孙敬锋[1]2001年在《一个潜在的可区分猪瘟兔化弱毒和野毒方法的探索》文中研究指明本研究用反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对广西部分猪场的健 康猪扁桃体材料以及流产胎儿和死胎中的猪瘟病毒闭（HCV）进行检测，试验 所用引物为成熟的引物A_1/A_2，它对所有的HCV都可扩增。检测结果，70 份健康猪扁桃体材料中阳性11份，阳性率达15.7％，52份流产胎儿及死胎 中检测阳性9份，阳性率达17.3％。由此表明，广西区内猪场中有比较严重的健康带毒情况以及猪瘟病毒是引起猪繁殖障碍的重要病原之一。 在此基础上，我们根据中度保守的E_2基因设计了两对引物EP_1/EP_4、 EP_2/EP_3（暂定名为非通用引物），用这两对引物对上述检测过的阳性材料以 及病猪的带毒阳性材料、HCLV、石门强毒进行RT-PCR扩增。实验中用这 两对引物对19份阳性病料（其中有10份为发病猪材料）进行扩增，结果全部 没有扩增出特异性核酸带，而HCLV和石门株则可以扩增出特异性核酸带。 接着我们用限制性片段长度多态性分析法（RFLP）对19份阳性材料、HCLV 和石门毒的引物A_1／A_2的PCR产物进行分析，发现HCLV、石门强毒和广西 流行野毒非结构蛋白基因P_120的RT-PCR扩增产物中均有RsaI的一个的识 别序列，但HCLV和其他毒株的识别序列所在位置不同。本实验研究表明， 用引物A_1／A_2、EP_1／EP_4、EP_2／EP_3和RFLP分析技术可把兔化弱毒和流行野毒 区分开来，而且应用非通用引物进行区分猪瘟兔化弱毒和流行野毒更为方便、 易行，这将对预防猪瘟起到十分重要的作用。
胡慧[2]2004年在《猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究》文中研究表明本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由4部分构成：1.应用RT-PCR和nPCR扩增了7株国内近期流行的CSF野毒E2基因，分别克隆于pGEM-T Easy载体，对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导，同时将其与C株，Alfort株，Brescia株进行了同源性比较及遗传进化分析，并构建了CSFV的遗传发生树。结果表明，7株流行野毒与C株，Alfort株，Brescia株核苷酸序列同源性分别为91.6%～94.5%，89.2%～92.7%和85.9%～89.3%，氨基酸同源性分别为91.2%～95.8%，88.9%～92.0%和84.0%～90.1%；而7株野毒之间的差异很小，其核苷酸序列同源性为95.8%～99.7%，氨基酸同源性为96.3%～99.1%。所绘制的遗传发生树分为2个组群，所测得7株流行野毒均属于第1群，而且可分为两亚群，与C株和HCLV株都在同一亚群。表明现行猪瘟病毒流行株的变异呈现一定的多样性，并不尽向远离疫苗株的方向变异，现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。2.应用RT-PCR技术对中国猪瘟兔化弱毒株，经典强毒株石门毒株(Shimen)，近期地方流行的属于第一群毒株的新疆毒株(XJ)和第二群代表毒株甘肃临洮(LT)株E2基因的主要抗原区(包括A，B，C，D在内)进行扩增，均得到约561bp的基因片段。将这4个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，且阅读框正确，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳，Western-blotting和薄层凝胶扫描分析表达的蛋白。结果表明，E2基因的主要抗原区可以在大肠杆菌中表达，表达的蛋白多以包涵体形式存在，表达产物的分子量约为50kDa(目的基因的蛋白分子质量为21.7kDa，载体GST分子质量为29kDa)，与理论推测的蛋白分子量一致；薄层凝胶扫描分析表明，表达蛋白约占菌体蛋白总量的20%～30%；经Western-blotting证明，表达的E2蛋白可被猪瘟阳性血清所识别，表达蛋白可用于基因工程诊断抗原。3.C株和LT株E2基因主要抗原区在pGEX-4T-1表达载体中表达产量较高，但是都以包涵体形式存在，必须经过复性才具有生物学活性。收集诱导表达的菌液，超声波破碎分离包涵体，尿素和Triton X-100分别洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白。SDS-PAGE分析电泳结果表明，尿素和Triton X-100可洗去部分杂蛋白，8mol/L尿素能很好的溶解包涵体，回收率较低约10%，其纯度可达70%。ELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白相比，纯化蛋白与CSFV阳性血<WP=6>清反应的特异性提高20倍左右。可以批量生产基因工程诊断抗原来取代全病毒抗原；有望进一步研制针对E2的单克隆抗体，为CSF的诊断提供先进的技术。4.用纯化的猪瘟病毒重组E2蛋白作为抗原包被酶标板，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法，并确定了ELISA最佳工作条件：C株和LT株抗原包被浓度分别为8.7μg/mL和11.7μg/mL，37℃放置1h后，再4℃过夜，猪瘟阳性血清(1∶160)在37℃作用1h，二抗(1∶800)37℃作用1h，底物溶液37℃显色15min。通过重复性试验，交叉试验，特异性试验和稳定性试验等试验结果表明该方法重复性好，特异性强，灵敏度高；与用猪瘟全病毒为抗原的ELISA试剂盒，间接血凝试剂盒比较，特异性为97.14%，敏感性为93.18%，两者的符合率为95%，经统计学分析，这两种检测方法的检验结果无显着性差异(P>0.05)。用已建立的方法检测临床血清样本148份，总阳性率为68.91%。本研究结果为猪瘟诊断方法的标准化提供了实验基础，为猪瘟的诊断与监测提供一种良好的技术手段。
