罗香文[1]2007年在《青枯病菌的PCR检测及辣椒对青枯病菌的抗性研究》文中认为青枯病是一种毁灭性土传病害，是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一，至今尚无有效的化学农药和其他防治办法。本实验参照国内外文献，设计了能扩增青枯病菌的特异性引物AU759／AU760，结果表明：该对引物不但可以从辣椒上分离到的青枯病菌，也可以从番茄、茄子、马铃薯、罗汉果、烟草等多种作物上分离的青枯病菌扩增到大小为281 bp的特异性片段。该方法为鉴定作物青枯病菌株提供了一种快速特异的检测手段；进一步克隆了该片段后测序，在Genebank上比对发现该片段是合成UDP-3-0-(R-羟基十四酰)-N-乙酰氨基葡糖脱乙酰酶基因上的部分序列，该酶由lpxC基因编码，催化青枯病菌中类脂A生物合成的第2步，为青枯病菌生存所必需。利用本研究建立的PCR检测方法对从全国各地采集的标本初步鉴定后分离获得了41个青枯病菌菌株，从中选择20个有代表性的菌株，以感病番茄品种L390为鉴别寄主进行了致病性比较分析，获得了8个有强致病性的青枯病菌菌株。在此基础上选择有强致病性的菌株RS-4对从亚洲蔬菜中心辣椒种质库中选择的13个代表性的辣椒品种进行了抗病性筛选，获得了6个对青枯病菌有高度抗性的辣椒品种。
仝爱平[2]2004年在《转苜蓿防御素alfAFP基因和苦瓜几丁酶McChit1基因提高番茄对青枯病菌（Ralstonia solanacearum）抗性的研究》文中指出番茄是一种深受人们喜爱的重要蔬菜，同时也是最早进行转基因研究的高等植物之一。现在，用转基因技术已培育出延迟成熟、抗病虫害、抗除草剂、抗逆和高品质等具有各种优良性状的番茄。利用现代分子生物学技术，向番茄基因组中导入外源基因，为番茄的遗传改良工作提供了一条有效的途径。 防御素(Defensin)是广泛存在于动、植物体内的一类富含半胱氨酸的抗菌肽，对细菌、真菌和被膜病毒等有广谱的毒杀效应。几丁质酶(Chitinase)具有降解几丁质的作用，可以破坏菌丝尖端新合成的几丁质而抑制病原菌的生长，在防御病原真菌侵害中具有重要作用。一些几丁质酶具有溶菌酶的作用，能抑制细菌生长。 本研究在建立番茄材料Micro-Tom的稳定而高效的遗传转化体系基础上，将来自苜蓿的防御素基因alfAFP和苦瓜的几丁质酶基因McChitl以及这两个基因的双价(简称AC)分别导入Micro-Tom，并对转基因植株T_1代进行了青枯菌(R. solanacearum)抗性检测。主要结果如下： 1．研究了影响农杆菌介导番茄Micro-Tom的遗传转化的几个因素，结果表明：以子叶作为外植体，其转化后再生频率(76.0％)明显高于下胚轴(19.9％)和真叶(28.7％)；共培养时间以2d再生效果最好；在重悬农杆菌的MSB培养液和共培养培养基中添加AS对于Micro-Tom的遗传转化是必需的，而其浓度对转化的影响相对较小，50μmol/L的AS即可。该转化体系稳定、高效，平均转化频率20％以上，植株生长正常。 2．对alfAFP基因，McChitl基因及其双价转基因植株进行GUS组织化学染色和PCR扩西南农业人学硕!二学位论文摘要增检测，结果表明外源目的基因己经整合到番茄基因组中。 3.用3种转基因植株做总蛋白离体抑菌实验，结果表明口柳FP基因和放Chil]基因对抗青枯菌井没有明显的协同作用;在转注C基因的转基因植株叶蛋白提取液中，起主要抗菌作用的为a妇FP基因表达产物:转McChitl基因植株的n一卜片总蛋白也有一定的抑菌作用。 4.对转AC基因植株进行了初步的T:代幼苗根部接菌和茎部针刺接菌检测，结果表明转化植株较非转化植株对青枯病菌的抗性增强。在幼苗根部接菌实验中转基因株系.L一9，L一21和L一12分别比对照推迟发病ld，Zd和4d。接菌约lld后不再发病，此时二个株系比对照发病率分别减少33.3%、44.4%和11.1%，对照发病率为100%。在茎部针刺接菌实验中，L一2!与对照相比，对青枯菌的抗性增强。接菌后的前10d，对照发病较快，而转基因植株发病较慢，至10d时比对照病情指数降低3834%;但10d以后，对照发病基本停_L匕而转基因植株继续发病，其病情指数逐渐接近对照非转基因植株，至30d时与对照相比病情指数相差不大(5%)，-发病率也达到100%。同时也可以看到相同时期转基因植株茎部接菌部位的病斑平均较对照要，J。 5.对随机挑取的转注c基因植株叁个株系萌发的T。代种子进行Gus染色和xZ适合性测验，结果表明其遗传规律均符合孟德尔规律，呈3:l单基因显性的孟德尔式分离。
陈达[3]2014年在《拮抗菌和青枯菌无致病力突变株防控茄科作物青枯病的效应和机理研究》文中研究说明青枯病是一种主要的植物病害,对农业生产造成了巨大的危害。青枯病的病原菌为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum),可腐生也可寄生,可在土壤中存活很长时间,是一种土壤习居菌。其传播途径多样,条件适宜时即迅速增殖,造成青枯病的爆发。由于轮作、套种等耕种措施应用的受限,化学防治对环境的污染且效果微弱,生物防治因此日益受到人们的重视。青枯病的生物防治主要有利用无致病力青枯菌以及青枯菌的拮抗菌。使用抗性品种也是较好的防治策略,但抗性品种的培育耗时长,也需要消耗大量的人力物力,而利用植物疫苗工程菌的刺激,诱导植物自身产生系统抗性,成为十分有潜力的防治方法。