDS-PAGE手段和Multiplex-PCR技术检测和分析外源基因在转基因后代中的遗传表达情况，以期获得安全型的强筋与耐盐并举的转基因小麦株系。这不仅为保障粮食安全提供了新型的种质资源，进而加快了干旱区高品质小麦的生产步伐，同时对利用现代分子生物学技术手段改良我国小麦加工品质、培育资源高效型农作物等都具有重大的理论价值和实践意义。主要研究结果如下：（1）小麦及其近缘种1Dx亚基基因的比较分析：利用生物信息学手段，对所选1Dx型亚基的核酸、蛋白质一、二级结构进行比较和分析。结果显示：在核酸的水平上，其相似性高达96.58%，存在有90个SNPs；SNPs造成氨基酸水平上出现53个氨基酸的替换；在氨基酸水平上，其相似性高达96.74%，并存在7处氨基酸肽段的缺失/插入；在预测的蛋白质二级结构水平上，相似性高达97.71%，其中SNPs可能造成四处二级结构单元的改变，同时重复序列的插入和缺失影响二级结构中无规卷曲的长短，其可能是影响蛋白质亚基的生物学功能的主要因素。通过分析各基因在DNA和蛋白质水平上存在的差异和联系，探究各基因在功能上差异的原因，并在一定程度上揭示各基因在分子结构、生物学功能和物种进化叁者之间的关系，为后期外源基因的检测奠定理论基础和提供强有力的技术方案。（2）外源基因的遗传转化和检测：以小麦品种新冬-26(Null,7+8,2+12)为实验材料，采用花粉管通道法将线性1Dx5基因核心片段和pHMW1Dx5分别导入到受体材料中，利用蛋白质检测手段，分析转基因小麦T0代HMW-GS的组成情况。结果显示，线性1Dx5基因转基因小麦T0代籽粒中有5条高分子量麦谷蛋白亚基条带，分别是1Dx2、1Bx7+1By8和1Dy12，一条新的蛋白质亚基-BandX，迁移率快于1Dx5，其频率为0.2%；pHMW1Dx5转基因小麦T0代籽粒也产生了新蛋白质条带，其迁移率慢于1Dx2，其频率为0.15%。（3）pHMW1Dx5转基因小麦后代中外源基因的检测和分析：结果显示，采用PCR技术，在转基因T0代植株中扩增出1Dx5基因的特异片段大小为450bp，表明外源基因已整合到受体基因组中；SDS-PAGE分析T1代籽粒外源基因的表达，表明外源基因插入受体基因组中并表达，引起了转基因T1代籽粒中HMW-GS组成的变化，获得了pHMW1Dx5转基因小麦株系。本实验验证了借助花粉管通道法转化外源基因的遗传转化策略是可行的，并使得外源基因在转基因后代植株中遗传表达，为线性基因片段直接转化体系的建立奠定了坚实的基础。（4）线性1Dx5转基因小麦后代中外源基因的检测和分析：通过建立Multiplex PCR体系和运用SDS-PAGE技术对转1Dx5基因小麦后代进行了检测和分析。结果显示，Multiplex-PCR能够扩增出转基因T0代材料中1Dx5基因的特征片段，大小为320bp和343bp，表明外源基因已整合到受体基因组中；SDS-PAGE检测到新蛋白质亚基X，表明外源基因的插入引起了转基因T1代籽粒中HMW-GS组成的变化，获得安全型的转基因植株，建立了基于基因捕获原理的安全型遗传转化体系，为利用优质基因改良小麦品质和培育适合新疆盐渍化条件下种植的安全型转基因小麦新种质探索新途径。
参考文献：
[1]. 基因枪介导转化的外源基因表达框和质粒在水稻中遗传和表达行为的比较研究[D]. 赵艳. 浙江大学. 2003
[2]. 基因枪法和农杆菌介导二穗短柄草（Brachypodium distachyon）成熟胚愈伤组织的遗传转化[D]. 吴雪莉. 南京农业大学. 2009
[3]. 植物抗病抗逆相关基因表达载体的构建[D]. 杨海洋. 华中农业大学. 2013
[4]. 外源基因转水稻的途径、遗传行为和表达[J]. 颜美仙, 黄大年, 钱前. 中国稻米. 2008
[5]. 几丁质酶基因（Tch）转化水稻抗病新材料的研究[D]. 关峰. 吉林农业大学. 2012
[6]. 水稻Pib启动子中乙烯和茉莉酸响应元件的转基因分析[D]. 余丽. 南京农业大学. 2009
[7]. 人参皂苷合成关键酶βAS基因转化水稻的研究[D]. 郭明殊. 福建农林大学. 2010
[8]. 乙型肝炎新型植物口服疫苗的研究[D]. 钱炳俊. 复旦大学. 2007
[9]. 果聚糖合成酶基因在烟草和小麦中功能分析[D]. 别晓敏. 中国农业科学院. 2011
[10]. 面包烘烤品质基因1Dx5在冬小麦新冬-26中的遗传转化及后代检测[D]. 周继阳. 新疆师范大学. 2012
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