张朝红[3]2007年在《猪瘟四种实验室诊断方法的比较研究》文中提出猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的严重威胁养猪业的病毒性疾病,世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类动物传染病,我国也将此病列为一类动物疫病。2005年发布的新版《陆生动物卫生法典》将猪瘟列入OIE规定必须通报疾病名录。在猪瘟的诊断方面,由于猪瘟病毒不同毒株的毒力不同,患病猪的临床症状和死后剖检的病理变化差别很大,根据临床表现和病理变化很难对猪瘟做出确诊。因此,建立准确的实验室诊断方法,对于预防和控制猪瘟有重要意义。本研究对分别应用病毒分离鉴定、荧光抗体法、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和夹心ELISA 4种方法对23份猪瘟病料组织中的猪瘟病毒进行诊断了比较研究,获得了以下结果:1.采取猪瘟阳性血清提取IgG,标记荧光素,制备了猪瘟荧光抗体。该荧光抗体能够检测感染猪瘟病毒的细胞和猪瘟病料中的病毒抗原。用制备的荧光抗体分别检测感染猪瘟病毒的PK-15细胞和猪瘟病料组织的猪瘟病毒,结果均为阳性,空白对照均为阴性。说明制备的猪瘟荧光抗体可以用于病料中和PK-15细胞中猪瘟病毒的检测,采用直接荧光抗体法可确定病毒在感染细胞中增殖的位置,为猪瘟的实验室诊断提供了实用技术。2.建立了猪瘟病毒的RT-PCR检测方法,该方法的优点是,检出率高、准确性好;检测时间较短,一般可在拿到病料后4～6 h得出结果;并且扩增出的E2基因目的片段可以作为研究猪瘟病毒分子流行病学的基础材料,通过测定不同病料中E2基因的序列,来了解猪瘟病毒的变异并推断其流行趋势,具有重要意义。3.本研究利用4种不同的方法检测相同病料中的猪瘟病毒,结果表明,猪瘟病毒的分离鉴定和RT-PCR检测结果一致;而荧光抗体法检测结果不很理想,存在无法判定结果的样品;夹心ELISA法除了一份病料因保存不当造成假阴性结果外,其余病料的检测结果均与病毒分离鉴定结果一致。所以,在有条件的实验室,可采用RT-PCR进行猪瘟病毒检测,该法操作起来要比病毒分离鉴定方便许多,且不受细胞培养的限制,可应付突然的大量的样品检测;在对新鲜病料中的猪瘟病毒进行检测时,可以选用夹心ELISA法,该法操作更简便,易在基层推广,可作为猪瘟普查时的首选方法。
陈宁[4]2009年在《携带流行毒株E2基因的重组猪瘟病毒C株的拯救与鉴定》文中研究表明猪瘟(Classical swine fever, CSF)是严重危害养猪业的传染病之一,具有高传染性和高致病性的特点。其病原为猪瘟病毒(CSFV),属黄病毒科瘟病毒属成员。CSFV是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组长约12.3kb。囊膜糖蛋白E2具有良好的免疫原性,可诱导机体产生中和抗体并对强毒的攻击提供保护。E2在病毒感染过程中也起着重要作用,与病毒吸附,侵入宿主细胞,细胞嗜性和毒力强弱有关。新近研究表明,在CSF流行地区,其症状呈现非典型化,甚至在免疫猪群中也有发病；CSFV流行毒株已经从以前的group 1转向group 2。有迹象表明我国目前使用的group 1兔化弱毒C株疫苗对group 2 CSFV流行毒株难以提供有效保护。本项目的是：(1)建立猪瘟病毒疫苗株和野毒株的鉴别RFLP技术体系；(2)分析我国浙江地区CSFV流行情况；(3)比较CSFV当前流行毒株与早期group 1强毒株和兔化弱毒C株在体外生长特性、囊膜糖蛋白E2的分子变异特征与抗原多样性方面的差异；(4)应用反向遗传学技术,构建基于兔化弱毒C株和携带目前流行毒株E2基因的重组病毒,为开发针对流行毒株的新型标记疫苗奠定基础。1、猪瘟病毒疫苗株和野毒株的鉴别RFLP技术在CSFV-E2基因的上、下游保守区域分别设计两对简并引物用于套式RT-PCR检测。结果表明,该体系具有很好的特异性和灵敏性,检测下限为1400拷贝数的CSFV基因组。根据不同毒株E2基因中MspⅠ酶切位点排布的不同,建立了鉴别检测疫苗株和野毒株的RFLP方法。应用此方法对2003-2008年浙江地区猪场采集的309份组织样品进行CSFV检测,结果发现91份样品能扩增出CSFV特异性条带,阳性PCR产物经MspⅠ酶切,22份样品中含有疫苗株；60份为野毒感染,其余9份能同时检出疫苗株与野毒株。选择4种限制性内切酶BglⅠ, DdeⅠ, DraⅠ和PstⅠ分别对38株流行毒株的E2基因进行酶切,流行毒株可被分为11个不同的RFLP亚型。以上结果表明,浙江地区存在CSFV的流行,且流行毒株在E2基因水平上存在较大差异。2、猪瘟病毒经典强毒株和流行毒株在PK-15细胞和ST细胞中的生长特性比较比较了两个流行毒株(QZ-07和HZ1-08)和石门株在PK-15和ST细胞中的生长特性。强毒石门株在PK-15细胞中的增殖效率明显高于其在ST细胞。在感染PK-15 48h后,滴度可达到107TCID50/ml,而在相同时间,在ST细胞中只能达到105.25TCID50/ml。