青枯菌致病性调控网络复杂,其中PhcA (phenotype conversion A)是该调控网络的核心因子。PhcA可被青枯菌的胞外信号分子3-羟基棕榈酸甲酯(3-hydroxypalmitic acid methyl ester,3-OH PAME)激活,正向调控胞外多糖EPS I (exopolysaccharides I)、胞外酶Pme (pectin methylesterase,果胶甲酯酶)的产生以及AHL (acyl-homoserine lactone)介导的群体感应系统。另外,PhcA负向调控嗜铁素的产生、细胞运动及对环境的耐受性。编码基因phcA位于青枯菌的染色体上,当青枯菌在植物维管束中迅速增殖时,PhcA的活性很高并开启青枯菌相关基因的表达,从而促进青枯菌的大量增殖。hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity)基因簇也是一个重要的与致病相关的基因簇,存在于青枯菌的大质粒上。青枯菌的hp基因簇包含多达23个基因,主要编码青枯菌的关键致病因子——Ⅲ型分泌系统。在hrp基因簇两侧还分布有与hrp基因有关的调控基因(如植物信号调控相关基因prh)及分泌的效应蛋白编码基因(如popA)。本论文通过基因工程的方法,敲除Ralstonia solanacearum ZJ3721的phcA和hrp基因,构建了番茄无致病力青枯菌菌株,研究其诱导植物产生系统抗性以及防治番茄青枯病的能力,及作为植物疫苗工程菌广泛应用的可能性。研究结果如下：(1)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S20对茄青枯病的防控以实验室保存菌株B. amyloliquefaciens S20为生防菌,通过盆栽试验证明其对茄青枯病有较好的防控效果,与有机肥联合施用时防效可达70.7%。试验结果表明有机肥可提高S20在土壤中的存活能力,增加其在植株根际土中的定殖。高效液相色谱及液质联用分析表明,S20产生的主要抑菌物质为Iturin家族的物质有C13Iturin A、C14 Iturin A、C15 Iturin A和C16 Iturin A。(2) phcA-突变株和hrp-突变株的构建本研究以R. solanacearum ZJ3721为材料,通过同源片段的融合、重组,以sacB作为反向筛选标记基因,经过两轮重组和筛选,最终获得了R. solanacearum ZJ3721 phcA-突变株和hrp-突变株。其中phcA-突变株是在R. solanacearum ZJ3721菌株phcA基因阅读框内缺失了约700bp的DNA片段,hrp-突变株是在R. solanacearumZJ3721菌株Hrp基因簇内缺失了约2500bp的DNA片段。盆栽试验表明两个突变株都丧失了对番茄的致病能力。(3) phcA-突变株和hrp-突变株的特性phcA-突变株和hrp-突变株在生长和碳源代谢上也与野生菌株表现出很大的不同。在营养丰富的条件下,突变株在对数生长期的中后期生长速度明显慢于野生菌株,并在稳定期时菌体浓度显着小于野生菌株。phcA-突变株表现出了对糊精、D-果糖和D-葡萄糖酸较快的利用能力；phcA-突变株和hrp-突变株都表现出了对α-D-葡萄糖、D-甘露醇和蔗糖等23种碳源较快的利用能力；但突变株丧失了利用γ-氨基丁酸的能力。phcA-突变株和hrp-突变株的多种致病基因的表达都受到了抑制。葡聚糖内切酶基因(egl)、与致病相关的转录调控基因(xpsR)、胞外蛋白基因(tek)和分泌胞外多糖的内膜蛋白基因(epsE)的表达都受到了95%以上的抑制。(3) phcA-突变株对番茄青枯病的防治效果盆栽试验检测了phcA-突变株作为生防菌株对番茄青枯病的防治效果。结果显示,同时接种病原菌和phcA-突变株,防效微弱,只能延缓发病一天左右；但提前3天接种生防菌表现出显着防效,25天后防效可达90%。对番茄根际土中病原菌和生防菌数量的测定显示,提前3天接种生防菌比同时接种更能有效抑制番茄根际病原菌数量,接种8天后病原菌数量与对照相比下降了1.4个数量级。提前3天接种生防菌也更能有效抑制番茄植株茎中病原菌数量,并增加自身在茎内的定殖数量。(4) phcA-突变株诱导番茄的系统抗性通过水培试验考察了phcA"突变株对番茄系统抗性的诱导作用,结果表明,接种3天后,phcA-突变株对番茄水杨酸途径(salicylic acid, SA)、茉莉酸途径(jasmonic acid, JA)和乙烯信号途径(ethylene, ET)的基因都有不同程度的诱导。而且对于SA途径的PR-la和gluA基因,phcA-突变株的诱导表达量甚至比野生菌株的诱导表达量还高,分别是野生菌株诱导表达量的66倍和7.5倍。但该诱导效果在15天后显着下降。水培试验条件下R. solanacearum ZJ3721野生菌株和phcA-突变株在番茄根表的定殖数量显示,野生菌株的数量在15天内比较稳定,而phcA-突变株的数量在10天内较稳定,到15天时显着下降。(5) phcA-突变株和hrp"突变株也能诱导烟草植株的系统抗性研究结果表明,番茄青枯菌phcA-突变株和hrp突变株也能有效诱导烟草中茉莉酸(JA)信号途径和水杨酸(SA)信号途径的抗性基因的表达。而且,青枯菌突变株对烟草系统抗性的诱导效果显着强于试验的生防菌株Bacillus amyloliquefaciensSQR-7和Pseudomonas brassicacearum J12.生防菌株Bacillus amyloliquefaciens SQR-7不能诱导烟草植株的系统抗性,而Pseudomonas brassicacearum J12的诱导能力很弱。(6) phcA-突变株在土壤中的定殖研究表明,相比于单独接种phcA-,接种的同时使用猪粪堆肥和发酵菜粕组成的有机肥对phcA-突变株在土壤中的生长有一定的促进作用,但加入一定比例的干猪粪,其促进作用更大。(7) 3-OH PAME降解菌的分离本研究分离到一株3-OH PAME降解菌PE3菌株,其与青枯菌R. solanacearumZJ3721共培养条件下,致病相关基因xpsR、epsE、egl和tek的表达受到了明显的抑制。
