崔艳芳[1]2003年在《液体高分辨核磁共振在蛋白质研究中的方法及其应用》文中提出本论文围绕液体高分辨核磁共振技术在蛋白质研究中的一些方法和应用展开研究工作。内容包括NMR实验技术的改进,NMR在蛋白质分子动力学以及蛋白质与配体相互作用研究中的应用。1.对近期液体高分辨核磁共振技术在蛋白质研究中的方法和应用方面的迅速发展(第一章),尤其是在蛋白质与配体之间的相互作用方面(第四章)进行了综述。简要概括了本论文所应用的蛋白质NMR谱学的基本原理(第二章)。2.研究了TCS-C7蛋白在溶液中的分子动力学性质。首先对TCS主链进行了顺序归属。其次发展了Clean SEA-HSQC脉冲序列,该技术可以选择性只检测与溶剂有交换的残基NH信号,而且不需氘代样品同样可以避免混合时间内由于纵向弛豫,及通过交换产生的来自于羟基,氨基质子的NOE杂信号的影响。将该技术应用于对TCS-C7的研究中,并与TCS-C7的溶剂接近度相对照,结果表明TCS-C7在溶液中的叁维结构与已报道的晶体结构非常相似。进一步对其主链15N的弛豫和1H-15N的NOE数据进行分析,得到了残基水平的分子动力学信息。(第叁章)3.随着蛋白质与配体结合研究的深入,开展了多个配体与单个蛋白相结合的研究。通过观测小分子配体的化学位移和纵向弛豫时间,对两个药物小分子配体(布洛芬与水杨酸)与人血清白蛋白(HSA)的竞争性结合进行了分析。由于竞争结合,当体系中一个配体浓度升高时会引起另一配体的游离态浓度增大,表现为化学位移向低场移动和弛豫速率降低。结果表明这两个配体在HSA分子上有一些共同的低亲和性结合位点。对于快交换体系,化学位移或弛豫速率的观测值是自由态与结合态配体的表观平均值,因而得以计算出结合态配体的浓度。(第五章)4.设计了横向弛豫加权的ROESY (CPMG-ROESY)实验,并用以表征两种配体与蛋白质的竞争结合及共结合。两种不同配体与蛋白质的共结合及竞争结合方
陆方[2]2004年在《NMR新技术的应用研究》文中提出核磁共振波谱是当代化学中一种重要的谱学研究手段,随着各种新技术的诞生,已成为21世纪科学研究不可缺少的工具。本课题利用超导核磁共振的新技术进行了1H、13C、29Si、27A1 NMR以及异核多量子相关二维谱的应用研究。 在对十种苯并恶嗪类化合物微观结构的研究中,利用1H NMR、13CNMR,系统而详细的讨论了这类化合物的主体结构及其取代基质子与碳原子化学位移的影响因素,得出了这类化合物的NMR谱特征。将HMQC、HMBC两种多量子相关二维实验应用于这类化合物的结构研究并用于确认取代基较为复杂的苯并恶嗪类化合物。 通过对一类新型含硅材料一笼形倍半硅氧烷结构的研究,总结了这类化合物中29si NMR的影响因素,即取代基R的电负性是影响29si化学位移的主要因素,R电负性增强29Si化学位移移向高场。实验过程中,首先利用1H NMR、13C NMR确认了笼上硅原子取代基的结构;然后通过29Si NMR研究了取代基对29Si化学位移的影响。 本课题利用27A1 NMR对A1(III)的水解反应、与有机物的配合反应进行了初步研究。主要是选取水杨酸、邻苯二酚、问苯二酚、对苯二酚这四种简单有机酚类作为官能团模拟化合物,讨论了水溶液pH值、L/M这两种因素对铝与有机物配位反应的影响,为以后研究AI(III)<WP=4>与有机物配合反应提供了有力的实验依据。
达文平[3]2008年在《Opiorphin溶液构象的初步分析》文中提出Opiorphin(Gln-Arg-Phe-Ser-Arg-OH)是一种在人唾液中分离得到的短肽分子,它能够通过在抑制两种锌金属肽链外切酶一中性肽链内切酶(NEP)和氨肽酶N(APN)对脑啡肽等内源性阿片肽的降解,增强它们的生物活性,如镇痛、抗抑郁等。大鼠实验表明它的镇痛作用是吗啡的6倍。本文的主要工作是通过2D-NMR的方法和分子动力学方法研究Opiorphin的空间构象。用固相合成的方法合成了Opiorphin。利用~1H化学位移、主链的~3JNα偶合常数和质子间的NOE分析了Opiorphin中可能存在的二级结构。从结果来看,在DMSO-d6溶液中Opiorphin呈无规则卷曲状态。