【摘要】 目的 研究吸入性麻醉药异氟醚预处理对脂多糖诱导的小鼠脑实质的急性炎症的影响,探究异氟醚减轻炎症反应的可能机制.方法 将３６ 只C５７BL/６小鼠随机分为对照组和异氟醚组,每组１８只.异氟醚组吸入１．４％异氟醚加１００％氧气２小时,对照组仅吸入１００％氧气.采用侧脑室注射内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)方法诱导小鼠脑实质急性炎症反应.采用实时荧光定量PCR法(RT－PCR)检测两组小鼠脑组织中肿瘤坏死因子(TNF－α)、白细胞介素－１β(IL－１β)和白细胞介素－６(IL－６)mRNA表达水平,用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测TNF－α,,IL－１β和IL－６蛋白表达水平.结果 异氟醚组小鼠脑组织中TNF－α,,IL－１β和IL－６基因及蛋白表达水平均明显低于对照组(P＜０．０５~０．００１).结论 吸入性麻醉药异氟醚通过抑制脑组织中TNF－α,IL－１β和IL－６等炎性细胞因子的释放来减轻脂多糖诱导脑实质急性炎症反应. 【关键词】 异氟醚; 麻醉; TNF－a; IL－１β; IL－６ 【中图分类号】R３９４．２【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－０６４５－０２
阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种以记忆力和高级认知功能进行性减退为特征的神经退行性病变,对老年人的生活质量造成严重威胁[１].神经炎症,其中包括被激活的小胶质细胞、星形胶质细胞和神经元,在AD等神经退行性疾病中发挥重要作用.大量研究表明局部炎症反应可能是AD的重要病理特征,被激活的小胶质细胞在神经退变中形成长期的炎症反应,最终导致神经元凋亡或死亡[２].全球每年约有２亿人进行麻醉和手术.异氟醚作为一种吸入性全身麻醉药,是目前临床常用的吸入麻醉药物之一,其对神经炎症的作用一直存在争议.一些研究表明麻醉与手术可能会加重AD,尤其是吸入性麻醉药有可能会促进该疾病发生病理变化[３].而另一些研究则持不同观点.一项最新研究显示麻醉药物异丙酚能改善老龄小鼠和AD转基因小鼠的认知能力[４].本研究通过侧脑室注射脂多糖(lipopoＧlysaccharide,LPS)建立了小鼠脑内炎症模型,探究了吸入麻醉药异氟醚对小鼠脑实质急性炎症的影响,旨在为麻醉药的临床应用提供理论依据.
１ 材料与方法
１．１ 实验材料 主要试剂和仪器:异氟醚(isoflurane,日本Dinabot公司).Narcomed２B麻醉机(Drager公司),麻醉箱(双玉仪器设备有限公司),多功能气体检测仪(Datex－ohmeda,芬兰),肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactoralpha,TNF－a)、小鼠白细胞介素－１β(interleukin－１β)、小鼠白细胞介素－６(interleukin－６)、EL１SA试剂盒(博士德公司),TrizolRNA分离液(美国ProＧmega公司),引物(上海生工公司).RNA提取试剂盒(美国Omega公司),实时荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司).反转录试剂盒(PrimeScriptTM RTPCRKit,宝生物工程有限公司).SYBRPremixExTaqTM 试剂盒(宝生物工程有限公司).实验动物:C５７BL/６小鼠,共３６只,８周龄,体质量为(３０±０．５)g,购自上海市实验动物中心,饲养于屏障系统的洁净层流架内(SPF级),１２h明暗轮流光照,自由饮食.室温(２５±１)℃,相对湿度４０％~６０％. １．２ 实验方法
１．２．１ 实验动物 将小鼠鼠采用随机数字法随机分为对照组和异氟醚组,放入密闭有机玻璃麻醉箱内.麻醉箱进气端接麻醉机,出气端接多功能气体检测仪.对照组仅接受１００％氧气的作用２h.而异氟醚组除氧气外同时接受１．４％异氟醚作用相同时间.实验小鼠麻醉室的温度控制在３７±０．５摄氏度.麻醉后将小鼠转移到通有１００％氧气的饲养室中,直到小鼠恢复翻正反射.参照邓小华等[５]方法,对小鼠侧脑室注射内毒素脂多糖(lipopolysacchaＧride,LPS).异氟醚预处理６h、１２h和２４h后处死小鼠,于冰盘上快速剥离脑组织,以冰冷的PBS冲洗,滤纸吸干,立即于电子天平秤重.