张冲[4]2013年在《花生抗青枯病分子机理初步解析》文中进行了进一步梳理花生是我国重要的油料和经济作物,由青枯雷尔氏菌引起的青枯病是花生最重要的土传性细菌病害,是影响花生产量和品质的关键因子之一,目前还没有行之有效的化学防治手段。解决青枯病最有效的手段是培育抗病品种,但是传统杂交育种方法选育出的抗病品种存在周期长、抗性与高产优质负相关等问题,利用分子育种技术培育高产优质抗青枯病花生品种是有效解决花生受青枯病侵染的有效途径。目前国内外对花生抗青枯病的分子机理研究甚少,对控制青枯病的抗性基因数目、作用机制、花生-青枯菌互作的机理还不清楚。随着全基因组测序和功能基因组学的迅速发展,通过正反向遗传学的方法克隆花生抗青枯病基因,剖析花生-青枯菌的互作机制成为必然,由于花生的基因组庞大,通过正向遗传学图位克隆花生抗青枯病基因和解析花生抗青枯病的机理较为困难。因此,本研究旨在通过反向遗传学手段找到与青枯病相关的抗病基因,再通过转基因验证其功能,分析其抗病调控网络,这将有助于揭示花生抗青枯病分子机理,促进花生抗青枯病遗传改良。主要研究结果如下:1.采用蛋白质组学的方法对抗感青枯病花生品种在青枯菌侵染后的叶片的蛋白质组进行了比较。根据对青枯菌侵染的不同反应,筛选出了高抗的粤油92栽培种和高感的新会小粒栽培种。分别对两个品种4周大的幼苗用剪叶法进行青枯菌侵染,然后从受侵染的植株叶片中提取蛋白质,进行双向凝胶电泳、考马斯亮蓝染色、质谱分析、蛋白数据库比对。和各自的对照组相比,抗、感品种中共发现14种差异表达蛋白。这些蛋白中,有5个是诱导产生的,4个表达上调,2个表达下调,3个差异表达相反。这些蛋白主要参与光合作用、能量代谢、信号转导以及防御反应。总之,本研究为探明花生青枯病抗性的分子机制提供了新的见解。2.通过基因芯片技术在花生上比较筛选可能与青枯病抗性相关的基因。为了鉴定抗性有关的转录本的变化,本实验根据花生全组织、花生生物和非生物胁迫的454测序结果整合Genebank上的EST序列合成了包含有101,344条unigenes的高密度的cDNA芯片(Roche NimbleGen基因表达芯片),比较抗感青枯病品种接种青枯菌后mRNA芯片杂交结果分析了两个品种的表达谱差异,经过t检验FDR≤0.05,选择log2≥1或者log2≤-1为差异基因,青枯菌侵染后,抗病品种粤油92有2,638个基因表达上调,1,410个基因表达下调,在感病品种新会小粒中,有1,551个基因表达上调,2,054个基因表达下调,通过5个差异基因的qRT-PCR验证了芯片的可靠性。GO注释和pathway分析显示抗感品种中差异基因功能注释的结果差异较大,参与的代谢途径感病品种中参与的差异基因较多。一些与抗病相关的重要基因如NBS-LRR类抗病基因、转录因子和激酶类基因在抗病品种上调的较多,而在感病品种中下调的较多,这些基因的差异表达可能与青枯菌侵染花生后的防御应答有关,可能参与了花生的青枯病的抗性。3.富含亮氨酸重复类受体蛋白激酶(LRR-RLK)具有调节植物生长发育、参与抗逆反应和防卫反应等生理功能。本研究通过基因芯片分析,获得了一个受青枯菌诱导差异表达上调的LRR-RLK类抗病基因AhRLK1,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,该基因全长3,292bp,编码992个氨基酸,对其结构分析表明具有一段信号肽、一个胞外激酶区和9个LRR保守结构域,农杆菌渗入法注射烟草叶片对其亚细胞定位显示35S::AhLK1-GFP融合蛋白定位于细胞膜上,通过荧光定量对其表达模式分析结果表明,AhRLK1在青枯菌侵染后在感青枯病花生品种新会小粒持续上调表达,而在抗病品种粤油92中变化不大,SA、ABA、ET、JA、PAC激素处理后能上调表达,在干旱和低温处理中下调表达。该基因瞬间超表达本氏烟草叶片能引起HR反应,构建超量表达载体农杆菌介导转化烟草CB-1,超表达AhRLK1明显能够增强对青枯菌的抗性。与对照相比,AhRLK1超量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtHPR3,NtHPR4,NtCHN50,NtPR1b,NtPR2,NtEFE26和NtAcs6都能够明显上调表达。推测AhRLK1可能参与花生对青枯菌的防御反应,可能参与青枯菌侵染早期对病原菌的识别,还参与了植物的非生物胁迫防御反应。AhRLK1基因的获得对于研究花生抗青枯病相关基因的结构和功能以及青枯病抗病遗传育种奠定了基础。4.NBS-LRR类抗病基因是目前已知的植物抗病基因最大家族,在植物的抗病防御反应中起着重要作用。