而两流行毒株在PK-15细胞中的增殖水平明显低于ST细胞,尤其以HZ1-08更为明显。在ST细胞感染的48h后,HZ1-08的滴度可达到105TCID50/ml,而在PK-15细胞中滴度只有102.75TCID50/ml。IFA检测结果同样表明,在感染48小时后,石门株感染的PK-15细胞均为阳性,而HZ1-08只有零星几个荧光斑。虽然叁个毒株在感染不同阶段,ST细胞内病毒滴度基本一致,但石门株在增殖过程中释放于上清中的病毒滴度明显高于两个流行毒株。细胞内外感染性病毒粒子的比例在一定程度上可以判断病毒毒力的强弱,根据以上体外生长特性可以初步推断两个流行毒株不属于强毒株。3、猪瘟病毒流行毒株的全基因组比较和基于E2基因的分子变异特征分析对弱毒C株、石门株和分离株QZ-07进行了全基因组测序,结合从GenBank中下载的22个CSFV的全基因组进行遗传进化关系分析。结果表明,25个毒株可以分为两个分支,C株和石门株处于一个分支,而QZ-07位于遗传关系较远的另一个分支。同义突变与非同义突变以及熵值分析结果表明,CSFV多聚蛋白的前1／3编码区(包括病毒的结构蛋白在内的区域)比后2／3编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白区域变异性大,3个结构蛋白和非结构NS5A比较高变,而NS3、NS4B和NS5B相对保守。我们进一步对2004-2008年内流行于浙江地区的34株CSFV囊膜糖蛋白E2的分子变异特征进行深入分析。结果表明,流行毒株属于group 2,除了2004年的一株病毒属于subgroup 2.2以外,其余毒株均属于subgroup 2.1,且都归于genotype 2.1b。而目前使用的疫苗C株属于group 1中的subgroup 1.1。全长E2的核苷酸和氨基酸序列比较结果表明,流行毒株之间核苷酸的同源性在94.6%-99.8%之间,氨基酸的同源性在94.9%-99.7%之间。与C株相比,核苷酸的同源性在81.6%-82.6%之间,氨基酸的同源性在87.4%-89.3%之间。同义突变与非同义突变以及熵值分析结果表明,在E2蛋白中,N端抗原区域的变异程度大于C端,抗原区内鉴定的2个高变区中与抗体相互作用的关键氨基酸位点处于正选择压力,且流行毒株与疫苗株在这些位点上差异很大。4、猪瘟病毒C株E2蛋白单克隆抗体的研制与鉴定为了进一步探索E2蛋白N端高变区域内与抗体识别相关的一些关键氨基酸位点差异对不同毒株抗原结构的影响,我们以C株E2为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤技术结合IFA筛选,获得了3株持续、稳定分泌小鼠抗E2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E7、2B6和6B8。免疫印迹和ELISA鉴定结果表明,只有2B6能与变性的E2蛋白反应。E2蛋白N端的6个Cys残基通过相互形成二硫键对维持抗原区域的构象起到关键作用,任何Cys残基的突变将影响相应抗体对该区域的识别。我们通过真核细胞表达不同Cys突变的重组E2以鉴定不同单抗的识别区域,发现1E7和6B8识别位于抗原区域B／C中的构象表位,而2B6能与所有Cys突变的E2蛋白反应,进一步证实该单抗识别的是一线性表位,因此不受E2抗原区域二级结构的影响。应用上述单抗进行流行毒株E2抗原多样性分析,结果表明：单抗2B6识别的抗原表位只存在于group 1毒株中；而单抗1E7和6B8除了不能与LS-05和QZ2-06毒株E2发生反应(因为这两个毒株Cys737突变为Arg,破坏了B／C抗原区的构象),与大部分毒株(8／10)均能发生反应。但是1E7和6B8与流行毒株的反应性比group 1毒株要弱。5、携带流行毒株E2基因的重组猪瘟病毒C株构建与鉴定鉴于流行于我省的CSFV毒株的E2蛋白分子进化特征及抗原多样性,特别是与疫苗毒株C株相比存在较大差异,可能影响疫苗的免疫保护效力。因此,我们建立了CSFV-C株的反向遗传学操作系统,结合分子流行病学研究结果,构建了基于C株、携带流行CSFV毒株E2基因的重组病毒。首先,我们对覆盖CSFV-C株基因组的6个cDNA片段按一定的策略依次克隆于改造的低拷贝质粒,并插入于T7启动子下游,构建了C株的感染性克隆pA-FL22。以线性化的pA-FL22为模板,体外转录的RNA转染细胞后,荧光定量PCR和IFA检测结果表明,转录的RNA在ST细胞中的复制、翻译水平明显高于PK-15。获得的子代病毒FL22注射家兔,产生与亲本毒株C株相同的体温反应,脾脏肿大。作为遗传标记的NcoⅠ位点在子代病毒体内外复制增殖过程中能稳定遗传。在此基础上,构建并拯救了携带石门毒株和流行毒株HZ1-08的E2抗原区域(870bp)的重组病毒FL22-SM-E2和FL22-HZ-E2。两个重组病毒能够通过上述建立的MspⅠ酶切方法与C株相区别,而且重组病毒FL22-HZ-E2还能通过与C株E2单抗反应性的不同与C株相区别。因此,本试验建立的CSFV感染性克隆与重组病毒拯救体系是成功的。总之,本研究深入探索了目前流行于浙江地区CSFV-E2的分子变异特征,初步探明了它们与疫苗株在抗原结构上的差异,建立了CSFV野毒感染和疫苗毒株的鉴别检测和分型技术体系,特别是CSFV感染性克隆的构建与重组病毒拯救体系的成功建立为新型标记疫苗的开发,CSFV的复制机制和致病机理的深入研究奠定了良好基础。