１．２．２ RNA提取和半定量RT－PCR 利用半定量RT－PCR 实验进行研究,包括TNF－α,IL－１β和IL－６ 三种蛋白因子,其特异性引物也根据有关文献进行了设计(表１).本实验中,以GAPDH 的转录水平作为内对照.采用总RNA提取试剂盒提取样品中的总RNA.用反转录试剂盒进行反转录,得到cDNA后用SYBRPremixExTaqTM 试剂盒在罗氏４８０ 仪器上进行荧光定量PCR 反应.用于荧光定量PCR的引物序列见表１.采用GAPDH 作为内参基因,用２－△△CT方法来定量基因表达的相对变化倍数.
２．３ 异氟醚对小鼠脑组织IL－６表达的影响 异氟醚对小鼠脑组织IL－６ 表达的影响见图３．异氟醚预处理也同样明显降低了IL－６的表达水平.与对照组相比,异氟醚预处理６h、１２h和２４h后,IL－６ 基因表达水平分别降低了９％、４８％和４４％(图３A),IL－１β蛋白表达水平也分别降低了５９％、７０％ 和６７％(图３B),差异具备统计学意义(P ＜ ０．００１).结果进一步证实了异氟醚预处理可能通过抑制小鼠脑组织中炎症细胞因子的释放来减轻脂多糖诱导的脑实质急性炎症反应.
３ 讨论
脂多糖是组成革兰氏阴性细菌细胞壁的一种成分,在动物体内可引起强烈的免疫反应,是炎症反应和免疫系统的主要激活物之一,能导致细胞因子的释放、炎症发生、败血性休克及器官损伤.动物脑内炎症模型可通过侧脑室注射LPS建立[５－６].邓小华等[５]研究发现LPS能诱导小鼠脑室周围的脑实质内的小胶质细胞激活,并上调了小胶质细胞内番茄凝集素的表达.麻醉药物可直接作用于炎症细胞,也可以通过影响炎症介质,如细胞因子等,而起到促进或抑制炎性作用.TNF－α,IL－１β和IL－６是目前研究较多的细胞炎性因子,它们能引起强烈的炎症反应,与AD发病相关.TNF－α主要由单核细胞分泌,是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质,可促使其他细胞因子如IL－１的合成和释放.IL－６能诱导B细胞分化和产生抗体,并诱导T细胞活化增殖、分化, 参与机体的免疫应答,是炎性反应的促发剂.有研究显示神经炎会导致人认知损害和动物学习记忆障碍[７].TNF－α,IL－１β和IL－６等被报道与动物学习记忆障碍相关[８].杨炼红等[９]研究了广东地区汉族人群中TNF－α基因多态性与散发性阿尔茨海默病的关系,发现TNF－α２等位基因与散发性阿尔茨海默病的易感性有关. 大量研究表明异氟醚等吸入麻醉药与细胞抗炎及抗凋亡作用相关.本研究发现,吸入性麻醉药物异氟醚预处理可以明显抑制小鼠脑组织中TNF－α,IL－１β和IL－６的产生,证明了异氟醚具有抗炎作用,能够抑制促炎细胞因子的产生,在一定的程度上减缓LPS诱导的脑实质急性炎症反应.说明吸入性麻醉药物有可能改变手术或炎症产生的炎症因子和抗炎细胞因子间的平衡.Lee等[１０]研究表明异氟醚通过下调小鼠血浆中TNF－α和IL－６水平,减少腹膜炎败血症所致的肝肾功能损害和死亡率.Adam 等[１１]研究显示大鼠腹腔注射吸入麻醉药能够降低脂多糖诱导的IL－６/IL－１０的比率并能减轻炎症反应.另外,异氟醚预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用,其机制与抑制缺氧区神经细胞内源性NF－κB信号通路而减少炎症反应有关. 也有实验结果显示,直接给予大鼠异氟醚上调了大鼠肺脏炎性因子的水平. 麻醉药既有促炎作用,又有抗炎作用,可能是因为实验条件(如药物种类和剂量等)及炎症模型不同. 麻醉药就被大量用于临床手术中,其对神经炎症的影响一直存在争议,其机制尚不清楚.本研究显示异氟醚通过抑制细胞炎症因子产生抗炎作用,可应用于手术上的免疫和抗感染等方面,对临床上麻醉药物的使用提供了依据. 参考文献[１] 张海廷,王薇,王淑辉等．干细胞移植治疗阿尔茨海默病研究进展[J]．