本研究通过基因芯片分析,获得了一个受青枯菌诱导上调表达的NBS-LRR类抗病基因AhRRS5,通过RACE技术获得了该基因的全长cDNA序列,该基因全长3,157bp,编码943个氨基酸,对其结构分析表明具有典型的NBS-LRR类保守结构域,基因枪法转化洋葱表皮实验表明,35S::AhRRS5-GFP融合蛋白定位于细胞核中,荧光定量结果表明,AhRRS5在青枯菌侵染72h内抗感花生品种中都能上调表达,在感病材料中表达上调的幅度较大,受SA、ABA、ET、JA、PAC激素的上调表达,在干旱和低温处理中也能上调表达。该基因瞬间超表达本氏烟草叶片能引起HR反应,构建超量表达载体农杆菌介导转化烟草CB-1,超表达AhRRS5明显能够增强对青枯菌的抗性。与对照相比,AhRRS5超量表达的转基因烟草在接种青枯菌后一系列防御反应相关基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtPR1b,Ntla/c,NtNPR1,NtEFE2 和NtAcs6都能够明显上调表达。推测AhRRS5可能参与花生对青枯菌的防御反应,并且是通过多种信号途径复杂的调控网络实现的。AhRRS5基因的获得对于研究花生抗青枯病相关基因的结构和功能以及青枯病抗病遗传育种奠定了基础。
钱益亮[5]2013年在《烟草青枯病抗性遗传分析及QTL定位研究》文中进行了进一步梳理烟草青枯病是一种由青枯菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性病害，是典型的维管束病害，显着的病状是枯萎，一旦发病即可造成全株死亡，严重影响烟草的产量和质量，是一种毁灭性病害。本论文在对安徽省宣州区的寒亭、文昌、黄渡、杨林，以及芜湖县叁元镇的青枯病病菌分离鉴定的基础上，研究了安徽省烟草青枯病病菌对烟草的致病力及与相关生物学性状的关系，开展了抗青枯病基因RRS1的烟草同源性筛选研究，利用15个亲本配置的双列杂交组合进行了烟草青枯病抗性种质的主微位点组效应和配合力分析，利用BSA集团分离分析方法对2个烟草F2随机群体（TI448A×Enshu和TI448A×岩烟97）进行了烟草青枯病抗性的QTL定位分析。主要研究结果如下：1、烟草青枯病病原菌的分离检测及致病力分化研究采用组织分离法获得青枯病菌株8个。对其中5个进行了较详细研究，分别为：RS1、RS2、RS06、RS07、RS08。从菌株的致病性来看，RS23、RS07、RS71的致病性较强，对烟株叶片进行注射接种，叶片均有不同程度发病，但发病程度没有灌根法严重；供试菌株用注射和灌根对烟株均有致病性。同时针对烟草青枯菌生化型测定分析研究结果显示，分离的菌株除RS3不能利用卫茅醇外，其余都能利用叁糖叁醇；同时也均能利用硝酸盐，发生还原反应。根据青枯雷尔氏菌生化型划分标准，确定了从皖南烟区分离的菌株为生化型Ⅲ型。分析表明，不同菌株利用糖、醇的能力存在部分差异， RS23利用纤维二糖、卫茅醇的能力均较弱，RS22对卫茅醇利用能力也弱，但对其它糖、醇能完全利用，也能使硝酸盐还原，因此也属于生化型Ⅲ；RS3不能利用卫茅醇，但能利用其它双糖、双醇和还原硝酸盐，这个菌株划为生化型Ⅲ－1。2、青枯病抗性基因RRS1的烟草同源性研究研究针对烟草青枯病的田间单棵发病统计，病情等级，大田发病面积，进行重复性，多层次，多样本的人工统计，在拟南芥青枯病抗性基因RRS1的同源性检测试验中共筛选出3个烟草种质（G28，K346，LMAFC34）含有RRS1特异性扩增序列，针对筛选出3个烟草种质(G28、K346、LMAFC34)含有RRS1特异性扩增序列片段进行多重复的特异扩增纯化，增强结果的可靠性和完整性。由于RRS1基因含有有4个内含子，所以在引物设计上需要进一步加密，保证准确的特异性扩增，研究可以选用另外一种分子标记进行辅助和验证检测，能提高试验结果的准确性。3、烟草青枯病抗性的主微位点组遗传分析主-微位点组联合分析研究了青枯病病率和病指在始病期后第5天、第15天和第25天的效应值，主位点组效应均达到显着，而微位点组效应未达到显着。其中J1=13056和J1=13055相邻的2个主位点组在第一次和第二次的联合分析中均检测到，且效应值较大；J1=14080和J1=14079相邻的2个主位点组在第一次和第二次的联合分析中同样被检测到，且效应值较大。15个亲本青枯病病率第5天、第15天和第25天的微位点组加性效应中云烟85、DB101和RG11的效应值均最大，该检测结果和这3个品种的田间抗病指标表现一致，与之相对应的广义遗传率均在20%以上，在品种的青枯病抗性改良中可以重点考虑如何利用云烟85、DB101和RG11品种的遗传抗性。遗传纯合显性位点(++)表现为青枯病病指增加(感病)，而纯合隐性位点(––)使青枯病病指减少（抗病），且加性效应值均较大，显性效应值均较小，表明青枯病抗性的遗传规律主要是以加性遗传为主，进而为改良亲本的青枯病抗性能力以创新种质资源提供新策略。4、烟草青枯病抗性的配合力分析研究了烟草青枯病抗性各个调查时期各项指标的一般配合力都达到显着差异水平，而特殊配合力表现不一致，其中2010年7月26日调查数据发病率及病情指数都达显着差异，研究列出了该次调查病情指数的特殊配合力分析结果，并提出了几个效应强的组合。该实验结果并不表明整个试验抗性群体的特殊配合力能够这样应用，只能说明如果在一般配合力组合间决选时差异不大或难以确定时，可以选择参考一些特殊配合力分析结果，例如方差分析显着的调查时期或指标，故该研究主要考虑一般配合力，一般情况下可按烟草青枯病抗性强强组合应用于育种，烟草青枯病抗性配合力的差异可能涉及到加性效应、非加性效应以及遗传率等抗性遗传方面的研究分析。