（浙江中医药大学 生命科学学院，浙江 杭州，310053）
摘 要：[目的]研究miRNAs在心室间隔缺损（Ventricular Septal Defect ，VSD）中所扮演的角色。[方法]采集5例VSD患儿与4例正常婴儿全血样本进行miRNAs表达谱芯片实验，所获结果用生物信息学软件预测，筛选具有研究潜力的靶基因与信号通路，利用qRT-PCR和Western Blot法检测关键通路中靶基因的mRNA水平和蛋白表达水平，分析miRNAs与其靶基因以及相关通路间的关系。[结果]得到差异表达的miRNAs22个，预测获得10677个靶基因和150条信号通路，进一步分析得到与心室细胞发育有关的TGF-β/SMADs信号通路。在VSD患儿中，参与该通路的4个靶基因TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2的转录水平和蛋白表达水平均显著降低。[结论]hsa-miR-409-3p与hsa-miR-487a-5p的异常上调表达会抑制其靶基因TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2的转录与表达，从而抑制整个TGF-β/SMADs信号通路，继而使心室间隔分化异常，促使VSD发生。
关键词：心室间隔缺损；miRNA表达谱芯片；TGF-β/SMADs信号通路；
The roles of miRNAs diffierential expression and abnormal TGF-β/SMADs signaling pathway in occurrence of newborn
Ventricular Septal Defect
JIANG Yuan-qing, Zhang Lin*
（Zhejiang Chinese Medicial University College of Life Sciences, Hangzhou, ZheJiang, 310053, China）
Abstract: [Objective]To study the role of miRNAs in ventricular septal defect. [Methods]The blood samples of five VSD infants and four normal infants were collected for miRNAs expression profiling chip experiment. The miRNAs chip results were predicted and searched for the potential target genes and signal pathways by bioinformatics software. The mRNA and protein expression levels of target genes in key pathways were detected by qRT-PCR and Western blotting. We can analyze the relationship between miRNAs、their target genes and related pathways. [Result]22 differentially expressed miRNAs were obtained, and 10677 target genes、150 signaling pathways were predicted and searched. The TGF-β/SMADs signaling pathwayassociated with Ventricular myocytes development was further analyzed, and four target genes TGFBR1, TGFBR2, HAND1 and FOXA2 were involved in this pathway and their transcription and protein expression levels were significantly decreased in the VSD group. [Conclusion] The up-regulated expressed hsa-miR-409-3p and hsa-miR-487a-5p inhibits transcription and protein expression of four target genes TGFBR1, TGFBR2, HAND1 and FOXA2. Thus inhibiting the entire TGF-β/SMADs pathway so that ventricular septal myocytes abnormal differentiation and development, promoting the occurrence of VSD.