中华神经医学杂志,２０１４,１３(３):３１９－３２２． [２] TuppoEE,AriasHR．TheroleofinflammationinAlzheimer’sdisease．[ IntJBiochemCellBiol,２００５,３７(２):２８９－３０５． ３] Xu Wu,Yan Lu,Yuanlin Dong,etal．Theinhalation anestheticisofluraneincreaseslevelsofproinflammatoryTNF－α,IL－６,andIL－[ １β．NeurobiologyofAging,２０１２,３３(７):１３６４–１３７８． ４] HaijunShao,YiyingZhang,YuanlinDong,etal．ChronicTreatmentwithAnestheticPropofolImprovesCognitiveFunctionand AttenuatesCaspaseActivationinBoth Agedand Alzheimer＇sDisease Transgenic[ Mice．JournalofAlzheimer＇sDisease,２０１４,４１(２):４９９－５１３． ５] 邓小华,蔡维君,李昌琪,等．LPS 诱导小鼠脑小胶质细胞的激活及[ Tomatolectin的表达变化[J]．神经解剖学杂志,２００６,２２(６):６３４－６３８． ６] 甄瑾,李润今,王梅玲．脂多糖诱导的阿尔茨海默病炎症模型的建立[J]． 内蒙古医学杂志,２０１０,４２(９):１０３８－１０４１． [７] CzerniawskiJand GuzowskiJF．Acute neuroinflammationimpairscontextdiscriminationmemoryanddisruptspatternseparationprocessesinhippocampus．TheJournalof Neuroscience,２０１４,３４(３７):１２４７０[ －１２４８０． ８] Sparkman,N．L．,Buchanan,J．B．,Heyen,J．R．,etal．Interleukin－６facilitateslipopolysaccharide－induceddisruptioninworkingmemoryandexpressionofotherproinflammatorycytokinesinhippocampalneuronal[ celllayers．J．Neurosci．２００６,２６(４２):１０７０９–１０７１６． ９] 杨炼红,蒋龙元,刘中霖等．阿尔茨海默病中肿瘤坏死因子－α基因多态性及表达[J]．中华神经医学杂志,２００６,５(７):６９６－６９８． [１０] LeeHT,EmalaCW,JooJD,etal．Isofluraneimprovessurvivalandprotectsagainstrenalandhepaticinjuryin murinesepticperitonitis．[ Shock,２００７,２７(４):３７３－９． １１] Adams SD,Radhakrishnan RS, Helmer KS,et al．Effects ofAnesthesia on Lipopolysaccharide － Induced Changes in SerumCytokines．JTrauma,２００８,６５(１):１７０－１７４．
论文作者:胡骕 彭彪,通讯作者 罗冬冬 赵海林 李莉华 李丹 贺颖芳
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/4
标签：小鼠论文; 炎症论文; 麻醉药论文; 多糖论文; 诱导论文; 细胞因子论文; 细胞论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;