5、烟草青枯病抗性QTL定位研究研究利用TI448A×Enshu群体及TI448A×岩烟97群体在第3染色体及第5染色体上定位到4个烟草青枯病抗性QTLs （qBWR-3a， qBWR-3b， qBWR-5a和qBWR-5b），在LOD极大似然值大于或等于3的筛选条件下，分别解释青枯病抗性表型变异9.00%，19.70%，17.30%和17.40%。初步推断出测定烟草青枯病抗性的特异引物，以及利用该特异引物测定烟草青枯病抗性的的方法；所述特异性引物为两对，其核苷酸序列如下： PT20275：5′GTTCTATTTGATCGCCCC3′；5′AACAGCACCAACAGCATT3′； PT30229：5′GTTGCTCGTGTGCCTGACTA3′；5′AATGTGGAAACAGGA。利用上述特异性引物对待检测的烟草种质的DNA进行PCR扩增，采用PT20275引物能特异性的扩增出380bp大小的特异带，采用PT30229引物能特异性的扩增出200bp大小的特异带，即可判定其为抗性。本研究首次将青枯病抗性基因初步定位于第叁染色体19.45cM区域，在国内外前人的研究中均未有报道，且本研究中3个群体（TI448A×岩烟97、TI448A×Enshu及长脖黄×G28）均验证了此连锁标记，为精细定位工作奠定了基础。
雷剑[6]2007年在《马铃薯青枯病抗性SRAP标记的筛选及蛋白酶抑制子Ⅰ基因片段的克隆》文中认为青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的细菌性土传病害，在热带、亚热带、部分温带、甚至一些冷凉地区普遍发生，寄主范围涉及44科300多种植物，其中包括很多重要的经济作物，如马铃薯、番茄、花生和烟草。青枯病作为马铃薯的主要病害，常年在我国南方、西南和中原地区流行。迄今为止，马铃薯栽培种中尚未发现有效的青枯病抗源，仅在一些二倍体野生种和原始栽培种中存在有青枯病抗性，其中原始栽培种Solanum plureja具有高抗特性，成为马铃薯抗青枯病育种的主要抗性来源。但由于青枯病抗性表现出复杂的寄主、环境、病原小种的互作，因此对于青枯病抗性具体的遗传机制还不甚清楚。这一方面降低了田间抗性鉴定的效率和准确性，另一方面阻碍了抗病品种选育的进程。通过筛选与抗性基因或性状紧密连锁的分子标记，在育种过程中可以实现对抗性位点的直接选择，避免烦琐的田间接种鉴定，加速抗性基因的渗入和聚合，大大提高育种效率。另外，本实验室筛选的与青枯病抗性连锁的RAPD标记S27位于蛋白酶抑制子Ⅰ基因TATA-box上游约1500bp，因此蛋白酶抑制子类的基因可能在马铃薯青枯病防御中扮演着重要的角色。本试验利用具有青枯病抗性的原始栽培种S．phureja及野生种S．vernei所产生的2个二倍体分离群体(CE和ED)，并采用新型标记SRAP技术，结合群分法(Bulked Segregant Analysis，BSA)策略，筛选与青枯病抗性紧密连锁的分子标记。结果显示，从88对引物组合中筛选得到一个与青枯病抗性连锁的SRAP标记M32。对于ED群体，标记M32与青枯病抗性位点的图谱距离为10.2cM。对于CE群体，标记M32与青枯病抗性位点的图谱距离为17.3cM。对M32的选择准确性发现，在ED群体中，标记M32选择的准确率为89.86％，在CE群体中，标记M32选择的准确率为83.33％。对于两个群体的总体准确率达到87.62％。根据检索得到的蛋白酶抑制子Ⅰ基因部分序列信息设计引物，通过特异PCR及TAIL-PCR技术克隆了该基因片段。该片段全长2214bp，Genescan分析显示，该片段包含2个外显子。氨基酸预测显示，克隆片段可能编码139个氨基酸，编码氨基酸序列两端与2个野生番茄和1个马铃薯的蛋白酶抑制子基因具有较高同源性，而在45～80的氨基酸序列与已有同类基因没有同源性，证实是一个新蛋白酶抑制子Ⅰ基因序列。
李林章[7]2004年在《二倍体马铃薯青枯病抗性的分离及分子标记鉴定》文中进行了进一步梳理青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的细菌性土传病害，在热带、亚热带、部分温带、甚至一些冷凉地区普遍发生，寄主范围涉及50多个科的200多种植物，其中包括很多重要的经济作物，如马铃薯、番茄、花生和烟草。青枯病作为马铃薯的主要病害，目前生产上还没有有效的防治措施。化学药剂防治易造成环境污染和病原菌抗性小种突变，农业综合防治效果有限，因此只有选育青枯病抗性品种才是最为经济、有效的途径。然而，迄今为止，在马铃薯栽培种中尚未发现有效的青枯病抗源，仅在一些二倍体野生种和原始栽培种中存在有青枯病抗性。其中原始栽培种Solanum phureja表现出高度的青枯病抗性，成为马铃薯抗青枯病育种的主要抗性来源。但由于青枯病抗性表现出复杂的寄主、环境、病原小种的互作，因此对于青枯病抗性具体的遗传机制还不甚清楚。这一方面降低了田间抗性鉴定的效率和准确性，另一方面阻碍了抗病品种选育的进程。近年来，随着分子标记技术的出现和不断发展，标记辅助选择成为作物抗病育种中的有力手段。通过筛选与抗性基因或性状紧密连锁的分子标记，在育种过程中可以实现对抗性位点的直接基因型选择，避免了烦琐的田间接种鉴定，加速了抗性基因的渗入和聚合，大大提高了育种效率。另外，也为图位克隆抗病基因，进行目的基因转化提供了基础。 