徐斌
（上海市浦东新区人民医院 上海 201299）
【摘要】 目的：探讨常见的三种胆结石胆汁中微生物群落的差异性对比。方法：选择2011年3月—2013年3月我院收治的三种类型胆结石患者100例作为研究对象，对其运用末端限制性片断长度多态性(T—RFLP)技术，并对其胆汁细菌群落进行基因序列分析探讨。结果：根据统计结果来看，就细菌16SrDNA基因片段而言，其阳性检出率为76%，且三组间的差异比较无统计学意义，胆色素结石组主要包括厌氧消化球菌等，胆固醇组的细菌群落以金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌为主，混合性结石胆汁组主要是丙酸杆菌和厌氧消化球菌。结论：据我院统计分析看来，就检出率方面来看，较高的是胆结石患者胆汁标本中的细菌，但各组细菌群落构成各有不同，具有较为复杂的成分
【关键词】 微生物群落；胆结石；差异性
【中图分类号】R31 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）16-0063-02
近年来，我国的胆结石发病率呈逐渐上升趋势，目前约为5.6%，就其发生机制方面来看，已然从胆汁郁滞、肺道感染及胆汁理化性质紊乱发展为了胆囊内微生物环境的改变，基于此，我院选择收治的三种类型胆结石患者，并利用末端限制性片断长度多态性技术对患者的胆囊内微生物菌落16SrDNA进行了统一分析，现报告如下：
1.资料和方法
1.1 一般资料 选取我院2011年3月～2013年3月收治的100例三种类型胆结石患者为研究对象，其均接受择期胆囊切除术，其中男36例，女64例，患者的平均年龄为55岁，我院结合对胆石化学成分用红外光谱法的分析，将患者分为三组，分别为混合性结石组28例，纯胆固醇结石组50例，另外，有22例为胆色素结石组。
1.2主要仪器和试剂 为了提高实验的准确性，用了ABI3100全自动遗传分析仪、ABI2720 PCR热循环仪、ZF型紫外分析仪以及低温高速台式离心机MR23i等，Hi－Di 甲酰胺，Liz500和细菌16S r DNA PCR扩增试剂盒。
1.3 胆汁DNA的提取 研究中，取胆汁1 ml与1mlBuffer I，并涡旋振荡充分混匀，在此基础上，加入溶菌酶( 50 g/L)100μl，在37℃下培育1h，并将离心管置于液氮中5 min，继而迅速向水浴锅（65℃）转移，进行3min解冻，进行反复3次，接下来加0.5ml bufferⅡ，上下摇匀后，向其中加蛋白酶K共5μl，进行1h水浴。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆完成上述操作后，按照1:1比例向上述溶液中加入比例为25:24:1的加酚/氯仿/异戊醇混合液，离心5min，用一灭菌塑料离心管吸上层水相800μl，并将上述三种的混合液进行等体积加入，加入两倍体积的无水乙醇，离心30min，13000 r/min，继而将上清去弃去，进行真空干燥后，将30～50μlTE缓冲溶液加入其中，对DNA进行充分溶解，并保存于-20℃的条件下。
1.4 T－RFLP分析 在此环节，我院研究人员将0.2μl的Liz500、10μl Hi－Di甲酰胺与纯化、酶切后的PCR产物进行混合，继而于ABI3130遗传分析仪中实施毛细管电泳，所取基线的荧光强度50 RFU，并对大于基线的峰高和出峰处的T－RF长度用Genemapper软件进行计算，标准化处理大于50 bp的峰面积，对其丰度进行计算，完善整个过程。
1.5 克隆文库的构建、测序 研究中，借助于非荧光标记的引物，PCR扩增各组阳性样品的细菌16S r DNA片段，继而采用E.coli DH5α菌株和 pGEM－Teasy 载体、进行细菌16S r DNA文库的建立，在此基础上，对细菌克隆文库中随机挑选的阳性克隆利用PCR－T－RFLP分析进行分型筛选，然后进行测序，在此基础上获得细菌16S r DNA部分序列，接下来用Blast与GenBank中核酸数据实施序列比对，完成整个分析。
1.6 统计学处理 本次研究中，我院在统计分析方面采用了SPSS17.0统计学软件，率的比较采用Fisher's Exact test分析来进行，试验中三组间差异比较具有统计学意义用P＜0.05表示。
2.结果
研究统计结果显示，参与研究的100例患者中，检出细菌 16S r DNA 基因片段的有76例，所以其对应的阳性率达到了76%，三组中纯胆固醇结石胆汁组阳性检出率为80%，混合性结石胆汁组为78.5%(22/28)，胆色素结石胆汁组为63.6%（14/22），三组阳性检测率比较差异不具统计学意义（P＞0.05）。
本次研究中，在胆汁细菌16S r DNA PCR的T－RFLP分析方面。较高的是胆结石患者胆汁标本中的细菌，但各组细菌群落构成各有不同，具有较为复杂的成分。
3.讨论
本次研究中，我院对于胆囊结石患者体内的胆汁标本，运用PCR技术进行了16S r RNA 基因片段扩增，其不同于常规细菌培养分析，具有灵敏度高、特异性强等优势，能检出1个细胞或1个细菌存在的单拷贝基因，并能结合细菌染色体上16S r RNA这种最保守的基因序列设计引物，使得从胆汁提取的DNA中特异性能对16S r RNA基因片段进行的有效扩增，从后续的实验统计及分析来看，100例胆汁标本中，检出细菌16S r DNA基因片段的达到了76例，检出率达76%，这一结果与以前的相关研究一致[1]，相比于胆色素组及混合性结石组，纯胆固醇结石组中胆汁细菌阳性率更高，但三组细菌的阳性检测率间的差异比较不具统计学意义，经我院后续研究来看，可能是因患者有反复慢性胆囊炎发作病史所致，使得其对应的细菌阳性率较高。
厌氧菌和需氧菌是胆汁检测细菌的两大分类，前者从菌株上主要由丙酸杆菌、消化球菌等组成，后者则是以大肠杆菌为主，序列测定细菌的DNA后，统计分析显示，纯胆固醇结石胆汁组存在单一细菌群落，深入研究后发现，其以需氧菌为主，此组外的两组，也就是混合性结石胆汁组、胆色素结石胆汁组与前组不同，其具有丰富的细菌群落，厌氧菌及需氧菌都有，本研究未测出耐胆汁酸盐菌株序列，可能与该菌在胆囊中数量过低等有关。
综上，据我院统计分析看来，就检出率方面来看，较高的是胆结石患者胆汁标本中的细菌，但各组细菌群落构成各有不同，具有较为复杂的成分。
【参考文献】
[1]刘晶华,王敏,邹玉.常见三种类型胆结石胆汁中细菌群落的检测[J].临床肝胆病杂志,2012,07:522-524+527.
论文作者:徐斌
论文发表刊物:《医药前沿》2015年第16期供稿
论文发表时间:2015/8/10
标签：胆汁论文; 细菌论文; 胆结石论文; 结石论文; 群落论文; 检出论文; 患者论文; 《医药前沿》2015年第16期供稿论文;