Keywords Ventricular Septal Defect; MiRNAs Expression Chip; TGF-β/SMADs pathway;
先天性心脏病（congenital heart disease 简称CHD）指婴儿在胚胎发育时期心脏发育畸形的疾病，CHD的发病率很高，目前其已成为婴儿出生缺陷以及非感染死亡的首位病因[1]。VSD是CHD病症中最常见的一种，占CHD的20%[2]。而其中复杂型VSD，即VSD与其他畸形杂糅而引起的致死性综合症，更是超过了CHD总数的50%，最后患儿将会心力衰竭而死亡[3,4]。近几年，国内外学者越来越关注研究这类先天性心脏病的调控与分子发生机制，但由于心脏发育异常的涉及的基因、通路以及作用机制非常复杂，VSD的发病原因与发病机制仍未阐明。
MicroRNA（miRNAs）为非编码单链小分子RNA（约21-25nt）[5]。在机体中，miRNA可通过调节控制其靶基因的翻译表达，参与大部分靶基因的信号通路，进而对发育或是生理过程进行调控[6]。在VSD的病理状态下，血液中一部分miRNA的表达水平会有显著变化，可作为标志物有助于VSD的预测和诊断[7,8]。在后基因组时代，miRNA表达谱技术提以其高速度筛选和高通量的优点成为目前的热门研究技术，也为系统探索VSD的完整发生机制提供了高通量的技术手段[9,10]。利用高通量的miRNA表达谱技术，生物数据库挖掘技术、核酸蛋白验证技术（qRT-PCR、Western Blot等），我们可系统性地分析与探索VSD发生相关的差异表达miRNAs、及其调控的靶基因与信号通路之间的关系，从而阐明miRNAs在VSD分子发生机制中的作用。
1 材料与方法
1.1主要材料与试剂
MicroRNA microarray-miRBase human 20.0版μParaflo?芯片（LC杭州公司）； TaKaRaSYBR?Premix Ex Taq?（RR420A）、qRT-PCR试剂盒TaKaRa PrimeScript?RT（RR037A）（TaKaRa）；抗兔单抗血清、山羊抗兔血清IgG/HRP（艾碧康）；PAXgene?采血管（Qiagen）。
1.2研究样本的选择与采集
本研究研究样本均来自浙江绿城心血管病医院。从该院经过胸部X片、心脏彩超确诊患有单纯型VSD的患病婴儿中选5例设为VSD患病组。从该院经过体检没有心脏疾病的健康婴儿中从选4例设为正常对照组。选择样本时的生理指标（性别、年龄、出生时体重、妊娠期时间等）尽可能保持一致。研究符合医学伦理学标准并得到浙江绿城医院伦理委员会批准，所有血液样本采集均经家属的同意，并告知样本将用于研究。
静脉采集两组婴儿的外周血血液样本，参照PAXgene?采血管产品说明书进行。采后样本-20℃冻存24小时后转移至-80℃冰箱内保存。
1.3 miRNAs表达谱实验
Trizol法提取患病组与正常组全血样本中的总RNA，分离纯化质检合格的RNA。尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定经富集所获miRNAs，将经过双色荧光标记的miRNAs样品与miRNAs互补探针微阵列μParaflo?芯片（20.0版μParaflo?芯片）进行杂交。扫描杂交洗涤后的芯片，用相关图像软件对芯片图像进行归一化处理与数据分析。按照4次重复取中间值进行数据标准化，并计算VSD患病组与正常组芯片信号的log2比值和t 检验的p值。按照log2比值绝对值大于1且p≤0.1的标准筛选显著差异表达的miRNAs。具体芯片实验操作由LC杭州分公司进行。
1.4靶基因预测与信号通路搜索
用靶基因预测软件miRbase、Targetscan和Miranda分别预测差异表达的miRNAs，并将所得结果取交集。KEGG与REACTOME通路数据库搜索差异表达miRNAs靶基因的所有相关信号通路。用Fisher's法精确计算每个通路的p值对通路进行筛选（以p <0.05为筛选标准）。
1.5 qRT-PCR实验检测关键通路靶基因
GAPDH为内参基因。利用qRT-PCR检测关键通路中靶基因的转录水平，实验步骤按照试剂盒TaKaRa PrimeScript?RT和TaKaRaSYBR?Premix Ex Taq?的使用说明进行。
1.6 Western Blot实验检测关键通路靶蛋白
Western Blot法检测关键通路中靶蛋白表达水平，内参为GAPDH蛋白。离心提取外周血细胞中的总蛋白并检测其浓度，根据所测浓度设置SDS-PAGE电泳上样量与缓冲液体积。电泳分离蛋白质并转膜。转膜后的蛋白质条带封闭、洗涤后加入稀释比例为1：1000的一抗兔单抗血清，摇床孵育过夜。再次洗涤后，加入稀释比例1：10000二抗山羊抗兔IgG/HRP孵育。洗涤条带后加入显影液ECL处理。用成像仪曝光成像，并计算蛋白质条带的灰度值。Western blot 实验步骤按照张丽萍所著文献进行操作[11]。
2 结果与分析
2.1 差异表达miRNAs列表