本试验旨在利用具有青枯病抗性的原始栽培种S.phureja及野生种S.vernei所产生的二个相关的二倍体分离群体(CE，BC1)和(ED，F1)，进行田间温室青枯菌接种鉴定，分析二倍体马铃薯青枯病抗性的遗传规律；并利用RAPD技术，结合群分法(Bulked Segregant Analysis，BSA)策略，筛选与青枯病抗性紧密连锁的分子标记。主要实验结果如下： 1．通过青枯菌生理1号小种(生化小种3号)对两群体单株进行田间温室接种鉴定，发现CE、ED两群体青枯病抗性的分离比例，经卡方测验均符合1∶1，为分析标记的共分离奠定了基础。 2．利用RAPD技术，结合群分法，从160个随机引物中筛选得到两个与青枯病抗性连锁的标记OPA07_(446)和OPA12_(980)。对于ED群体，标记OPA07_(446)与青枯病抗性位点的图谱距离为14.7 cM，OPA12_(980)与青枯病抗性位点的图谱距离为24.7cM，并且位于同一连锁群，为一对侧翼标记，两个标记之间连锁距离为39.4 cM。对于CE群体，标记OPA07_(446)与青枯病抗性位点的图谱距离为23.9 cM，OPA12_(980)与青枯病抗性位点的图谱距离为31.4 cM，但在CE群体中，没有检测到两标记间存存连锁。 3.对单标一记与双标记选择准确性的比较发现，在ED群体中，标记OPA07446选择的准确率为85.7%，标记OPA1298。选择的准确率为75.7%，两个标记OPA07446和OPA1298o一起选择的准确率为95.7%;在CE群体中，标记OPA07446选择的准确率为77.8%，标记OPA1298。选择的准确率为72.2%，两个标记OPAO7446和OPA1298。一起选择的准确率为95.0%。据此提出了双侧翼标记共选择的分子标记辅助选择策略。 4.通过对特异标记片段的回收、克隆及测序，设计SCAR引物，成功将RAPD标记OPA07o6和OPA129s。转化为SCAR标记SCA07446和SCA1298。。对SCAR标记在两个群体单株以及其它抗感株系中的分析表明与青枯病抗性连锁，提高了标记的稳定性和实用性。 5.对特异标记片段的测序结果进行了BLAST同源性比对，结果发现OPA07446与一个马铃薯蛋白酶抑制剂I基因(GenBank登录号21 4027.1)的部分序列高度同源，达88%(P 李春雨[8]2014年在《解淀粉芽孢杆菌SQRT3防控番茄土传青枯病及其机理研究》文中认为番茄广泛分布于世界各地,是重要的蔬菜作物之一。番茄青枯病是一种由茄科劳尔氏菌所引起的毁灭性土传病害,广泛分布于热带、亚热带以及部分温带地区,每年均造成大量的经济损失,严重制约着番茄产业的发展。由于青枯菌生化变种多,其致病力、生化型和血清型等差异很大,而且寄主范围广,因此青枯菌的防控是一个世界性难题。传统的化学农药防治,不断增强了病原菌的抗药性,而且残留农药污染环境,影响食品安全。生物防治因具有对环境友好、病原菌不容易产生抗性、对人畜安全等优点而备受关注。本文研究了拮抗菌SQRT3对番茄土传青枯病防控效果、在番茄根部的定殖情况和对番茄的诱导抗性等,以初步阐明其防控机理。主要研究结果如下:1.拮抗菌SQRT3在NA培养基上对番茄青枯病病原菌Ralstonia solanacearum ZJ3721有很强的拮抗效果,抑菌圈直径为17-25 mm;而且对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。将菌株SQRT3发酵液通过RP-HPLC进行组分分离收集,通过与青枯菌R.solanacearum对峙试验和质谱分析图推断,分子量为104.3的小分子能够抑制青枯菌生长,该物质未见报道。通过形态学、生理生化和16SrRNA基因的分子生物学鉴定,确定拮抗菌SQRT3为解淀粉芽孢杆菌;拮抗菌SQRT3具有形成生物膜、分泌蛋白酶、植酸酶和铁载体及溶解难溶性无机磷的能力,能够分解蛋白质产生氨;拮抗菌株SQRT3生长的最适温度为30-35℃,pH为7.0,NaCl浓度为1.5%,最佳碳源为蔗糖,氮源为牛肉膏。2.拮抗菌和有机肥配施能够显着提高拮抗菌SQRT3在土壤的存活率,在42天内数量稳定在107 CFU·g-1干土以上,而不添加有机肥的处理在接种初期拮抗菌SQRT3数量下降很快。腐熟的有机肥中添加不同比例的生猪粪对番茄根际土中拮抗菌SQRT3数量、芽孢数量、番茄生物量影响不大。用不同方式接种拮抗菌SQRT3都可以显着减少番茄根际青枯菌的数量,延缓了番茄土传青枯病的发生,降低了发病率;而番茄在含5%淀粉的菌悬液中蘸根处理比在PBS菌悬液中灌根处理防控青枯病的效果更佳,两种处理的生防率分别为81.25%和65.84%。番茄苗在含5%淀粉菌悬液中的蘸根处理在不同时期其拮抗菌数量均超过了PBS菌悬液灌根处理的拮抗菌数量,而其青枯菌的数量明显低于PBS菌悬液灌根处理的。试验表明SQRT3对番茄的生长具有明显的促生作用,植株的鲜重、干重、茎粗、根总长、根体积、根面积以及叶绿素含量都显着高于对照。其中株高和植株地上部分干重分别是CK的1.32倍和1.47倍。HPLC分析结果表明,拮抗菌SQRT3能产生植物生长促生物质包括吲哚-3-乙酸、赤霉素和吲哚丁酸等。3.拮抗菌SQRT3具有植酸酶活性。