周斌[5]2010年在《假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究》文中研究指明猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是一种由猪瘟病毒(Classical Swine Fever virus, CSFV)引起的急性、热性和高度接触性的传染病,流行广泛,发病率高、死亡率高,危害极大,给世界和我国的养猪业造成严重经济损失。其特征为发病急,高热稽留和微血管壁变性、引起全身泛发性小点出血、脾梗死等。世界动物卫生组织(OIE)将本病列入A类法定的传染病,并规定为国际重点检疫对象。在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。在进行对于猪瘟等致病性和传染性很强的病毒,操作活毒都会面临着高风险,假病毒技术是一种非常有效的研究手段。假病毒是指一种反转录病毒的囊膜糖蛋白被另外一种病毒的囊膜蛋白所置换,而基因组仍保持反转录病毒本身的特性。因为其仅能引起单循环感染(复制缺陷型),作为研究病毒的侵入模型是非常安全的,便于研究病毒的侵入机制、组织嗜性、中和抗体分析以及受体的鉴定等。另外,虽然世界上多采用疫苗免疫来控制猪瘟的流行,但是免疫失败或免疫无效现象常有发生,因此探索新的行之有效的抗病毒策略已经成为当务之急。衣壳蛋白靶向性抗病毒灭活(capsid-targeted antiviral inactivation; CTVI)是近年来兴起的基于胞内免疫的抗病毒策略,其基本原理是在病毒的组装过程中将特定的核酸酶引入到病毒颗粒内部,破坏病毒基因组,从而达到灭活子代病毒的目的。因此本研究构建了猪瘟病毒囊膜糖蛋白的假病毒体系,应用该体系研究了囊膜蛋白对猪瘟病毒侵入细胞的重要性,鉴定了病毒感染的宿主细胞谱；并建立了可替代活病毒在操作上更安全的猪瘟病毒中和试验技术平台,利用该技术平台对临床免疫囊膜糖蛋白E2的B细胞表位亚单位疫苗免疫猪群进行了中和抗体检测。同时,利用CTVI原理,构建了猪瘟病毒衣壳蛋白(Cap)与葡萄球菌核酸酶(SNase)的融合蛋白的PK-15细胞系,通过IFA、Q-PCR和ELISA证明稳定表达融合蛋白的细胞系可以抑制猪瘟病毒的增殖。论文的主要研究内容如下：1.猪瘟病毒囊膜糖蛋白的克隆及其在293T中的表达通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增了猪瘟病毒(CSFV) Shimen株囊膜糖蛋白E0、E2和E012叁个完整的阅读框基因并进行了克隆与序列鉴定,分别将其插入真核表达载体pcDNA3.0,构建了重组真核表达质粒pcDNA-E0, pcDNA-E2和pcDNA-E012。将此3个质粒经大量提取并纯化后,经磷酸钙转染人胚肾细胞(293T)。采用兔抗猪瘟高免血清为一抗,FITC-SPA为二抗,分别应用流式细胞术(FACS)和免疫转印(Western blot)鉴定真核质粒在293T细胞中的表达。结果表明3个质粒均可在293T细胞中表达,Western blot检测分析到了25.7、41.5和90kDa的3个条带,FACS检测到荧光细胞比例分别为60.2%、55.2%和56.5%。说明囊膜糖蛋白E0、E2和E012均能表达在细胞膜上,为后续假病毒颗粒的形成奠定了基础。2.构建整合囊膜糖蛋白的假型猪瘟病毒体系及其鉴定将上述已经鉴定的重组真核表达质粒pcDNA-E0, pcDNA-E2和pcDNA-E012分别与MuLv假型病毒构建体系的两种骨架载体pHIT60(包括MuLV的结构蛋白基因,即gag和pol)和pHIT111(为MuLV的基因组,还包括一个报告基因LacZ)经磷酸钙瞬时共转染293T细胞,48h后收集假病毒上清,超速离心后纯化假病毒颗粒。用抗CSFV的多抗为一抗,通过Western blot证明了整个囊膜糖蛋白E012能够在假病毒颗粒表面表达,说明E012能够整合到MuLv病毒粒子表面,该假型猪瘟病毒感染SK6、PK-15、ST、BHK21、Vero、COS7、293T和CEF等8种细胞,48h后检测发现只有在猪源细胞SK6、PK-15和ST中标记基因Lac Z能有效表达,表明所构建的假病毒具有感染性,但只能够感染猪源细胞。因此通过该假型猪瘟病毒进一步证实了猪瘟病毒对猪的单一嗜性。另外,纯化后的病毒经Reed-Muench计算其TCID50为104.58。加入各种浓度的NH4Cl(0～30 mmol/L)预先处理PK-15细胞,37℃温育1h,而后加入MuLV-E012作用,48h后,检测Lac Z.表达量；同时设pH依赖性的MuLV-VSV-G为阳性对照。实验结果表明MuLV-E012感染性与NH4Cl浓度存在极显着的线性负相关性,即随着pH值的升高,假型病毒MuLV-E012对PK-15细胞感染能力逐渐降低,而当NH4Cl浓度达到30 mmol/L时MuLV-E012进入宿主细胞几乎被完全抑制。因此通过假型猪瘟病毒证实了猪瘟病毒侵入细胞是受到pH影响的,即是pH值依赖型囊膜病毒。为避免操作活的病毒带来的搞危险性,本研究利用假型猪瘟病毒建立了微量中和试验。标准阴阳性血清和倍比稀释的待检血清56℃灭活30min后,对每份血清进行2倍梯度稀释,分别与假病毒MuLV-E012按1：1混合,4℃过夜。分别取100-tL上述病毒血清混合物一式3份加到96孔板PK15细胞中,建立了微量中和试验,与全病毒微量中和试验进行了比较,实验结果表明所建立的方法能够代替全病毒进行血清中和抗体滴度的测定,能够检测临床血清的猪瘟抗体中和效价。3.假病毒微量中和试验评价CSFV E2 B细胞表位亚单位疫苗免疫效果本研究目的是将E2的B细胞表位a(aa844-865)和b(aa693-716)串联和单独原核表达后研制亚单位疫苗,通过上述建立的假病毒微量中和试验评价亚单位疫苗的免疫效果,鉴定联合表位的优越性。