经分析，符合筛选标准的显著差异表达miRNAs共有22个。其中19例表达下调，分别为：hsa-miR-4506、hsa-miR-6511-3p、hsa-miR-6844、hsa-miR-6068、hsa-miR-6828-5p、hsa-miR-6858-3p、hsa-miR-372-5p、hsa-miR-548j-3p、hsa-miR-769-3p、hsa-miR-488-5p、hsa-miR-3936、hsa-miR-383-3p、hsa-miR-6864-5p、hsa-miR-6838-3p、hsa-miR-4530、hsa-miR-4518、hsa-miR-744-3p、hsa-miR-6779-3p、hsa-miR-658；3例上调，分别为：hsa-miR-23c、hsa-miR-409-3p、hsa-miR-487a-5p。22个差异表达的miRNAs聚类图结果见图1。
图1 5例VSD患病组和4例正常对照组血液样本miRNAs微阵列表达谱热聚图
Fig.1 miRNAs cluster analysis heat map in VSD group (n=5) and normal group (n=4)
注：22个miRNAs名称位于右侧；VSD和正常组中样本的编号位于顶部；热聚图的颜色代表miRNAs表达水平的不同，红色代表表达量高，绿色代表表达量低；左侧为miRNA聚类树，对22个miRNAs在不同样本中的表达量进行聚类。Note: the 22 differentially expressed miRNAs names are located in right side; samples number in the VSD and normal groups are at the top; the color in heat map shows expression level of miRNAs , the red shows high expression level, the green shows low expression; Cluster tree is in the left side. It means the different expression level of 22 miRNAs clustered into tree in different samples.
2.2靶基因预测结果
Targetscan，Miranda和Mirbase搜索预测得到22个差异表达miRNAs的靶基因共10677个。经进一步生物信息学基因功能分析，得到许多可能涉及心脏发育、心肌分化等过程的靶基因（表1）。
2.3 信号通路分析结果
KEGG数据库与Reactome生物化学反应数据库搜索得到10677个靶基因所参与的150个相关信号通路（p值<0.05）。经过进一步分析，发现TGF-β/SMADs通路与中胚层及心脏发育、心室肌细胞的分化密切相关, 参与该信号通路的差异表达miRNAs的靶基因分别为TGFBR1（Transforming Growth Factor Beta Receptor Type 1?）、TGFBR2（Transforming Growth Factor Beta Receptor Type 2）、HAND1（Heart and Neural Crest Derivatives Expressed 1?）和FOXA2（forkhead box A2?）（图2）。
图2 TGF-β/SMADs信号通路
Fig. 2 TGF-β/SMADs signaling pathway
注：红色框显示已筛选得到的相关靶基因。Note: Red boxs represent the screened target genes.
2.4 关键靶基因的转录水平结果
qRT-PCR检测VSD患病组和正常对照组全血样本中4个关键靶基因（TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2）的转录水平。与正常对照组相比，VSD患病组中靶基因转录水平都显著降低（图3）。
图3 VSD组与正常对照组中的4个关键靶基因转录水平
Fig. 3 Transcription level of four key target genes in the VSD and normal group
注：*表示与正常组相比，P值＜0.05；**表示与正常组相比，P值＜0.01。Note: * represents p value is less than 0.05 compare with normal group; ** represents p value is less than 0.01 compare with normal group。
2.5 关键靶蛋白表达水平检测结果
Western Blot检测VSD患病组和正常对照组全血样本中的4个关键靶基因（TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2）的蛋白质表达水平。与正常对照组比较，VSD患病组中的靶基因蛋白质表达水平都显著降低（图4）。