拮抗菌SQRT3发酵液的植酸酶活性受发酵温度影响较大,37℃为植酸酶活性最适发酵温度,且在第48小时达到最大活性16.33 U mL-1,生长量为OD600=1.96;发酵温度为30℃时,在第72小时达到最大活性11.18 UmL-1,生长量为OD600=3.16;植酸酶能够在较广的pH(pH3.5-8.5)范围内降解植酸,其最适降解条件为37℃和pH 5.5;从拮抗菌SQRT3基因组DNA中扩增出1152 bp的植酸酶(Phytase)基因,编码383个氨基酸,该基因的氨基酸序列与B.amyloliquefaciens subsp.Plantarum CAU B946的3-phytase基因的氨基酸序列具有100%的同源性。该Phytase蛋白序列第26位和第27位存在信号肽切割位点(26A-K27),成熟蛋白由357个氨基酸残基组成,分子量为39.24 kDa,等电点pI= 4.74。将植酸酶基因克隆到pET28a(+)载体上,转入E.coli BL21中表达,并对其进行纯化,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,可见目的蛋白约为40 kDa。4.通过PEB法成功将GFP标记质粒pHapⅡ转入拮抗菌SQRT3内,得到能够表达GFP的标记菌株SQRT3-GFP;和野生菌相比,标记菌株的生长速度、拮抗能力、成膜能力没有下降或者没有明显下降。纯培养条件下,标记菌株中的质粒pHapⅡ在无选择压力下在短期内保持稳定,培养到第120小时,质粒丢失率为14.2%;在土壤环境中,接种SQRT3-GFP 25天后,其pHapⅡ的丢失率为33.7%。标记菌株悬浮在5%淀粉溶液(处理GS)中后,再通过蘸根方式接种15天后,番茄根表的SQRT3-GFP数量超过了107 CFU·g-1根;而标记菌株悬浮在磷酸缓冲液(PBS)中(处理G),再通过蘸根方式接种,15天后番茄根表的SQRT3-GFP数量低于106 CFU·g-1根,这表明淀粉菌悬液蘸根法使得拮抗菌SQRT3定殖效果更好;SQRT3-GFP主要定殖在番茄的伸长区和成熟区,根尖没有检测到荧光标记的菌株。5.经拮抗菌SQRT3诱导处理的番茄苗在接种R.solanacearum ZJ3721后,叶片中PPO和POD抗性酶的活性快速上升,显着高于未诱导的处理;拮抗菌SQRT3处理能够降低番茄叶片膜脂过氧化程度;拮抗菌SQRT3诱导番茄产生系统抗性主要依靠JA信号途径,pin2基因表达迅速增加,在第24小时相对表达量达到最大值,是RS处理的32.52倍。 曹广英[9]2016年在《花生青枯菌响应基因克隆及表达分析》文中研究说明中国是世界上最大的花生种植、出口大国,花生是我国重要的经济作物。由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的花生青枯病(Bacterial wilt,BW)是我国花生的主要细菌性病害,严重限制了我国及很多东南亚国家花生生产。目前通过轮作、化学药剂和生物防治能够在一定程度上预防青枯病的发生,但是这些方法浪费土地资源,并且增加了种植成本。到目前为止,国内外进行了许多研究,结果表明选育和利用花生青枯病抗性品种是防治该病的根本措施,因此深入挖掘研究花生青枯菌响应基因,改良和培育高抗青枯病的花生新品系是势在必行的。青枯病抗性育种主要有两条途径:一是对现有花生种质进行抗性鉴定,从中筛选出抗病、高产的品种直接加以利用;二是将现有抗源与当前主栽品种杂交,转移其抗性,培育抗青枯病新品种。但是受抗源种质遗传基础和筛选方法的限制,传统的育种手段难以满足生产需要。近年来随着分子生物学的发展,花生青枯病抗性育种也朝着分子水平迈进,分子标记和抗性基因分离等技术的运用有助于加速花生青枯病抗性育种进程。本研究主要涉及花生青枯菌响应基因的挖掘以及对花生青枯病抗性品种(系)进行培育,具体研究内容和结果如下:1、利用Genefishing技术分离得到的花生青枯菌响应基因,以花生品种日花1号为材料,通过RACE方法成功得到响应基因的cDNA序列,并获得其DNA序列。本研究共得到3个基因的cDNA全长,其功能主要涉及到植物的信号转导、转录调控、蛋白质合成、抗病相关和基础代谢等方面。2、构建了3个基因的过表达载体、反义表达载体和原核表达载体,其中还把CXIP4-1基因转化到花生植株中,得到转基因T1代花生种子,并将其筛选鉴定以确定其功能。3、采用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了3个基因在花生品种日花1号植株中的组织表达和青枯菌胁迫条件下的表达变化规律,进一步验证这3个基因对花生青枯病抗性的作用。4、通过SSR分子标记及AhMITE转座子分子标记对花生杂交F1代进行真假杂种鉴定,加速花生青枯病抗性品种(系)的选育工作。 王胜坤[10]2007年在《桉树青枯菌菌株致病力分化、吸附识别及PCR快速检测研究》文中认为桉树是世界叁大速生造林树种之一。随着桉树人工林面积的不断扩大，桉树病虫害问题也越来越突出，病虫害种类不断增加，危害程度愈加严重，严重影响了桉树的正常生长，降低了木材和其他林产品的产量和质量。目前在桉树病虫害中，青枯病的危害最严重，危害范围最广，给桉树生产造成很大的经济损失。前人曾对桉树青枯病的病原、发病规律和防治方法等进行了一系列研究，取得了一定进展，但对桉树青枯病的病原学和致病机理了解还比较少，缺乏对桉树青枯病全面而系统的了解。本文对青枯菌致病力及桉树无性系抗性分化、青枯菌遗传多样性、青枯菌对桉树的吸附和侵染识别过程以及分子检测方法等4方面进行研究，以期深入了解桉树青枯病的侵染发病机制，为桉树生产中无性系的合理布局、防止青枯菌传播和蔓延提供理论和技术支撑。