实验优化了含有重组质粒(pET-rE2-a、pET-rE2-b和pET-rE2-ba)的BL21 (DE3)大肠杆菌的表达条件,将重组工程菌(BL21-rE2-a、BL21-rE2-b和BL21-rE2-ba)大量诱导表达,通过His-Bind螯合层析柱纯化融合蛋白,经SDS-PAGE和薄层扫描分析,结果表明：融合蛋白rE2-a, rE2-b和rE2-ba获得了较好的纯化。用猪抗CSFV阳性血清为一抗,HRP-SPA为二抗,DAB显色表明分别在22、22和25 kDa处出现明显条带,与预期大小相符,证实表达纯化的蛋白rE2-a、rE2-b和rE2-ba有良好的抗原性。将此3个重组蛋白分别与SEPPIC 206 VG白油佐剂进行乳化后免疫6周龄猪瘟抗体阴性的叁元商品仔猪,间隔2周再疫1次。2免后3周所有实验组用200TCID50的猪瘟石门株进行动物攻毒实验。各组仔猪在初免后间隔7d采血,应用假病毒微量中和试验检测血清中和抗体水平。实验期间,观察攻毒后各组临床症状、发病率、死淘率和保护率,每天测量实验猪的肛温。动物实验结果表明：3个重组蛋白rE2-a (A组)、rE2-b (B组)和rE2-ba (C组)均能诱导仔猪产生中和抗体水平,在攻毒后4周,中和抗体分别达到64、128和256；而疫苗组(D组)为128。重组蛋白组的保护率分别达到80%、100%和100%,D组也达到100%,因此说明B或C组产生的中和抗体达到或超过D组,免疫保护率可以与D组相当。攻毒后,A-C组的仔猪仅出现轻微的发热,但是持续时间不长,几乎全部健活；仅A组1头仔猪在发热过程中因为受到细菌继发感染,其死亡剖检发现有轻微的猪瘟病变,说明A组保护率欠缺。空白对照组(E组)的仔猪没有中和抗体产生,出现明显的猪瘟临床症状,攻毒后3周全部死亡。该结果为猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2 B细胞表位亚单位疫苗的临床应用奠定了基础。4.构建稳定表达CSFV Cap蛋白和SNase融合蛋白的细胞系猪瘟病毒为有包膜的RNA病毒,位于病毒颗粒内部的衣壳蛋白与病毒的RNA结合构成病毒的核衣壳,因此我们可以考虑利用CTVI的原理,构建猪瘟病毒衣壳蛋白(cap)与葡萄球菌核酸酶(SNase)的融合蛋白,用于抗猪瘟病毒感染的研究。根据猪瘟病毒核衣壳蛋白(cap)基因序列设计一对引物,RT-PCR扩增获得编码Cap基因的完整阅读框,将其插入到含有金黄色葡萄球菌核酸酶(SNase)基因的真核表达载体pcDNA-SNase中,筛选获得重组质粒pcDNA-Cap-SNase.测序鉴定后,脂质体转染猪肾细胞(PK-15),经终浓度1000μg/mL的G418稳定筛选,建立稳定表达Cap-SNase融合蛋白的细胞系(PK-15/Cap-SNase)。通过RT-PCR、蛋白免疫印迹(Western blot)和间接免疫荧光(IFA)鉴定Cap-SNase融合蛋白的表达,通过体外消化线性阳性质粒DNA对核酸酶活性进行检测。实验结果表明：建立的PK-15/Cap-SNase细胞系可以稳定表达融合蛋白Cap-SNase,该融合蛋白能够被兔抗核衣壳蛋白抗体所识别,并且具有良好的核酸酶活性,能够对线性阳性质粒DNA进行切割。因此,该细胞系的建立为CTVI策略抑制猪瘟病毒的增殖和感染奠定了基础。5.应用衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究将猪瘟病毒Shimen株感染PK-15/Cap-SNase细胞系后,应用间接免疫荧光(IFA)、荧光定量PCR和ELISA方法鉴定CTVI系统抑制猪瘟强毒的增殖效果。实验结果表明,CTVI能有效抑制病毒的繁殖。IFA鉴定病毒感染5d后PK-15/Cap-SNase细胞中产生的子代病毒滴度与正常PK-15细胞相比较下降了102倍,6d后产生的子代病毒滴度与正常PK-15细胞相比较下降了103倍；real-time PCR分析表明,阴性对照正常PK-15细胞无明显的抑制作用,与而稳定表达融合蛋白Cap-SNase的细胞株在病毒进入的3天出现明显的抑制,接种后6天抑制趋向平稳,在第8天抑制率达到78%,差异显着。应用美国IDEXX CSFV Ag ELISA Kit的检测结果：PK-15对照细胞呈现强阳性,而PK-15/Cap-SNase细胞系的ELISA光吸收度数值明显低,呈现弱阳性。因此本研究表明PK-15/Cap-SNase细胞在不同程度上抑制了猪瘟病毒粒子的增殖。这些结果为进一步将衣壳蛋白靶向病毒灭活策略应用于抵抗猪瘟病毒感染奠定了基础。
孔鹏[6]2006年在《猪瘟地方流行株（BJCY/96）的全长ORF测序及E0基因的分段表达》文中研究指明本研究试图从分子生物学角度来揭示目前猪瘟仍频繁发生的原因，为广泛开展CSFV分子流行病学的研究提供基础资料，为CSF的防制提供科学依据和理论支持，为猪瘟诊断提供稳定的标准诊断抗原及诊断方法。本论文由2部分构成： 1．应用RT-PCR扩增了一株国内地方流行的CSF野毒全长ORF基因，对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导，同时将其与C株、Alfort株、HCLV株和SM株进行了同源性比较及遗传进化分析，结果表明，地方流行野毒株与C株，Alfort株，HCLV株，SM株核苷酸序列同源性分别为95.8％、97.9％、95.7％和99.7％；氨基酸同源性分别为97.4％、98.7％、97.5％和99.7％。本次实验所测得序列与石门标准强毒株核苷酸同源性很高，与我国使用的疫苗株(HCLV)核苷酸同源性和C株则同源性大大降低，说明某些猪瘟病毒流行株的变异已经开始向远离疫苗株的方向变异，推测现行的猪瘟疫苗对某些地方流行株的保护作用可能已经降低。 