微囊藻毒素的荧光定量论文_黄宗耀

摘要：荧光定量 PCR检测方法具有灵敏度高、精确度高、检测范围宽、重复性好优势，本文就其方法对水体中的微囊藻进行检测。

关键词：荧光定量PCR；微囊藻毒素；检测

随着我国工农业的迅猛发展以及城市化进程的加快，生活污水、工业废水中污染物的排放量日益增加，环境污染越来越严重，造成水体富营养化及污染日益严重。水中过量的氮、磷等营养性物质，使水中蓝藻等藻类过渡繁殖，蓝藻水华暴发频繁。藻类水华爆发严重威胁城市水源水安全。因此，及时监测城市源水蓝藻发生情况，对保证城市供水安全具有重要意义。

蓝藻监测，传统的方法主要通过显微镜镜检法，对水体中的藻细胞计数及分类，后来又有通过藻类的16S rDNA 序列分析进行藻种分类，然而这些方法不能区分产毒微囊藻及非产毒微囊藻，并在蓝藻暴发之前对其进行准确预测。实时荧光定量 PCR（Real- time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法是一种特异性强、敏感性高、准确性好的分子检测方法，已被用于产毒微囊藻的监测。微囊藻毒素由一些藻毒素合成酶基因簇控制，该基因簇由 mcyA～mcyJ等10个基因构成。通过检测微囊藻毒素的产毒基因 mcyA mcyBmcyD 可以用于监测水体中的产毒微囊藻细胞。mcyE 基因可以用于设计种特异性引物，用于监测水体中的产生微囊藻毒素的不同产毒藻种。Ouahid 等利用 mcyE 等藻毒素合成酶基因监测水体中的产毒微囊藻［5］。Al- Tebrineh 等利用 mcyE 和 ndaF 基因设计的实时荧光定量 PCR 方法，同时监测水体中的不同微囊藻毒素产毒藻种［3］。由于不同水域环境中水体的产毒微囊藻的种类及分布不同，本文利用荧光定量 PCR技术，对水体中的微囊藻进行检测。

1 材料与方法

1.1 藻种来源和培养条件

实验用藻种购买于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库，藻种编号为鱼腥藻（Anabaena sp）FACHB-82水华束丝藻（ Aphanizomenon flos-aque）FACHB-1039铜绿微囊藻FACHB-315柱胞鱼腥藻（Ana-baena cylindrica）FACHB-170 席藻（Phormidium sp.）FACHB- 1099 水华束丝藻 FACHB- 245 颤藻（Oscillatoriasp．）FACHB- 1053，于 BG- 11 培养基中扩大培养，颤藻 FACHB-528 在 SE培养基中扩大培养。培养温度为25℃，光照强度为30 E/（m2s），光暗比12 h∶12h。

1.2 藻细胞基因组 DNA 的提取

1.2.1 基因组 DNA 提取 分别采用2 种方法提取藻细胞基因组 DNA：方法1 按植物基因组 DNA 提取试剂盒（SK8203，上海生工）的操作程序，提取藻细胞基因组 DNA.取藻液10 ml，12000 转/min 离心15 min，弃上清，取沉淀用于基因组 DNA 提取；方法2 基因组 DNA 的快速提取。

1.2.2 DNA 浓度与纯度检测 分别取藻类基因组的DNA 各5 l，加入495 l TE 缓冲液稀释，用微量核酸蛋白测定仪（Beckman coulter DU- 530，美国）测定DNA 浓度，测定A260和A280，DNA 浓度计算公式为：［DNA］=A260×稀释倍数100×40g/ml。

1.3 PCR 引物设计与 PCR 扩增

根据 mcyE和ndaF基因设计普通 PCR 和荧光定量 PCR引物，具体参考文献［3］，引物序列见表1。16S rDNA 和 mcyE/ndaF 基因的 PCR 反应体系：10 mol /L引物- F 1 l，10 mol /L引物- R 1 l，10×PCR buffer 2 l，10 mol /L dNTP 2 l，25 mmol /L MgCl2 1.5 l，模版DNA 1 l，Tag 酶（5U/ l）0.5 l，dd H2 O17 l，总体积25 l，PCR 反应条件如下：94℃预变性 4 min，94℃变性 30 s，退火温度分别为 50℃和 56℃，30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃，5min。将 PCR 产物在3%琼脂糖凝胶进行电泳．