本研究主要结果如下：(1)选用DH196和DH32-22两个无性系，采用水培接种法对华南地区30个桉树青枯菌菌株致病力进行了测定，发现华南地区桉树青枯菌菌株间致病力存在显着差异，且与地理来源之间无明显相关性，同一地区致病力强弱菌株并存。(2)从30个测定的菌株中选择强、中、弱各2个致病力不同的菌株与12个生产中常用的桉树无性系采用灌根接种法交叉接种发现，供试无性系对青枯病抗性也具有一定差异，无性系DH196、T13、DH32-29抗性最弱，DH32-22、9113、21、U6、9224抗性中等，井岗一号、DH201-2、EG5和广林9抗性较强。(3)在对菌株致病力和无性系抗性测定中发现，青枯菌菌株和桉树无性系间存在显着的交互作用，植株的发病程度取决于病菌的致病力、无性系的抗病性以及二者的交互作用。在实际生产中应选择抗性较强的品系，同时兼顾不同抗性无性系合理布局，充分利用无性系的抗病性控制青枯病的发生和危害。(4)首次利用AFLP分子标记对华南地区30个桉树青枯菌菌株的遗传变异进行了研究，有助于了解病菌的遗传分化，病菌的流行学特征等多方面的信息。通过研究发现，来自华南地区的30个桉树青枯菌菌株间遗传变异较大，多态性高。不同菌株间的遗传关系与致病力强弱具有一定的相关性，致病性相近的菌株亲缘关系较近；而菌株的遗传关系在地域上则呈现大杂居小聚居的分布格局，在小的地域范围亲缘关系较近，但相距较远的地区也有亲缘关系较近的菌株。(5)用强弱两菌株接种无性系DH196，结果发现，青枯菌对桉树根部吸附识别的最适温度条件是30℃，此时病菌新陈代谢旺盛，运动能力强，对根表吸附量和根部侵入量高。环境中pH值为中性至弱酸时最有利于青枯菌对桉树根表的吸附识别，此时细菌易于成功吸附到根表细胞表面，进而定殖和侵入。细菌接种浓度对吸附识别具有重要影响，高浓度青枯菌的群体效应使青枯菌能够克服寄主的防卫机制成功吸附定殖，青枯菌对细胞表面的吸附可能具有特定的位置效应，过高浓度的细菌，其吸附量和侵入量并不能继续增加。(6)本研究制备了粗提纯的胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)，无EPS和无EPS与LPS的菌株，通过测定青枯菌的根表吸附量和根部侵入量，研究EPS和LPS在青枯菌对桉根部吸附和侵入过程中的作用。结果表明：在接种青枯菌的6h内，EPS处理后青枯菌的根表吸附量和根部侵入量明显升高，而LPS处理后青枯菌的根表吸附量和根部侵入量都明显下降；无EPS菌株的根表吸附量和根部侵入量都明显降低，无EPS及LPS菌株的根表吸附量和根部侵入量亦有所下降，但不如无EPS菌株下降明显。EPS具有促进青枯菌对桉树根部吸附和侵入的作用，LPS则具有抑制作用。(7)使用致病力强弱不同的5号和12号菌株接种桉苗，在接种后1.0h、2.0h、4.0h、6.0h、24h分别取样，扫描电镜观察发现，青枯菌的根表吸附量在初始的6.0h时间里具有明显的积累效应，强毒菌株的根表吸附量明显高于弱毒菌株，并开始在根表增殖，与细胞发生作用，侵入寄主。(8)扫描电镜观察发现，青枯菌侵入桉苗无伤幼根的途径可能是通过青枯菌分解作用，破坏根表细胞壁进入根内。青枯菌能分解根表细胞壁，使根表细胞变形，细胞之间出现较大的缝隙，进而从缝隙间侵入寄主。本研究证明了青枯菌是在桉树维管束导管及相邻组织内迅速增殖和广泛分布堵塞输水管而导致桉树枯萎。桉苗接种青枯菌2.0h，根茎切片只发现少许白色的浓密物质，6.0h后，也只能看到稀少的几个病菌，但接种24h后，就可以观察到大量的病菌存在于维管束的导管及细胞间隙，堵塞导管并引起植株表现枯萎症状。(9)以带有青枯菌的桉树组织为材料，采用4种不同的提取方法抽提青枯菌DNA，同时利用青枯菌特异性引物进行PCR扩增，比较了4种DNA提取方法及PCR检测灵敏度。结果表明，煮沸法和热裂解法操作相对简单，但检测灵敏度较低，检测限分别为10~4CFU／mL和10~3 CFU／mL；简化提取法和试剂盒法检测效果较好，均可检测到10~2 CFU／mL的青枯菌，但简化提取法比试剂盒法操作更简单，检测成本低，具有更高的应用价值。 [1]. 青枯病菌的PCR检测及辣椒对青枯病菌的抗性研究[D]. 罗香文. 湖南农业大学. 2007 [2]. 转苜蓿防御素alfAFP基因和苦瓜几丁酶McChit1基因提高番茄对青枯病菌（Ralstonia solanacearum）抗性的研究[D]. 仝爱平. 西南农业大学. 2004 [3]. 拮抗菌和青枯菌无致病力突变株防控茄科作物青枯病的效应和机理研究[D]. 陈达. 南京农业大学. 2014 [4]. 花生抗青枯病分子机理初步解析[D]. 张冲. 福建农林大学. 2013 [5]. 烟草青枯病抗性遗传分析及QTL定位研究[D]. 钱益亮. 安徽农业大学. 2013 [6]. 马铃薯青枯病抗性SRAP标记的筛选及蛋白酶抑制子Ⅰ基因片段的克隆[D]. 雷剑. 华中农业大学. 2007 [7]. 二倍体马铃薯青枯病抗性的分离及分子标记鉴定[D]. 李林章. 华中农业大学. 2004 [8]. 解淀粉芽孢杆菌SQRT3防控番茄土传青枯病及其机理研究[D]. 李春雨. 南京农业大学. 2014 [9]. 花生青枯菌响应基因克隆及表达分析[D]. 曹广英. 吉林农业大学. 2016 [10]. 桉树青枯菌菌株致病力分化、吸附识别及PCR快速检测研究[D]. 王胜坤. 中国林业科学研究院. 2007参考文献：