【摘 要】目的：探讨针刺兔不完全性截瘫后损伤脊髓神经生长因子（NGF）表达的动态变化，探讨针灸治疗不完全性截瘫的机理。方法：采用督脉针合神经干刺激疗法治疗不完全性截瘫兔，于伤后6小时、7天、15天取损伤脊髓组织3mm长，用免疫组织化学S-P法染色，并用美国产Optimas6.51彩色图像分析系统进行图像分析。结果：针刺以后脊髓神经组织中的NGF表达于第7天开始出现明显增高（P<0.05）。结论：针灸作用于截瘫早期脊髓损伤的机理与促进NGF阳性表达的升高有关。
【关键词】针灸；不完全性截瘫；NGF阳性表达；灰度
截瘫尤其是不完全性截瘫是临床的常见疑难病，其主要原因是伤后继发损害不断加重，发展最终导致不可逆改变。针灸对其疗效确切，已成为截瘫恢复的重要手段之一。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是一个多功能神经营养因子。随着研究的进展，它对神经系统生长、发育、维护中的作用倍受重视。我们对不完全性截瘫兔的损伤脊髓部位，针刺NGF表达作了动态对比观察，以探讨针灸治疗截瘫的机理。现报道如下：
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1实1验动物与分组：由湖南中医学院日本大耳白兔饲养中心，提供健康雄性日本大耳白兔70只，体重2.0～2.5kg。随机分为非脊髓损伤组（10只），造模损伤6小时组、7天组、15天组，针刺6小时组、7天组、15天组，每组10只。实验动物与分组：由湖南中医学院日本大耳白兔饲养中心，提供健康雄性日本大耳白兔70只，体重2.0～2.5kg。随机分为非脊髓损伤组，造模损伤6小时组、7天组、15天组，针刺6小时组、7天组、15天组，每组10只。
1.1.2兔不完全性截瘫模型的制备
兔不完全性截瘫模型采用压迫法[1]，造成不完全性脊髓损伤（60只）。正常对照组与模型组、针灸治疗组一样常规麻醉，显露第七腰椎间孔切断黄韧带，插入麻醉导管胶囊，并用皮肤尾线固定，但不注入碘必乐，不予压迫，24小时后拔掉导管。
模型组不行治疗，针灸治疗组在模型形成拔掉导管后即开始针灸治疗。
1.2针灸治疗方法
头皮针刺激法：头针运动区、感觉区，沿头皮分三段刺入帽状腱膜下，施小幅度高频率捻转手法，再配以电针（不完全性截瘫多表现为迟缓性瘫，采用断续波）以增加刺激量。每次25min，每日1次。
针灸督脉方法：在损伤脊髓平面上、下两椎体棘间隙各进一针至硬膜外，捻转勿提插，得气后通以微量电流[波形同（1）]。损伤早期可采用隔姜灸督脉损伤部位。每次25min，每日1次。
配合体针刺：取“环跳”“委中”“殷门”“涌泉”“次髎”等穴。针刺行平补平泻法，留针25min，每日1次。
1.3标本采集及观察指标
1.3.1 在模型形成6小时、7天、15天时，空气栓塞分批处死大耳白兔。电镜液固定损伤脊髓部位，取3mm长，损伤脊髓用10%的中性福尔马林固定液再固定，常规石蜡包埋切片，经 He常规染色后镜下观察出血、坏死、炎性渗出情况，每组筛选3-5个阳性反应显著标本行免疫组化染色分析。
1.3.2 主要试剂：
兔抗兔NGF单克隆抗体、SP免疫组织化学试剂盒，DAB显色剂（由武汉博士德生物工程有限公司提供）。
Main Reagents
1.3.3 NGF免疫组化染色
①石蜡切片常规脱蜡至水；②10%过氧化氢37℃孵育10min，微波抗原修复；③羊血清孵育10min，滴加-抗4℃过夜；④滴加二抗37℃孵育30min；⑤滴加三抗37℃孵育30min；⑥DAB显色苏木素复染；⑦脱水透明封片。
1.4 图像分析和统计处理
应用美国产Optimas 6.51彩色图像分析系统（湖南中医学院诊断所提供）在10×40倍视野光学显微镜下对NGF免疫组织化学染色阳性反应物进行定量检测，分别拍摄并测定损伤脊髓灰质，（前、后角，灰质联合共5个视野）和白质（前后索侧索共6个视野）灰、白质共11个视野阳性信号数和灰度（Mean Gray）.