我们又用分子动力学计算方法模拟了Opiorphin在水溶液的构象,结果表明Opiorphin在水溶液中也呈柔性无规则卷曲状态,此构象可能是Opiorphin与其受体结合前的一种状态,而柔性无规卷曲是两者正确结合的前提条件。第一章主要介绍了核磁共振技术在生物大分子研究中的应用,包括基本知识、标记技术的发展、TROSY技术的发展、蛋白拼接、固体高分辨核磁共振、低温探头的应用、核磁共振联用技术(LC-NMR)以及核磁共振在医学上的应用。第二章介绍了Opiorphin的研究背景和立题依据。主要介绍了锌金属肽酶及其抑制剂,Opiorphin等天然抑制剂的研究概况。通过对NMR方法的实验条件和图谱解析方法的概述说明了本文的立题依据。第叁章介绍了Opiorphin的固相合成以及NMR实验,通过二维图谱完成了对Opiorphin自旋系统的识别和顺序识别,并通过NOE,偶合常数法和化学位移指数法证明了Opiorphin在DMSO-d6溶液中呈柔性的无规则卷曲状态。第四章介绍了用GROMACS模拟了Opiorphin在水溶液中可构象,通过能量最小化、限制性运动和分子动力学计算得到了稳定的构象。通过对其空间构象的分析发现在水溶液中Opiorphin也是以柔性的无规则卷曲状态存在的。第五章是对本论文的研究总结,说明了本论文研究的主要结论和研究的不足之处与进一步工作的展望。
乔晓亚[4]2017年在《Pin1结构、稳定性及与磷酸化蛋白相互作用的核磁共振研究》文中研究指明Pin1是一个含有163个氨基酸的肽基脯氨酰同分异构酶,它由一个N端的WW结构域和一个C端的PPIase结构域组成。Pin1的WW结构域特异性识别含pSer/Thr-Pro基序的蛋白质,而它的PPIase结构域则催化相应肽键的顺反异构化。Pin1通过对磷酸化蛋白的结合与催化异构化调控一系列细胞过程,如细胞周期和细胞成长等。Pin1能够与链状的pSmad 2/3、pTau结合,从而影响神经组织中酶的形成,对于治疗神经性疾病有很重要的意义。如在老年痴呆症缠结的神经元纤维中,Pin1蛋白通过调节激酶、磷酸化酶的活性进一步调控与微管相关的Tau蛋白。Pin1蛋白能够识别并结合Smad3中的PEpTPPP结构,进而通过诱导泛素蛋白酶的降解来抑制TGF-β信号传递。在乳腺癌组织中,Pin1与蛋白激酶JNK的协同作用增强了磷酸化c-Jun调控cyclin D1启动子的转录活性,导致癌症基因cyclin D1的过表达。本论文主要采用配备了超低温探头的700 MHz高场液体核磁共振谱仪来研究Pin1 WW WT(野生株型)及单点突变体Pin1 WW S16R(G20D)的结构、稳定性及与人类疾病密切相关的几个磷酸化蛋白如pTau和pSmad3的相互作用。首先通过二维的1H-15N异核单量子相关谱(HSQC)和叁维的HNCO、HN(CO)CA、HNCA、HNCACB及CBCA(CO)NH谱确定骨架和支链的信号,然后通过5-25℃的核磁变温实验获得Pin1 WW单点突变结构域氢键的变化信息,根据核磁共振滴定实验获得Pin1 WW结构域与磷酸化多肽的相互作用位点信息。首先根据自然演变挑选出带不同电荷的Pin1 WW结构域S16R和G20D突变体,采用核磁的方法与野生株型的Pin1 WW结构域比较,研究它们的结构、稳定性及与磷酸化Tau的相互作用。采用牛血清蛋白(BSA)来模拟细胞环境,研究类细胞环境对于Pin1 WW结构域蛋白质结构、稳定性及与pSmad3相互作用的影响,首次反映了类细胞环境下原子分辨率水平的其它大分子蛋白对Pin1与磷酸化底物结合的影响。虽然BSA只是单一的大分子,不能模拟细胞内复杂的拥挤环境,但是可以初步的获得类细胞环境下的相关信息,为将来采用细胞裂解液或者真实细胞的相关实验提供参照。通过比较c-Jun中两个磷酸化位点与全长Pin1蛋白质的作用提出合理的多位点磷酸化c-Jun与Pin1的动态结合模型,阐明了Pin1特异性结合多位点磷酸化c-Jun的结构基础,为后期进一步细致研究Pin1蛋白质在乳腺癌等疾病中的作用机理打下基础。