表1 普通 PCR 和荧光定量 PCR 扩增引物

1.4 荧光定量 PCR

在Bio-rad CFX3700仪器上进行荧光定量PCR扩增，PCR 反应体系：Hotstart fluo- PCR mix（ SK2956A，上海生工）10 l，10 mol /L cyano- real mcyE- F05l，10 mol /L cyano- real mcyE- R 0.5l，0.1%（w/ v）BSA2l，10%（w/ v）PVP- 302l，模版 DNA 1 l，dd H2O4l，总体积20l，PCR 反应条件如下：95℃预变性10min，95℃变性15s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环，退火过程中收集荧光，每个样品重复3 次。熔解曲线的过程：95℃15s，从60℃开始升高至95℃，每30 s温度升高0.5℃，进行熔解曲线分析。

1.5 特异性检测

提取不同藻种基因组DNA，进行普通 PCR 扩增和荧光定量PCR扩增，并以16S rDNA为对照，检测引物的特异性。

1.6 荧光定量 PCR 标准曲线建立

分别以铜绿微囊藻 FACHB- 315基因组 DNA 进行10 倍稀释，测定 DNA 浓度，以基因拷贝数的对数值与反应循环数（Ct）值之间建立标准曲线.基因拷贝数的计算公式为：DNA 的拷贝数 = 6.02×1023（copies /mol）×DNA 浓度（g/l）/基因组 DNA分子量，微囊藻基因组为4.70 Mb，1 bp 碱基分子量为660 g /mol．扩增效率E = 10－1/S－1，S为标准曲线线性方程的斜率。

1.7 环境样品检测

在湖口的7 个监测点进行采样，水温26℃。用采水器采集表层20cm水样，每升水样加15ml 左右鲁哥试剂。1000 ml 水样直接静置沉淀24h，用虹吸管小心抽掉上清液，余下20～25 ml 沉淀物转入50 ml离心管中，4℃保存，带回实验室后利用显微镜镜检法进行藻细胞检测。用0.45m滤膜过滤收集藻细胞，置于－20℃条件下保存水样和藻细胞。按基因组 DNA 快速提取法提取DNA，并进行荧光定量PCR，检测样品中产毒微囊藻，每个样品重复3 次。

2 结果与分析

2.1 引物特异性检测

提取不同产毒藻种的基因组DNA 进行微囊藻毒素产毒基因mcyE/ndaF 和16SrDNA基因PCR 扩增，其中铜绿微囊藻 FACHB-315为微囊藻毒素产毒藻种，鱼腥藻 FACHB-82颤藻FACHB-528水华束丝藻FACHB-245 颤藻 FACHB- 1053 席藻 FACHB- 1099为鱼腥藻毒素产毒藻种，柱胞鱼腥藻FACHB-1039 为柱胞藻毒素产毒藻种，仅在微囊藻毒素产毒藻种铜绿微囊藻FACHB- 315 扩增出125 bp 左右目标条带，其他产毒藻种未扩增出目标条带，说明引物特异性较好；所有藻种的16S rDNA 基因均扩增出80bp左右的目标条带，表明藻种基因组 DNA 提取及 PCR 扩增体系无问题。对这些产毒藻种的荧光定量 PCR 结果表明，只有其中铜绿微囊藻 FACHB-315有荧光检测信号，其余藻种均未能扩增出信号。

2.2 荧光定量 PCR 灵敏度与重复性

2.2.1 标准曲线的建立 以铜绿微囊藻 FACHB-315基因组 DNA10倍梯度稀释后作为荧光定量 PCR模版DNA，进行qPCR测定。以标准品稀释后浓度的对数值为横坐标 Ct为纵坐标建立实时定量 PCR 的标准曲线，结果见图1。利用该 qPCR 反应条件检测微囊藻毒素产毒藻种，标准曲线斜率为－3.454，R2= 0.991，扩增效率 E=101/3.454－1= 94.6%，定量检测区间为1.689×104～ 1.689×108拷贝数/l。

图1 mcyE/ndaF 基因实时荧光定量PCR标准曲线

（A：实时荧光定量 PCR 曲线；B：标准曲线）

2.2.2 熔解曲线 以铜绿微囊藻 FACHB- 315 基因组 DN为模板进行荧光定量 PCR，并进行熔解曲线分析，熔解曲线平稳，峰尖且窄，熔解温度为80±0.5℃，表明该PCR 扩增产物特异，无非特异性扩增。

2.2.3 重复性 将不同浓度的铜绿微囊藻

FACHB- 315 基因组 DNA 进行荧光定量PCR测定，结果如表2 所示.基因组标准品的循环数变异系数分别为0～5.62%，表明基因组 DNA 的标准曲线稳定性良好，符合制备实时荧光定量PCR标准曲线的要求.

