河北省承德医学院附属医院 河北承德 067000
【摘 要】目的：应用四血管法建立全脑缺血再灌注损伤模型，观察脑缺血再灌注7天海马CA1区神经元形态学和超微结构变化，存活细胞数和细胞凋亡率的变化。并应用黄芪注射液进行干预，对上述指标的变化情况进行比较，探讨黄芪注射液减轻脑缺血再灌注损伤的作用机制，为黄芪注射液的临床应用提供理论基础。
【关键词】黄芪注射液；脑缺血再灌注；海马CA1区；细胞凋亡
【中图分类号】R285.5 【文献标识码】B 【文章编号】1764-8999（2015）7-0616-01
脑血管疾病是目前人类死亡和残疾的主要原因之一，该病的发生主要与脑血流的减少和缺血性脑损伤有关。研究脑缺血后神经元损伤的发生机制以及可能的干预因素，寻找有效的脑保护药物，最大限度地减少神经细胞的急性和迟发性死亡，保护脑功能，仍是当前研究的热点和难点。中药黄芪，应用历史悠久，具有抗炎、抗病毒、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等作用[1]，并有实验表明对缺血后迟发性神经元损伤有保护作用[2]，受到医家的青睐。鉴于中药黄芪对脑血管病多靶点治疗的作用特点，黄芪对缺血性脑损伤影响的研究也成为当前医学领域研究的热点。本实验的研究目的就是探讨黄芪注射液减轻脑缺血再灌注损伤的作用机制，为黄芪注射液的临床应用提供理论基础。
1 资料和方法
1.1 方法：本实验中我们应用成本低，种系纯合性好，与人类脑血管解剖特性相似的SD大鼠为实验动物，采用改良的Pulsinelli四血管法[3]，建立全脑缺血15分钟再灌注7天损伤模型，并观察黄芪注射液的作用。此法的优点是，检验缺血是否成功的指标明确，能在清醒的动物上复制。我们将48只SD大鼠随机分为假手术组，缺血再灌注模型组，尼莫地平组，黄芪注射液治疗组。并选择应用HE染色在光学显微镜下观察海马CA1区神经元形态变化及存活神经元计数；应用电镜观察海马CA1区超微结构变化；应用流式细胞仪检测海马组织神经元凋亡率。
1.2 统计学方法：实验数据均用均数±标准差（ ±s ）表示，各组之间均数的比较采用单因素方差分析，应用SPSS统计软件。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1海马CA1区神经细胞形态学变化：假手术组：海马CA1区神经元外形规则，3～4层，细胞层排列整齐而致密，核大而圆，透明，有1～2个明显核仁，核膜清楚。模型组：神经元排列紊乱而疏松，外形皱缩，部分细胞脱失，核固缩深染，胞浆空化，核溶解，核膜境界不清；神经元计数显著低于假手术组(P<0.01)。尼莫地平组和黄芪注射液治疗组相似：大部分神经元保持正常形态，细胞排列基本规则，少量细胞轻度脱失，部分胞染变深，残存的神经元大部分呈可逆性缺血性改变;神经元计数显著高于模型组(P<0.01)。
2.2 海马CA1区神经细胞超微结构变化：假手术组：7天后神经元细胞核呈卵圆形，两层膜结构清晰光滑，核周间隙均匀，核内染色质均匀分布，胞浆内细胞器丰富，结构完整，可见高尔基体分布，结构呈扁平囊泡平行排列，线粒体呈圆形、椭圆形，内嵴清晰可见，基质均匀，粗面内质网平行排列或散在分布，大量糖原颗粒存在于胞浆中。模型组：细胞核膜结构模糊，线粒体空泡化明显，且较多较重，高尔基体不规则。尼莫地平组和黄芪注射液治疗组相似，与模型组相比，海马病变较轻，胞浆内细胞器丰富，细胞器结构较完整，部分细胞器结构变性。
2.3 海马神经元凋亡率：与假手术组相比，模型组神经元凋亡率明显升高(P<0.01)；与模型组相比，黄芪注射液组和尼莫地平组神经元凋亡率显著降低(P<0.01)；与尼莫地平组相比，黄芪注射液组神经元凋亡率无明显变化(P>0.05)。
3 讨论
脑血管病是临床常见多发性疾病，其致残率及致死率极高，是人类当前三大死亡原因之一，而缺血性脑血管病约占全部脑血管病的7%左右[4]。缺血性脑血管病尤其是脑缺血再灌注损伤对人类健康的危害极大。脑缺血再灌注损伤的机制十分复杂，早期一直认为脑血供减少，能量衰竭发挥主要作用。但进一步的研究发现，缺血缺氧引起的中枢神经系统能量衰竭为触发点，造成一系列缺血损伤的级联反应，在缺血再灌注损伤中发挥重要作用。包括自由基引起的脂质过氧化损伤、神经递质的改变、兴奋性氨基酸毒性、钙超载及炎症介质的作用等。
全脑缺血在临床上常见于休克、窒息、心肌梗死、严重的心律失常、呼吸衰竭等造成的脑部低灌流状态，缺血范围广泛，而脑组织对氧和葡萄糖的储存几乎为零，缺血后数分钟即可出现神经元的坏死，脑损伤的严重程度与缺血缺氧时间呈正相关，因此迅速恢复脑的血液供应，终止缺血状态及缺血所造成的脑损伤，有极其重要的临床意义。然而大量的实验证实，脑缺血缺氧再灌注引起炎症性反应及氧自由基生物膜损害导致部分损伤细胞继发性死亡[5,6]，即存在再灌注损伤。