2．应用RT-PCR技术对疫苗株(HCLV)、经典强毒株石门毒株(SM)EO基因分段进行扩增，得到约198bp、238bp、343bp的基因片段。将这3个基因分别克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，且阅读框正确，从而构建成重组表达载体。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳，Western-blotting分析表达的蛋白。结果表明，EO基因几个片段均可以在大肠杆菌中表达，表达的蛋白以包涵体形式存在，表达产物的分子量约为36kDa、38kDa、42kDa(载体GST分子质量为29kDa、融合表达)，与理论推测的蛋白分子量一致；在Western-blotting实验时，表达产物经SDS-PAGE电泳后，转移至NC膜上，在加一抗时选用不同的血清(SM毒攻毒后采集的猪阳性血清和HCLV株免疫后采集的血清)，进行交叉免疫学反应。表达产物pGEX-X、pGEX-Y和pGEX-Z以SM株为模板；pGEX-E、pGEX-F和pGEX-G以HCLV株为模板。结果表明SM阳性血清和HCLV阳性血清对pGEX-Y和pGEX-F片段(317—398AA)表达蛋白都可以发生反应。SM阳性血清与pGEX-X和pGEX-E片段(268—333AA)、pGEX-Z和pGEX-G片段表达蛋白(390—494AA)均可发生发生反应。而HCLV阳性血清只与pGEX-E和pGEX-G发生反应因为表达的重组蛋白可被猪瘟阳性血清所识别，表达蛋白可用于基因工程诊断抗原。
韩雪清[7]2002年在《猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究》文中提出针对频繁出现的弱毒疫苗免疫失败现象和免疫猪群持续带毒等猪瘟(CSF)防制中的重大问题，本项研究从病毒的分子水平入手，试图从病毒分子变异水平以及当前流行毒的分子差异程度澄清原因，并针对CSF的持续感染研制出高效安全的基因工程标记疫苗和诊断试剂，为彻底消灭CSF提供科学依据和技术支撑。主要研究内容包括： 1．猪瘟病毒主要免疫原E2基因的序列分析：利用反转录PCR(RT-PCR)及套式PCR(nPCR)方法扩增了中国猪瘟兔化弱毒株(C株)兔脾组织毒保护性抗原E2(gp55)基因，成功地将其克隆并测定核苷酸序列，与国内外已发表的猪瘟病毒(CSFV)E2基因序列比较的结果是：C-株兔脾毒与C-株细胞(SK6)毒、C-株疫苗(犊牛睾丸细胞，CSFV-C)毒CSFV-SM株(石门)毒、Bresia株(荷兰)毒、Alfort株(德国)毒的E2核苷酸序列同源性分别为98.87％、98.34％、94.58％、91.00％、80.78％；氨基酸同源性分别为98.95％、97.37％、94.22％、91.60％、89.23％。对C-株兔脾毒与C-株细胞毒、经典强毒E2上的A、B、C叁个中和性抗原区的氨基酸组成进行了比较，其结果为：C-株兔脾毒与C-株疫苗细胞毒的差异很小甚至没有差异。 2．猪瘟病毒分子流行病学分析：利用RT-PCR及nPCR扩增并测定了我国近期(1997～2001年)12个省的51株流行野毒株的E2基因核酸序列。通过序列比较和系统发生关系分析发现：C-株兔组织毒、C—株细胞毒和中国50～60年代流行的石门强毒株同属于组群1(Group 1)；近期猪瘟流行毒株均属于组群2(Group 2)的两个不同的亚组群(Subgroup2.1和2.2)，表明我国目前流行毒株至少有2个亚组群。流行毒株与疫苗毒株有较大的差异(E2全基因核苷酸序列同源性82.2％～84.3％)，表明猪瘟流行毒株已远离疫苗毒株的方向演变，明确了我国CSF流行趋势及我国CSFV在世界SCFV大系谱中的位置，并为基因工程疫苗的研究提供了基因储备。 3．猪瘟病毒E2基因的真核表达：分别将CSFV两个代表株的E2基因克隆入毕赤酵母(P.Pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，酶切线型化后电穿孔导入P.Pastotis进行整合，经G418筛选得到25个高拷贝转化子，经DNA斑点试验和DNA测序证明外源基因E2稳定地整合到P.Pastoris染色体中。经甲醇诱导表达后，SDS-PAGE和Western blot结果证明了P.Pastoris培养上清液中含有正确糖基化的E2蛋白，表达量约250mg/L。重组P.Pastoris经连续培养8代仍可分泌特异性蛋白。免疫活性研究证明P.Pastoris表达的E2蛋白能刺激动物产生1：128～1：256猪瘟病毒的抗体。有望用于基因工程亚单位疫苗的研制。 4．猪瘟病毒E2基因的密码子改造优化：低利用率密码子的数量和分布是影响外源基因有效表达的参数之一，优化密码子序列能够提高外源基因的表达。利用PCR基础上的定点突变方法对猪瘟病毒E2基因的24个密码子进行优化。优化后的E2基因转化P.Pastoris菌，甲醇诱导表达。诱导培养上清的SDS-PAGE和Western blot分析显示，E2蛋白在P.Pastoris中得到了高效的表达，表达量约1.08g／L。这表明对E2基因上低利用密码子的改造是成功的， 猪瘟病毒EZ基因遗传变异及体外表达研究为进一步大规模生产打下了基础。5．毕赤酵母高效表达的培养条件探索：用PPastoris系统表达外源基因，对于不同的外源蛋白，表达量千差万别。除外源基因序列本身的内在特性起着很重要的作用外，表达条件对表达量高低的影响也极其显着。