2.3 全细胞荧光定量 PCR 检测

将铜绿微囊藻 FACHB- 315 藻细胞进行10 倍系列稀释，分别取1 ml 藻样，提取基因组 DNA，进行 qPCR，结果如表3，可检测的藻细胞浓度最低为 3.26 ×104，mcyE/ndaF基因拷贝数为5.415×105，藻细胞浓度与mcyE/ndaF 基因的相关性良好（图1），可以根据样品中mcyE/ndaF基因拷贝数，利用 y =－3.454+ 49.88方程推测藻细胞浓度。

表2 荧光定量 PCR 重复性检测

表3 全细胞荧光定量 PCR 检测

3 讨论

在蓝藻水华暴发影响水质安全之前，快速准确地对产毒微囊藻进行监控是非常重要的。传统监测方法不能区分蓝藻水华中的产毒微囊藻与非产毒微囊藻.以微囊藻毒素产毒和节球藻毒素基因 mcyE/ndaF 为靶基因，应用实时荧光定量 PCR 方法可以快速准确的检测水体中的产毒微囊藻，可以同时检测多种产微囊藻毒素和节球藻素的不同藻种细胞，特异性强，灵敏度高、准确性好［3- 4］。本研究以微囊藻属、鱼腥藻属、柱孢藻属等8 种不同藻种，以 mcyE/ndaF 为靶基因进行常规 PCR 和荧光定量 PCR 检测，表明引物特异性非常高。该结果与 Al-Tebrineh等［3］的研究结果一致。

通过对产毒微囊藻铜绿微囊藻 FACHB- 315进行灵敏度和重复性检测，发现利用 qPCR对铜绿微囊藻的范围为1.689×104～1.689×108拷贝数/ l，灵敏度低于Vaitomaa 等的报道［7］，其对于铜绿微囊藻的检测范围为6.6×102～6.6×106mcyE 基因拷贝/反应体系，可能与藻基因组提取质量有关。本研究采用了一种DNA 快速提取方法，该方法可以高效快速地提取藻细胞 DNA，整个过程仅需20 min，DNA 提取质量经检测，纯度未达到 A260 /A280大于1.8，但可以用于高通量的普通PCR 反应和荧光定量PCR反应。在荧光定量 PCR反应中需加入2种试剂，即聚烙吡咯烷酮（PVP- 30）和牛血清蛋白 BSA，该试剂可以显著增强反应的灵敏度，降低反应对于模版质量的要求，与Xin等［6］的研究结果一致，对于高通量的荧光定量 PCR 反应十分重要。

通过荧光定量 PCR技术检测蓝藻水华高发季节，产毒微囊藻的数量，研究结果表明，产毒微囊藻主要由铜绿微囊藻构成。该方法可以快速准确地对产毒微囊藻进行监测预警，对于保证该区域的饮用水安全及了解湖水系对水质的影响具有十分重要的意义。

4 结束语

本研究建立了荧光定量 PCR 检测方法，该方法灵敏度高、精确度高、检测范围宽重复性好，相对于传统的显微镜检法，该方法可以研究水华发生提供方便快捷的检测途径。

参考文献：

［1］ 许 川，舒为群，曹 佳.我国水环境微囊藻毒素污染及其健康危害研究.癌变 畸变 突变，2007，（3）：202- 205．

［2］ 张敬平，肖付刚，赵晓联等.微囊藻毒素分析检测技术.北京：化学工业出版社，2009．

［3］ Al-tebrineh J，Gehringer M，Akcaalan R et al.A new quantitative PCR assay for the detection of hepatotoxigenic cyanobac-teria.Toxicon，2011，57（4）：546-554．

［4］ Rantala A，Rizzi E，Castiglioni B et al.Identification of hepatotoxin-producing cyanobacteria by DNA-Chip.EnvironmentalMicrobiology，2008，10（3）：653-664．

［5］ Ouahid Y，del Campo FFD.Typing of toxinogenic Microcystis from environmental samples by multiplex PCR.Applied Micro-biology and Biotechnology，2009，85（2）：405-412．

［6］ Xin ZG，Jeff PV，Melvin Q et al.High-throughput DNA extraction method suitable for PCR.Biotechniques，2003，34（4）：820-824．

［7］ Vaitomaa J，Rantala A，Halinen K et al.Quantitative Real-time PCR for determination of microcystin synthetase E copynumbers for Microcystis and Anabaena in lakes.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（12）：7289-7297.

论文作者:黄宗耀

论文发表刊物:《基层建设》2016年13期

论文发表时间:2016/10/19

标签：定量论文;  荧光论文;  基因组论文;  铜绿论文;  毒素论文;  基因论文;  引物论文;  《基层建设》2016年13期论文;