在本实验中，我们应用成本低，种系纯合性好，与人类脑血管解剖特性相似的SD大鼠为实验动物，采用Pulsinelli四血管法，建立全脑缺血再灌注损伤模型。临床上，脑梗塞形成是一种局灶性缺血，梗塞的中心区是完全性缺血，细胞在缺血后很快死亡，细胞功能不可逆转；而梗塞周围被叫做半暗带的缺血区，是经再灌注后有可能恢复活力和功能的细胞区，这也是临床医师治疗缺血性脑血管病的目的所在，而四血管阻断全脑缺血动物模型正好建立一个类似半暗带的模型[7,8]，在这种模型上进行实验，结果是可靠的、有意义的。此种方法的优点是[9]，检验缺血是否成功的指标明确，不受血压和麻醉剂等影响，能在清醒的动物上复制，是一种理想的动物模型。但成功率较低。
实验应用尼莫地平作为阳性药物与黄芪注射液进行对比。尼莫地平是一种选择性地作用于脑血管平滑肌的钙拮抗剂，其对外周血管的作用较小，故降压作用较小。对缺血性脑损伤有保护作用，尤其对缺血性脑血管痉挛的作用更明显。近来有资料表明它有保护或促进记忆，促进智力恢复的作用。尼莫地平为二氢吡啶类钙拮抗药。主要选择性扩张脑血管，解除脑血管痉挛，增加脑血流量。对局部脑缺血具有保护作用，并能抑制和对抗各种血管活性物质如NE、5-HT、PGs等引起的血管收缩。尼莫地平已经广泛应用于脑血管疾病的临床治疗。
本研究通过观察黄芪注射液对全脑缺血再灌注大鼠海马神经元凋亡率、形态结构、超微结构的影响，并与尼莫地平组作为参照。实验结果表明：黄芪注射液可明显改善脑缺血再灌注后海马CA1区神经元形态学及超微结构变化，减少神经元脱失，降低神经元凋亡率；从而保护脑组织，为黄芪注射液的临床应用提供理论依据。
参考文献
[1] 吴发宝,陈希元.黄芪药理作用研究综述[J] .中药材,2004,27（3）:232-234.
[2] 黄惠,王岭,李艳,房雷,孙丽,王婷婷,等.黄芪注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用研究[J] .卒中与神经疾病,2014,21（1）:19-22.
[3] Pulsinelli WA and Buchen AM.The Four-Vessel occlusion rat model： Mathod for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation[J] .Stroke,1988,19（7）:913-914.
[4] Gross A. Bcl-2 proteins:regulators of the mitochondrial apoptotic program [J].IUBMNB Life,2001,52（3-5）:231-236.
[5] Candelario-Jalil E.Injury and repair mechanisms in ischemic stoke: considerations for the development of novel neurotherapeutics [J].Curr Opin Investig Drugs,2009,10(7): 644-654.
[6] Lee HC,Hsieh CL,Chen CC,et al.A pilot study in acute subarachnoid haemorrhagic patients after aneurysm clipping with complementary therapies of Chinese medicine[J].Complementary Therapies in Medicine ,2010,18（5）:191-198.
[7] 严智文,董河,冯伟,牛泽军,褚海晨,隋爱华,等. 改良血管阻塞方法建立大鼠全脑缺血模型[J].中国医学创新,2013,1:1-2.
[8] Okada M, Fujimura Y, Ueda H,et al. Effect of D-(E)-2amino- 4-metthyl -5phosphono-3-pentanoic acid on ischemia brain damage induce by four-vessel occlusion in rats[J].Aramein Forsch （Drug Res）,1997,47;115.
[9] 贾建民,贾建平,刘多三,等.啮齿动物全脑缺血模型和海马选择易损性研究进展[J] .国外医学脑血管病分册,1994,2（1）：34-37.
论文作者:于淼,高维娟
论文发表刊物:《中医学报》2015年7月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/20
标签：神经元论文; 黄芪论文; 注射液论文; 尼莫地平论文; 损伤论文; 脑缺血论文; 模型论文; 《中医学报》2015年7月第30卷供稿论文;