叶成[5]2006年在《化学学科发展综合报告(2006)》文中研究说明一、引言(一)化学是承上启下的中心科学在进入了21世纪的今天,人们在谈论科学的发展时指出,"这将是一个生命科学和信息科学的世纪",那么究竟"化学还有什么用呢?"。诚如诺贝尔化学奖获得者HWKroto在回答这个问题时所述,"正是因为21世纪是生命科学和信
D.L.罗伯斯坦, 郭伟, 王宏钧, 吴鼎铭, 张惠苓[6]1990年在《核磁共振波谱学》文中研究表明引言核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance——NMR)波谱学是应用最为广泛的仪器方法之一,其应用范围从用高分辨NMR表征纯化合物到用磁共振成象法(MegneticResonance Imaging——MRI)诊断疾病。为了对NMR应用的广泛性有一具体的概念,我们用计算机检索了1985—1987年期间的文
李建平[7]2015年在《利用魔角旋转固体核磁共振解析蛋白质结构的标记方法和应用研究》文中指出魔角旋转固体核磁共振(Magic Angle Spinning Solid-state Nuclear Magnetic Resonance, MAS SSNMR)被认为是一种适合用于研究难溶解、难结晶的蛋白质结构的有力手段。其中,膜蛋白是MAS SSNMR非常重要的研究对象之一。膜蛋白是生物体内各种细胞活动的主要参与者和执行者,是一类极其重要的疏水性蛋白质。目前市场上约70%的药物靶点是膜蛋白。然而由于膜蛋白难以表达、疏水性及不易结晶等特点,使得这一类蛋白质的结构研究极其困难。MAS SSNMR在研究膜蛋白结构上有不可替代的四大优势：可以在天然膜环境或更接近天然膜环境的磷脂双分子层上进行膜蛋白结构的研究、在理论上固体NMR信号的线宽不受蛋白分子量的影响、能够提供膜蛋白动力学及其与其它蛋白或者小分子的相互作用信息,因此,这一技术在膜蛋白结构研究上具有很大的发展潜力。高分辨蛋白质结构的解析,尤其是对于大分子量的蛋白质、多聚体的膜蛋白及具有多个结构域的蛋白质的结构解析,依赖于大量的距离约束。然而,MAS SSNMR用于蛋白质结构研究的最大瓶颈正是很难获得足够数量的距离约束。其主要原因在于：(1)MAS SSNMR中谱峰重迭严重,很难准确归属谱峰对应的距离约束；(2)谱峰重迭难以通过增加实验维数来解决,如由二维实验到叁维实验,因为MAS SSNMR常用的13C和15N检测的灵敏度低,很难利用叁维或四维实验测量距离；(3)更重要的是,由于自旋核本身的物理属性限制,由自旋核之间偶极-偶极耦合作用较弱,获得的长程距离约束通常<6 A。针对这些问题,作者开展了叁方面的研究工作：实现了氨基酸选择性反标记和13C隔位标记方法、发展了用于MAS SSNMR的顺磁标记-赝接触位移技术(Pseudocontact shift, PCS)、结合多种同位素标记方法和顺磁标记技术研究膜蛋白DAGK(diacylgycerol kinase)单体间的界面及叁维结构。首先,利用模型蛋白GB1,我们摸索了不同的氨基酸进行反标记的效率。使用葡萄糖作碳源,F、W、Y、I、L、K和T七种氨基酸可以同时被反标记。使用[1,3-13C]-甘油或[2-13C]-甘油或[1-13C]-葡萄糖或[2-13C]-葡萄糖作碳源,我们在膜蛋白DAGK上系统对比了不同碳源的隔位标记效果差异,[1-13C]-葡萄糖和[2-13C]-葡萄糖的隔位标记样品分辨率略差于[1,3-13C]-甘油和[2-13C]-甘油隔位标记的样品分辨率,且信噪比远低于后者。对于膜蛋白样品,使用[1,3-13C]-甘油和[2-13C]-甘油进行隔位标记是更好的选择。然后,我们发展了用于MAS SSNMR的顺磁标记PCS方法来解析蛋白质的叁维结构。在这项工作当中,通过人为引入外源的磁各向异性顺磁金属离子,从MAS SSNMR谱图中获得PCS数据,结合使用Rosetta的结构计算方法,我们计算得到了一个高分辨率的蛋白质叁维结构。PCS在提供距离约束上具有质量高、效率高和数量多的优势,很有潜力成为用于研究具有挑战性地生物大分子的常规方法,比如研究膜蛋白及淀粉样蛋白质纤维的结构。