分别在不同时间、不同诱导型、不同pH、不同诱导剂量方面进行了较系统的对比：经不同时间表达，表明72小时蛋白可达峰值；采用抑制／诱导方式会提高表达量；表达EZ蛋白pH最佳值在7．5—8刀；最佳甲醇诱导量是2％～3％；得到了一套较完善的在PPastoris中表达CSFV EZ基因的条件，以供在规模化发酵罐中表达EZ基因蛋白生产亚单位疫茵。6．猪瘟病毒EZ基因的原核表达：PCR扩增出当前猪瘟流行野毒株，中国猪瘟兔化弱毒（C－株）兔脾组织毒EZ基因的主要抗原区，将其克隆到原核大肠杆菌表达载体PPROEX－HTb中诱导表达，经 SDS－PAGE检测表明，重组质粒能表达EZ基因主要区蛋白，Western blot检测表明，诱导表达蛋白与猪瘟阳性血清发生特异性反应，表达量为35％和38％，可用于基因工程诊断抗原。7．猪瘟病毒EZ基因的乳腺特异表达载体构建：将在乳腺细胞中特异分泌的信号肽序列连接到EZ基因，PCR得到了目的片段，再将pGFPCI载体上的Kana基因切下与在乳腺细胞中特异表达的P22载体连接，使其带有筛选标记，然后将带有信号肽的EZ插入到P22中，试图构建山羊乳腺上皮细胞的特异性表达载体。探索了构建的含目的基因的乳腺特异性表达载体调控成分的有效性，也为在体外培养的乳腺细胞中定位重组目的基因一体细胞克隆一动物乳腺生物反应器工作的开展作准备工作。
杨林[8]2005年在《猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用》文中研究表明猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种猪病毒性传染病,猪瘟兔化弱毒疫苗有效地控制了猪瘟在我国的急性发生和大流行。但自上世纪80年代以来,我国开始出现了温和、非典型性猪瘟。究其原因,可能与CSFV出现了新的变异株等因素有关。尤其是亚临床感染猪,依靠常规诊断方法很难确诊并剔除此类病猪,给CSF的防制工作带来新的困难。因此,有必要建立一种新的迅速、准确诊断CSF的实验室诊断系统,为在我国彻底消灭CSF奠定基础。 基因芯片(Gene Chip)是生物技术与电子芯片融合的结晶,是由固定于固相载体(如硅片、玻璃、塑料等)表面的核苷酸阵列构成的一种新型微型器件。由于其快速、微量、准确的应用优点,正在成为新一代的自动化医学检验工具。通过设计针对基因的探针,与被检测基因的碱基序列互补匹配,可快速、准确地检测到基因,用于疫病的诊断。 本研究采用以基因测序为基础的系统进化树分析方法,对黑龙江省部分地区猪瘟病毒流行株进行分离鉴定和E2基因序列分析,并与传统的石门强毒和猪瘟兔化弱毒在抗原基因上存在的变异进行比较。研究结果表明:病料为CSFV感染,CSF流行毒株和疫苗株在核苷酸和氨基酸序列上存在一定的差异,E2基因部分序列接近Alfort,与Brescia同源性最低。该试验从核酸和蛋白质水平上研究了黑龙江省部分地区猪瘟病毒流行株与其它标准毒株之间的同源性及其变异情况,揭示了在该省猪瘟流行的本质,为实施科学有效的猪瘟防制措施提供依据。 本研究通过RT-PCR扩增CSAV相当保守的NS基因作靶DNA制作芯片,将被检样品在PCR过程中用Cy-5标记,得到DNA产物与芯片杂交,达到检测CSFV的目的,建立CSF基因芯片诊断方法;同时通过研究不同靶探针浓度对检测结果的影响,确立最佳反应条件靶探针浓度为1 μg/μl;分析芯片诊断技术的特异性和敏感性等技术指标:与RT-PCR方法和间接荧光抗体试验方法进行比较,并开展了初步应用。本研究建立的CSFV基因芯片诊断技术,可以成功地检测到CSFV保守区基因,荧光信号清晰,敏感性利特异性高,实际应用效果奸,是一种检出率高的诊断方法。 总之,本研究将基因芯片技术应用于动物疫病的诊断,成功建立了CSFV基因芯片诊断技术平台,解决了CSF诊断中的难题,具有重大的理论意义和应用价值。为今后利用基因芯片开展动物疫病诊断和研究提供理论依据,也为控制和消灭CSF奠定基础。但要实现基因芯片在动物疫病方面的广泛应用,还要做更深入的研究。
田宏[9]2006年在《猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究》文中研究指明猪水疱病和猪瘟均被世界动物卫生组织(OIE)列入A类动物疫病。猪水疱病是一种急性传染病,该病的临床症状与口蹄疫及其它水疱性疾病相似,难以区分,从而妨碍了猪及猪产品的流通和国际贸易;猪瘟是一种急性烈性传染病,致病力强,危害严重。猪瘟弱毒疫苗对于控制猪瘟大流行虽然起到重要的作用,但使用弱毒疫苗后,难以区分疫苗免疫和野毒感染动物,不利于鉴别病猪。目前,国际上还没有预防猪水疱病的疫苗。研制安全高效并具有潜在标记的基因工程疫苗,将为控制猪水疱病和猪瘟探索新的技术方法。本研究通过一系列分子生物学技术制备了猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗,研究其免疫效果,为猪水疱病和猪瘟新型疫苗的研究探索一条可供参考之路。1.构建了猪水疱病结构蛋白P1区重组逆转录病毒载体(pBABE puro-P1),并与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293包装细胞,获得了包装完整的假病毒,测定滴度。假病毒经polybrene(8μg/mL)的介导使该假病毒感染靶细胞PK-15,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。