用SPSS.11.5统计软件进行方差分析，P<0.05视为有显著性差异[2]。
2、结果
图像分析灰度变化表1
针刺组白质灰质各时相灰度值较正常组及模型组在七天及十五天时相有显著升高（P<0.05），十五天内无明显峰值出现，呈持续升高表现。针灸组白质部位各时相灰度均高于灰质部位，灰白质比较7天时显著P<0.01，表明针灸作用于NGF的表达主要体现在白质部位。
模型组各时相变化不显著，只15天时相灰质白质部位灰度才稍见升高。6h、7d时白质灰度与正常无差异。15天时白质灰度明显高于同时间灰质灰度。
3、讨论
1．脊髓损伤的病理生理改变脊髓损伤机制的研究，主要目标集中在轴突或侧芽的生长，并达到远端以恢复脊髓功能。脊髓横断后，轴突发生肿胀，从核周体至突触末端有轴浆运输巨分子流，使周围神经轴突得以再生。虽然中枢神经系统也同样存在这种运输，却很难再生。说明神经再生远较轴浆运输复杂。脊髓损伤后，虽可以有短距离的再生，但很快即发生夭折。
现在已明确，阻碍脊髓生长的因素有：①生化改变：如神经分泌性物质、神经营养物质、神经递质、生长因子、内分泌激素等的释出受到抑制。②血液供应：神经细胞没有充足的血液供应则无法获得营养物质，不仅不能再生，甚至无法存活。脊髓损伤后的血供障碍是个关键因素。③神经结构的改变：再生神经细胞的接触向导，瘢痕组织、细胞碎块、组织坏死及组织空洞均可影响脊髓的再生。④免疫因素：包括脊髓抗原的产生及促进轴突再生的免疫因素[3]。
Bernstrin（1983）提出，当生长中的神经元完成突触发生过程后，便处于一种生长抑制状态，轴突切断后可出现去抑制，因而可出现再生。瘢痕组织并非不可逾越的障碍，NGF为神经营养的重要物质，由于NGF的缺乏，再生的轴突不能抵达靶细胞，可能是再生失败的原因[4]。
神经生长因子作用于神经系统的机理探讨
神经生长因子是20世纪50年代初在小鼠肉瘤细胞内发现的一个神经营养因子，具有多种生物功能。NGF对神经系统的生物效应是维持和促进交感神经及来自神经嵴的感觉神经细胞的存活、分化和成熟以及执行功能，是参与损伤神经再生和功能修复的重要因素[5]。
多年来一直认为NGF仅作用于外周神经系统，而近年研究己证实，NGF能选择性作用于中枢神经系统。在游离神经移植修复脊髓损伤的研究中发现，肌源性神经生长因子对提高移植神经的成活率有显著疗效，且与剂量浓度呈相关[6]。
有研究表明，脊髓创伤后神经元神经生长因子（NGFR）出现再表达。反映神经细胞对神经生长因子的需求有所增加，以维持创伤后NGF依赖性神经元的生存[7]。本实验研究中模型组15天时相灰质白质部位灰度稍见升高的报道是正确而严肃的。
针灸作用于脊髓损伤机理的探讨
本研究采用针刺兔不完全性截瘫后损伤脊髓神经生长因子表达的免疫组化动态变化的方法，来探讨针灸治疗不完全性截瘫的机理。
发现针刺以后脊髓神经组织中的NGF表达明显增高（P<0.05），神经元细胞水肿减轻，炎性浸润减退，星型胶质细胞及血管增生，表明针刺作用于截瘫的机理与促进NGF的合成或释放有关。
尤其在模型形成15天后，模型组灰质部位NGF阳性表达已降至正常水平以下（P<0.05），而针灸组灰质灰度仍在明显上升，明显高于模型组、正常组，说明针灸能明显激发NGF合成释放。
NGF的含量增高，对神经组织神经原的维护及修复可以起到至关重要的作用。至于针灸疗法是通过何种途径促进NGF的合成释放的，其中的具体机制，尚待进一步探索研究。
瘢痕组织并非不可逾越的障碍，NGF为神经营养的重要物质，由于NGF的缺乏，再生的轴突不能抵达靶细胞，可能是再生失败的原因[4]。与本实验研究中模型组15天时相，NGF白质灰度明显高于同时间灰质灰度，说明NGF加强神经纤维再生，减少瘢痕形成。
影响NGF表达的还有内分泌激素如雌二醇[8]，形成神经内分泌反馈系统，平衡水代谢，NGF与肽类的分泌协调转录翻译功能。针灸督脉得气后通以微量电流，扩张血管形成亚低温状态，亚低温状态可改善脊髓损伤区域的微环境，抑制水肿，保护神经功能[9]，同时注意维护外源性NGF使用时的低温冷藏效应。通督醒神针刺法可促进早产儿脑白质功能的修复，进而促进脑发育和智力改善[10]。
参考文献：
[1]刘洁，胡湘明等.建立兔急性压迫型不完全性截瘫模型的实验研究[J].湖南中医学院学报，2003.10[5]；1-4
[2]贺石林等.中医科研设计与统计学[M]，湖南科学技术出版社，2003：331-332
[3]胥少汀，郭世绂.脊髓损伤基础与临床[M]，人民卫生出版社，2002：351
[4]Bernstein JJ，et al. spiral motorneuron dendritic alteration after spinal cord hemisection in the rat[J]. Exp Neurol.1983，83：548
[5]周廷冲．多肽生长因子基础与临床[M].北京：中国科学技术出版社，1992：105
[6]王爱民，孙红振，杜全印，等．不同浓度的肌肉源神经生长因子对游离神经移植修复脊髓损伤的作用[J]．中国临床康复，2002，6（12）：1770
[7]王子慧，Gerhard Lissollet.神经生长因子受体在人脊髓创伤后的再表达[J].中华病理学杂志，1996；25（1）：21-23
[8].张鸿日1郭孝龙2彭静华 等2一甲氧基雌二醇对脊髓损伤大鼠运动功能及神经细胞凋亡的影响 中国康复医学杂志，2015，30（8）：761-764
[9].张建军，史焕昌，杨卫山，王东.亚低温条件下脊髓损伤模型大鼠神经再生微环境及运动功能的变化[J].中国组织工程研究，2015，19（27）：4316-4321
[10]蔡淑英，刘振寰，彭桂兰 等 通督醒神针刺法治疗早产儿脑白质损伤疗效观察，中国针灸2018.38（1）51-58
论文作者:刘洁
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2018年7期
论文发表时间:2018/11/17
标签：脊髓论文; 损伤论文; 神经论文; 完全性论文; 白质论文; 针灸论文; 针刺论文; 《中国结合医学杂志》2018年7期论文;