图4 VSD组与正常对照组的4个关键靶基因蛋白质表达水平
Fig. 4 Protein expression level of four key target genes in the VSD and normal group
注：*表示与正常组相比，P值＜0.05；**表示与正常组相比，P值＜0.01。Note: * represents p value is less than 0.05 compare with normal group; ** represents p value is less than 0.01 compare with normal group。
2.6 差异表达的miRNAs与TGF-β/SMADs通路中关键靶基因间的关系
根据靶基因预测结果：显著上调表达的hsa-miR-409-3p与hsa-miR-487a-5p共同调控TGF-β/SMADs通路中的4个关键靶基因TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2（图5）。
图5 hsa-miR-409-3p、hsa-miR-487a-5p与TGF-β/SMADs通路中4个靶基因之间的关系图
Fig. 5 Relationship between hsa-miR-409-3p、hsa-miR-487a-5p and 4 target genes in TGF-β/SMADs pathway
3 讨论
在本研究中，利用miRNAs表达谱芯片检测VSD患病组与正常对照组全血样本，得到22个显著差异表达的miRNAs。再经过三个靶基因预测软件预测得到10677个靶基因，KEGG数据库与Reactome生物化学反应数据库搜索分析得到靶基因所参与的150条信号通路，进一步分析发现TGF-β/SMADs通路与中胚层及心脏发育、心室肌细胞的分化密切相关。qRT-PCR与Western blot检测参与TGF-β/SMADs通路的4个关键靶基因TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2，结果显示这4个关键靶基因的mRNA转录水平与蛋白质表达水平均明显降低。
TGF-β/SMADs通路可以调控早期胚胎中胚层发育与心室间隔形成的相关基因的转录翻译，进而控制相关细胞的增殖、凋亡与分化。其还能与Nodal/NOTCH信号通路相互作用，共同调控心肌细胞的发育与分化[12,13]。心脏特异性TGF-β/SMADs信号通路的正常生理过程为：主要表达在心室细胞及心室细胞间质中的TGF-β配体与细胞表面II型受体结合（TGFBR2）。活化的转化因子II型受体，进而结合转化因子I型受体（TGFBR1）形成II型受体-配体-I型受体的异源三聚体[14,15]。SMADs家族蛋白可与异源三聚体中的I型受体直接作用并被磷酸化，磷酸化后的SMAD2蛋白与胞浆内的SMAD3结合后形成复合物[16]。将信号转移至细胞核后与其靶基因启动子或是转录因子FOXA2/HAND1结合，从而调控靶基因转录翻译蛋白的生成，调控心室肌细胞的增殖与分化[17-19]。近年的研究表明，TGF-β/SMADs信号通路的异常与心血管疾病如心房纤颤、动脉粥样硬化的发生关系密切[20]。机体中的TGF-β配体的浓度以及其与I、II型受体的结合程度，TGF-β/SMADs信号通路下游的靶基因或转录因子的表达量的改变，都会导致心室肌细胞增殖与分化的异常[21]。
根据qRT-PCR与Western blot检测结果，与正常对照组相比，VSD组中的关键靶基因TGFBR1、TGFBR2、HAND1、FOXA2的转录水平与蛋白质表达水平均明显降低。在TGF-β/SMADs信号中，异常低表达的转化因子I型受体TGFBR1与II型受体TGFBR2，大大减少了其与转化因子TGF-β配体的结合，同时也减少了异源三聚体的形成。而异源三聚体的减少使转化因子信号的转导受阻，极少信号被转至细胞核膜内。急剧减少的信号与异常下调的心室肌分化特异性转录因子FOXA2和HAND1结合，阻碍了其下游靶基因的转录翻译过程。最终，被异常抑制的整个TGF-β/SMADs信号通路，阻碍了心室肌细胞分化与增值，也阻碍了心室间隔的分化与形成。
故我们推测，在VSD病理状态下，异常上调表达量的hsa-miR-409-3p与hsa-miR-487a-5p会使抑制其靶基因TGFBR1、TGFBR2、HAND1和FOXA2的转录与蛋白质表达，从而异常抑制了整个TGF-β/SMADs信号通路，继而导致心肌细胞分化与增殖受阻、心室间隔分化的异常。这可能是导致VSD的一个原因。
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论文作者:蒋苑青，张林
论文发表刊物:《医师在线》2017年10月上第19期
论文发表时间:2017/12/22
标签：基因论文; 信号论文; 心室论文; 转录论文; 水平论文; 关键论文; 受体论文; 《医师在线》2017年10月上第19期论文;