间接免疫荧光显示PK-15细胞表达的P1衣壳前体蛋白能被猪水疱病病毒(SVDV)阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可从不同代次(分别选取第1,8,16代和30代)的阳性细胞中扩增到SVDV的P1基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。2.大量收获阳性细胞培养物,用弗氏佐剂乳化并免疫豚鼠。通过淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA和细胞中和试验,对制备的疫苗效力进行了评价。结果显示,与对照组相比,免疫组豚鼠的外周血淋巴细胞有明显的增殖;阻断ELISA结果表明,免疫组4号豚鼠从首免后的第3周开始出现特异性SVDV抗体,而其他的免疫组豚鼠也从免疫后的第4周开始的全面出现SVDV抗体;应用微量细胞中和试验对免疫接种后第4周、第6周及第8周采集的豚鼠血清中和抗体的滴度进行了检测。结果表明,免疫接种4周时,免疫接种组2号豚鼠的中和抗体为1∶8,其余均小于1∶8;免疫接种组从第6周开始,中和抗体滴度均达到1∶8,甚至超过1∶8,而空白对照组血清中和抗体始终全部小于1∶4。3.采用与猪水疱病类似的方法建立了表达猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白的细胞株。免疫荧光和ELISA显示,PK-15细胞表达的E2蛋白能被CSFV阳性血清所识别,表明所表达的蛋白具有良好的反应原性;PCR可扩增到不同代次(本次试验分别选取第1,10,20代和30代)阳性细胞基因中的E2基因,证明靶细胞可稳定的携带目的基因传代。4.大量收获表达产物,乳化并免疫家兔。通过T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA
闫红岩[10]2013年在《构建基因组分节段的猪瘟病毒石门株》文中认为猪瘟是由猪瘟病毒感染引起的出血性疾病，主要特征包括病毒侵染血管的凝固，血小板的减少，免疫抑制,是严重危害畜牧业生产的烈性传染病之一,被国际动物卫生组织(OIE)列入A类法定传染病，目前对猪瘟的研究大多集中于新型疫苗的研发和诊断方法的探索，但对于CSFV致病机理的分子机制仍不清楚。猪瘟是一种高传染性和致死性疾病，猪瘟的病原物猪瘟病毒属于黄病毒科瘟病毒属，它是单股正链RNA病毒，全长约12.3kb，包括5′、3′非编码区和一个开放阅读框，CSFV基因组首先翻译成1个多聚蛋白前体．前体聚蛋白在宿主和病毒的蛋白酶共同作用下被切割成为12个具有独立功能的蛋白，其中就包括8种非结构蛋白，4种结构蛋白。我国主要有两株重要的猪瘟病毒标准株，一株是强毒的石门株，分离于1945年，拥有良好的免疫原性。另一株是兔化弱毒株，国外称为C株，猪瘟兔化弱毒（Hog cholera lapinized virus,HCLV）免疫原性强，遗传性稳定，无残余毒力，被公认是最安全有效的猪瘟弱毒疫苗，因此，C株可以作为研究二价或多价疫苗的有效载体。尽管C株的安全性和免疫效力非常好，但是由于缺乏可利用的鉴别诊断方法，从而使得C株与野毒的抗体难以区分，这非常不利于猪瘟的彻底根除。欧盟至今奉行不接种政策。逆转录遗传学的发展使人类对于正链RNA病毒的研究取得了重大突破。RNA体外转录是反向遗传技术的基础，但传统方法获得的正链RNA病毒全长CDNA克隆需要在体外转录成RNA才能进行转染实验，转录过程中易造成RNA降解，加之RNA的不均一等许多因素都会影响后续试验结果。且体外转录RNA与病毒自身RNA相比感染性较低。本研究以猪瘟病毒石门株为实验材料,在原猪瘟病毒石门株全长CDNA克隆的基础上在病毒全长基因组3′端引入了丁肝核酶核心序列（HDV）及T7终止子序列，获得重组质粒pMC18-CSFV-SM-HDV-T7，使在全长克隆的基础上后续的研究不仅局限在体内转录方面，还可用在体外转录，使其在病毒基因组水平及病毒致病性研究上的应用更加灵活。在本研究中,我们首次尝试对正链RNA病毒进行分节段改造，这样改造后的病毒基因组由单股变成了双股，从而在基因组水平上将野生病毒株与实验株进行有效区分，并且检测起来也比较方便。在此基础上对C株进行改造，获得一个基因组分节段的病毒疫苗，就可以在分子水平将自然感染猪群与C株免疫猪群有效区分，从而利于猪瘟的彻底根除。同时，该研究也将为确定猪瘟病毒包装信号序列奠定基础。
参考文献：
[1]. 一个潜在的可区分猪瘟兔化弱毒和野毒方法的探索[D]. 孙敬锋. 广西大学. 2001
[2]. 猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究[D]. 胡慧. 西北农林科技大学. 2004
[3]. 猪瘟四种实验室诊断方法的比较研究[D]. 张朝红. 西北农林科技大学. 2007
[4]. 携带流行毒株E2基因的重组猪瘟病毒C株的拯救与鉴定[D]. 陈宁. 浙江大学. 2009
[5]. 假型猪瘟病毒体系构建及衣壳蛋白靶向灭活策略抗猪瘟病毒感染研究[D]. 周斌. 南京农业大学. 2010
[6]. 猪瘟地方流行株（BJCY/96）的全长ORF测序及E0基因的分段表达[D]. 孔鹏. 中国兽医药品监察所. 2006
[7]. 猪瘟病毒E2基因遗传变异及体外表达研究[D]. 韩雪清. 西北农林科技大学. 2002
[8]. 猪瘟病毒基因芯片诊断技术的研究及应用[D]. 杨林. 中国农业大学. 2005
[9]. 猪水疱病和猪瘟基因工程亚单位疫苗的研究[D]. 田宏. 西北农林科技大学. 2006
[10]. 构建基因组分节段的猪瘟病毒石门株[D]. 闫红岩. 山东师范大学. 2013
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