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摘要：目的：建立天津地区健康人群外周血中常用12种表型检测正常值的范围，为机体免疫状态的分析和研究提供参考。方法：采用特异性荧光抗体，分别对784例健康人外周血进行标记，采用FACSCalibur型流式细胞仪进行检测分析，SPSS19.0软件进行统计学处理。结果：获得了784例健康人外周血中常用12种表型（CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD19、CD29、CD 33、CD 34、CD38、CD45RA、CD56）细胞百分比的正常值参考范围。结论：在同一区域、种族间，初步建立统一的健康人群外周血常用12种免疫表型正常参考值，是有意义且必要的，更全面的反映了本区域种族内健康人群机体细胞免疫的状况，也为基础诊断和临床实践提供了参考。
关键词：天津；免疫表型；流式细胞仪；正常参考值
随着艾滋病、自身免疫病、各种肿瘤发病率的上升，人们对这些疾病的发病机理、病程发展、治疗效果等进行深入研究，发现疾病的发生与机体的免疫功能状态密切相关[1]。机体正常情况下，各种细胞群体保持一定的数量和比例，相互调节，维持着机体正常的免疫功能。当机体产生一系列病理变化及免疫功能失调时，因不能杀死入侵机体的病原微生物而引起疾病，此时部分细胞群体的数量及功能发生异常改变[2]。因此，对这些细胞免疫表型的相对百分率进行检测分析，是研究细胞功能的调控机制，又是临床早期发现、控制疾病、评价机体免疫状态、判断疗效的必要指标，而健康人群外周血中常用免疫表型正常值的建立又是上述研究工作的基础，具有重要价值。
目前国内对外周血免疫表型分析指标过少，不能全面评价机体免疫功能[3]。
许多研究表明，免疫细胞群体的分布比例与年龄、性别、种族、区域等因素有关，正常参考值存在差异。国内许多地区已纷纷建立了自己区域内的健康人群外周血免疫表型参考值范围，而我市目前尚未发现权威的数据资料。因此，本研究应用多种特异性单克隆抗体，对784名健康人外周血进行标记，用流式细胞仪检测和分析，建立本市健康人群外周血中常用12种表型正常值参考范围，以期为本市基础研究和临床研究提供依据，为中国健康人外周血正常值参考范围提供参考。
1 材料和方法
1.1研究对象
选择天津地区无免疫系统疾病史的健康志愿者784例作为研究对象。其中，男性394例，女性390例，年龄为15-65岁，平均年龄为41.2岁。
1.2主要仪器和试剂
仪器为：美国BD公司的FACS Calibur型流式细胞仪。
试剂为：美国BD公司的FACS溶血素（10×），CaliBRITE标准微球。美国Beckman-coulter公司的CD2-PE、CD3-PC5、CD4-APC、CD5-FITC、CD8-PE、CD19-APC、CD29-PE、CD33-PE、CD34-PE、CD38-FITC、CD45RA-FITC、CD56-PE标记单色荧光抗体及PE、FITC、APC、PC5单色同型阴性对照。
1.3实验方法
1.3.1样本制备
1采集：抽取研究对象外周静脉血2ml，每毫升血加入7.5%EDTA16μl抗凝，充分混匀待用，24小时内完成检测。
2处理：在绝对数管中分别加入100ul全血，20ul各单荧光标记的单克隆抗体，室温避光孵育20min。向每管中加入1.5ml FACS溶血素（1×），室温避光孵育10min。离心300g，5分钟，弃上清。再加入0.01M PBS2ml，离心300g，5分钟，弃上清。向每管中加入1%多聚甲醛PBS缓冲液300μl固定，静置20min，待上机检测。用相同方法平行设置Opticlone IgG抗体阴性对照。
1.3.2质量控制
样本上机检测前，使用BD公司的CaliBRITE标准微球和FACSCOMP自动校准软件，对仪器进行校正，包括PMT电压调节、荧光补偿调节和灵敏度测试，保证其荧光检测的CV值<2%，优化仪器检测条件至最佳状态后，方可上机检测。
1.3.3样本检测
进入MultiTEST自动软件，对制备好的待测样本及阴性对照逐一检测。以淋巴细胞设门，收集10000个细胞。根据流动细胞的前向散射光和侧向散射光得到DotPlot直方图，并框出淋巴细胞群，检测出淋巴细胞群中各表型的阳性表达率。
1.4统计学分析
将全部检测结果录入电脑，使用SPSS20.0软件进行统计学分析。数据结果均以x±s方法表示，用百分位数法确立95%置信区间，建立本市健康人群外周血常用12种表型的正常值参考范围。
2 结果
2.1调查对象的均衡性检测
将784名志愿者按性别和年龄组分类（见表1），年龄组与性别间χ2检验统计量为1.142（P=0.0899），证明此实验数据具有代表性。
3 讨论
人体维持正常的免疫功能状态有赖于各种免疫细胞。在正常情况下，各免疫细胞维持一定的比例。当疾病发生，出现免疫功能异常，免疫细胞数量比例也会发生不同程度的改变。将其与正常值比较，其差异可以客观地反映机体免疫状况，有助于判断病情进展及评价疗程效果[4]。建立健康人群外周血中免疫表型的正常值范围，是对病人进行免疫功能监测、研究免疫功能变化的基础工作，美国、意大利、土耳其等国已建立了本国统一的淋巴细胞亚群参考范围[1]。目前我国尚未建立统一的各免疫表型正常参考值。国内已有的一些报告也仅局限在区域内少数免疫表型的研究，或只关注在T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK淋巴细胞这几个有限的亚群上，其他免疫表型的参考范围鲜有报道。而本市此类研究报告更是罕见。一直以来大多数地方使用的正常参考值均参考国外标准，显然这不适合本市疾病诊断和治疗。因此，通过相应免疫细胞表面抗原的单克隆抗体检测表型，建立一套多项、稳定、本市自己的免疫表型正常值参考范围，是非常重要且必要的，极具有临床意义。
本研究已初步建立了本市正常人群外周血中常用12项免疫表型正常值参考范围，为基础研究和临床实践提供了有效的参考数据。虽然有些研究表明，部分免疫细胞表型分布比例会受年龄、性别及检测差异等多方面影响，然而其是否会成为导致检测结果具有显著性差异的因素，尚有待进一步研究证实。因此，今后将继续深入此调查工作，加大样本例数，细分样本类别，同时观察各疾病人群免疫细胞分布比例的变化，充实该研究。
参考文献：
[1]赵鹏飞，陈坤，赵要顺，等.流式细胞术检测健康成年人淋巴细胞亚群[J].生命科学仪器，2012，10（2）：19-21.
[2]李杰，刘楚钿，鄢心革，等.405名广东省籍健康成人外周血淋巴细胞亚群计数分析[J].华南预防医学，2008，34（1）：30-33.
[3]赵宏，焦顺昌，张国庆，等.不同年龄、性别的健康成年人21项淋巴细胞亚群分析[J].标记免疫分析与临床，2011，18（1）：99-102.
[4]邱志峰，王爱霞，陈鸿珊，等.用流式细胞仪检测HIV感染者和AIDS患者的T淋巴细胞亚群[J].中华实验和临床病毒学杂志，1999，13（1）：45-47.
论文作者:郑灿,金慧方,尹艳丽,郝世凯,曹蕾
论文发表刊物:《健康世界》2016年第28期
论文发表时间:2017/1/13
标签：表型论文; 免疫论文; 细胞论文; 正常值论文; 淋巴细胞论文; 健康论文; 机体论文; 《健康世界》2016年第28期论文;