最后,我们结合多种同位素标记方法及顺磁标记PRE (Paramagnetic relaxation enhancement)方法研究了膜蛋白DAGK在E.coli天然膜提取物中的四级结构和叁级结构。在这项工作中,我们找到了将稳定的DAGK叁聚体变性解聚成单体的方法,并能够将变性的DAGK单体重新组装成叁聚体。通过相关实验验证,经过变复性之后,DAGK的结构未发生改变,且保留较好的酶活性。结合多种标记方式和核磁方法,我们获得了膜蛋白DAGK的四级结构信息,证明DAGK在E.coli天然膜提取物中的四级结构与其在去垢剂DPC和油脂立方相LCP中的有相同性也有明显的差异性。在DAGK单体界面的研究过程中,我们使用了TEDOR、PDSD和分子间的PRE叁种方法。通过对比,分子间的PRE是更适合用于研究膜蛋白单体间界面的方法,它具有核磁共振实验操作简单、分子间距离约束信号容易归属、长程距离远和距离约束丰富的优势,势必会被更广泛的应用在膜蛋白的四级结构研究中。
蒋卫平, 王琦, 周欣[8]2013年在《磁共振波谱与成像技术》文中研究表明文章简要介绍了核磁共振的基本原理,详细阐述了液体核磁共振在蛋白质结构、功能和动力学等方面的研究进展,论述了增强固体核磁共振分辨率的方法及其应用,讲述了磁共振成像的原理并综述了不同磁共振成像方法的应用研究进展,并对核磁共振的发展作了展望。
李雯洁[9]2014年在《细胞因子白介素IL-21分子动力学与生物活性关系研究》文中研究表明白细胞介素IL-21由激活的CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞以及自然杀伤T细胞分泌,在先天性免疫以及适应性免疫反应中发挥出多重效果,其生物学活性则由IL-21与其同源的受体复合物结合从而被激活。最新研究得到IL-21的突变体将人hIL-21CD loop上的氨基酸用IL-4螺旋C上更稳定的氨基酸替换,之后激活受体的生物学活性增强十倍。生物活性的基础在于蛋白质在溶液中的动态行为,因此对蛋白质在体内动力学变化过程的研究,能够帮助我们揭示其作用机理。而核磁共振(NMR)技术可以提供分子动力学与分子间相互作用的信息,因此本论文首先通过优化复性方法得到具有生物学活性的蛋白质溶液,之后利用核磁共振技术归属突变体蛋白hIL-21/hIL-4的主链信号,并进行蛋白质分子动力学的弛豫分散实验,主要内容如下：1.重组蛋白在大肠杆菌(E. coli)中表达时大部分以包涵体形式存在,为了得到活性蛋白质溶液,成功复性很关键。而传统的分步透析复性常使中间态存在时间过长,蛋白易聚集。采用优化后的两步稀释透析复性,显着提高了透析效率与蛋白产量。之后采集mIL-21蛋白在磷酸盐buffer(pH8.5)中的一维氢谱,结果显示蛋白质在溶液中形成正确的叁级结构并具有生物活性,对后续主链归属奠定了较好的基础。2.在优化的复性条件基础之上,得到了15N、13C同位素双标记的重组嵌合蛋白hIL-21/hIL-4,运用液体高分辨核磁共振技术采集了二维15N-HSQC谱以及叁共振谱,对嵌合蛋白的大部分主链信号进行了归属及解析。3.通过15N弛豫来研究蛋白质动力学。进行了R2弛豫分散实验,在射频场强改变的条件下,采集一系列15N-HSQC谱,对不同弛豫速率R2用叁种运动模型进行曲线拟合,拟合结果显示与hIL-21相比hIL-21/hIL-4嵌合蛋白分子在溶液中的动态行为发生了变化,使螺旋C与CD loop区变得更加稳定,有利于增强其激活受体传导信号的生物学功能。
叶炎生[10]2015年在《细胞内蛋白质的~(19)F核磁共振方法与应用研究》文中进行了进一步梳理细胞内蛋白质核磁共振波谱(In-cell Protein NMR Spectroscopy)能够提供细胞中蛋白质原子水平分辨的构象及功能信息。然而,细胞内高浓度的生物大分子和环境的复杂不均一性使得NMR技术在细胞内蛋白质的研究中充满挑战。本文主要发展19F NMR方法研究活细胞内蛋白质的构象、动态以及弱相互作用并对细胞内蛋白质的共振信号增宽问题进行分析。具体内容如下：1.发展和完善适合细胞内NMR研究的蛋白质标记方法与策略。通过对多种蛋白质分别进行15N,13C,2H以及19F标记,采集相应的细胞内以及稀溶液中的核磁图谱。经比较分析,发现相比15N标记,15N、2H双标记使得细胞内的15N-'H HSQC谱图质量获得一定改善；不同于原核大肠杆菌,真核卵母细胞的13C甲基区域背景信号极强,对目的信号存在严重干扰；19F标记由于低背景干扰,适用于细胞内大分子量的蛋白质研究,可以发展成为适合原核细胞和真核细胞中NMR研究的蛋白质普适性标记方法。2.阐明细胞内蛋白质的核磁信号增宽机制。蛋白质在细胞内的核磁信号严重增宽,可能源于细胞内的粘度、蛋白质弱相互作用以及磁不均一性的贡献。在此,我们发展19F NMR方法区分并定量分析了这叁部分的贡献。发现不同细胞内蛋白质信号增宽的主要机制并不一样：原核大肠杆菌内主要来自粘度以及弱相互作用的影响,而在真核卵母细胞内则主要来自弱相互作用和磁不均一性的影响。另外,发现细胞内蛋白质转动扩散的尺寸效应源于弱相互作用。3.细胞内钙调蛋白激活机制的19F NMR研究。钙离子(Ca2+)介导钙调蛋白(CaM)构象的转变是许多信号传导路径中的关键环节。已有观点认为细胞内信号传导途径的激活受不同Ca2+浓度下CaM与不同目标物的相对结合力的调控。然而,细胞内CaM的构象变化、结合力以及结构是否与体外研究的结果一致仍有待验证。我们利用19F NMR方法直接观测完整卵母细胞内Ca2+诱导的CaM构象转变,并对不同Ca2+浓度水平下钙离子游离态和结合态进行定量分析。结果显示,在较低的Ca2+浓度下,相比CaM,结合MLCK (myosin light chain kinase)多肽的CaM复合物与Ca2+的结合力较高,说明细胞内MLCK可以在较低的Ca2+浓度下被激活,进而实现下游信号传导。我们还首次实现了细胞内蛋白质的19F赝接触位移(Pseudocontact shift, PCS)技术,可以用来获取细胞内蛋白质的长程结构约束信息。19F NMR方法在此对CaM的研究可以考虑推广到对活细胞内其它信号传导系统的研究。此外,我们还对细胞内α-突触核蛋白(SYN)及其磷酸化修饰的生理效应和人体细胞内目的蛋白质的富集方法进行了初步的探索。总之,我们发展了19F NMR方法适用于不同细胞内包括球形蛋白以及无结构蛋白的研究,定量表征了细胞内的粘度、蛋白质弱相互作用以及磁不均一性对细胞内蛋白质共振信号线宽的贡献,并发现细胞内蛋白质转动扩散的尺寸效应源于弱相互作用。利用发展的19F NMR方法,我们证实了细胞内CaM的激活机制,并首次将19F PCS应用于细胞内蛋白质的结构解析,推测CaM与下游蛋白MLCK形成的复合物在细胞内和稀溶液中具有类似的结构。另外,利用细胞内核磁共振技术我们的初步研究结果表明SYN及其磷酸化修饰在细胞内具有不同的生理效应。
参考文献：
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[2]. NMR新技术的应用研究[D]. 陆方. 北京化工大学. 2004
[3]. Opiorphin溶液构象的初步分析[D]. 达文平. 兰州大学. 2008
[4]. Pin1结构、稳定性及与磷酸化蛋白相互作用的核磁共振研究[D]. 乔晓亚. 湘潭大学. 2017
[5]. 化学学科发展综合报告(2006)[C]. 叶成. 化学学科发展研究报告(2006). 2006
[6]. 核磁共振波谱学[J]. D.L.罗伯斯坦, 郭伟, 王宏钧, 吴鼎铭, 张惠苓. 光谱实验室. 1990
[7]. 利用魔角旋转固体核磁共振解析蛋白质结构的标记方法和应用研究[D]. 李建平. 中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所). 2015
[8]. 磁共振波谱与成像技术[J]. 蒋卫平, 王琦, 周欣. 物理. 2013
[9]. 细胞因子白介素IL-21分子动力学与生物活性关系研究[D]. 李雯洁. 华中师范大学. 2014
[10]. 细胞内蛋白质的~(19)F核磁共振方法与应用研究[D]. 叶炎生. 中国科学院研究生院(武汉物理与数学研究所). 2015