（湖北医药学院附属太和医院儿童医疗中心 湖北十堰 442000)
【摘要】目的：探讨新生小鼠β受体相对于成熟小鼠表达水平的变化。方法：按照随机对照原则将36只新生3天小鼠分为6组，分别于3、5、7、14、21、28天取出心脏组织，通过免疫组化及蛋白印迹法检测小鼠心肌β1及β2受体表达水平及变化。结果：新生小鼠出生3天后β1受体出现表达逐渐增高的趋势，β2受体出现下调趋势。结论：未成熟心肌发育过程中，出现β1受体表达上调，β2受体表达下调的现象，正常小鼠β受体出现动态变化。
【关键词】 新生小鼠；未成熟心肌细胞；β肾上腺素受体
【中图分类号】R458+.3 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2017）06-0279-02
Study on Cardiac β-Adrenergic Receptor in Neonatal Mice
Li Changjian,Xi Shibing ,Li Tao .
(Department of Pediatrics, Affiliated Taihe Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan, Hubei Province, 442000 P.R.China)
【Abstract】Objective To investigate the expression of β receptor in neonatal mice compared with mature mice. Methods 36 neonatal mice were randomly divided into 6 groups according to the principle of randomized control. Heart tissue was removed at 3, 5, 7, 14, 21 and 28 days. Immunohistochemistry and Western blotting were used to detect the expression of β1 and β2-AR in the myocardium of mice. Results β1-AR expression was up-regulated after 3 days of birth, but β2-AR was expression down-regulated. Conclusions In the development of immature myocardium, the expression of β1-AR was up-regulated and the expression of β2-AR was down-regulated in normal mice.
【Key words】 Neonatal mice;Immature cardiomyocytes; Beta-adrenergic receptor
心肌细胞发育是从胚胎期开始由未成熟心肌细胞逐渐向成熟心肌细胞发育的循序渐进过程，出生后仍继续进行心肌增龄性变化。不同的动物、不同的生长环境，心肌细胞发育、成熟的时限不一致，早产儿、足月儿及婴幼儿心肌细胞称为未成熟心肌细胞[1]。未成熟心肌细胞β受体表型分布及功能均不同于成熟心肌细胞，主要表现为未成熟心肌细胞β2受体占主导地位（β1,36% vsβ2,64%），β2受体介导心肌收缩为主[2]，而在成熟心肌细胞中，以β1受体占主要（β1，59% vsβ2，41%），β1受体介导心肌收缩为主。在心肌细胞发育过程中，是否伴随着β受体表达变化，如何变化？本文拟通过检测检测不同鼠龄的小鼠β受体表达，为临床上儿科心脏发育及个体化临床治疗提供一定的理论依据。
1.材料与方法
1.1 材料及试剂
实验动物：清洁级出生3天ICR小鼠，体重2～4g（2.99±0.42），由湖北医药学院动物中心提供。
试剂：凝胶制备试剂盒、10-170kD电泳蛋白彩色预Marker（碧云天公司），兔抗小鼠β1、β2抗体（博奥森公司），Anti-GAPDH、二抗pv-6000山羊抗兔/小鼠聚合物（中杉金桥公司）。
1.2 动物模型分组及取材
在本次实验中，采用出生3d的ICR小鼠36只，雌雄不限。笼中由母鼠哺乳饲养。分别于小鼠生后3、5、7、14、21、28天随机数字法从中取6只，分布进行免疫组化及蛋白印迹法检测。
1.3 免疫组化检测小鼠心肌β受体表达
10%中性福尔马林固定心尖组织，经乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，石蜡切片（5μm）脱蜡至水。室温孵育，蒸馏水冲洗，PBS浸泡抗原修复，一抗4℃过夜，冲洗3次，孵育二抗60 min。再次冲洗后显色剂显色3～15分钟（DAB），自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片，显微镜拍照。
1.4 蛋白免疫印记法检测小鼠心肌β受体表达
Trizol中抽提蛋白（按其说明书操作），测定蛋白浓度（BCA法，碧云天），制胶、上样、电泳、转膜（4℃下，恒压100v，30～60min），根据蛋白质分子量大小调整转膜时间，封闭，孵育兔抗小鼠一抗（ADRB1、ADRB2；博奥森），孵育羊抗兔二抗，显影和定影。光密度测定：采用扫描仪扫描图像，用“image pro plus（IPP）v6.0”图像处理软件进行蛋白印迹条带的定量分析，测定目的条带的光密度值及GAPDH光密度值，以两者光密度比值代表目的蛋白的相对表达量，计算每例标本中目的蛋白与参照蛋白相对表达量的值。
1.5 统计分析
统计学处理计量资料均以均数±标准差（x-±s）表示，所有数据用SPSS 21.0软件进行统计学分析。两组数据间比较采用两独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素或双因素方差分析。多组间的两两比较采用费希尔的LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。使用GraphPad prism v5.01制作图表。
2.结果
图AB是β1受体3天、28天免疫组化结果，图CD是β2受体3、28天免疫组化结果，图E示Western blot定量提示各组均有蛋白表达，图F示β1受体出现OD值逐渐升高的趋势，而β2受体OD值逐渐降低，β1、β2受体3天和28天比较具有明显的统计学意义（P<0.05）。提示β受体表达存在继续发育和变化的过程,主要表现为β1受体表达逐渐上调，β2受体表达逐渐下调。
3.讨论
β肾上腺髓质系统在调节心脏发育和维持心脏结构功能的稳定方面具有重要作用。未成熟心肌细胞β受体表型分布及功能均不同于成熟心肌细胞，主要表现为未成熟心肌细胞β2受体占主导地位，β2受体介导心肌收缩为主[2]，而在成熟心肌细胞中，以β1受体占主要，β1受体介导心肌收缩为主。而心肌细胞是逐渐发育成熟的，在心肌细胞发育成熟过程中，β1、β2受体表达是否存在动态变化的过程？
本次实验中，首先选取了新生3天的小鼠，分别在第3、5、7、14、21、28天随机从三组中各取6只进行β受体免疫组化及western蛋白印迹法检测。结果提示出生3天到28天，小鼠β受体存在动态变化的过程。主要表现为β2受体表达逐渐下调，β1受体表达逐渐上调。说明在未成熟心肌细胞发育的过程中，伴随着β受体表型的动态变化。未成熟心肌细胞表达β2受体为主，随着心脏发育和成熟，β2受体表达逐渐下调，β1受体表达逐渐上调，直到表达为成熟表型，以β1受体为主。而且成熟心肌细胞也存在着继续变化的过程，有学者发现，老年人β2受体进一步下调[5]。未成熟心肌细胞，成熟心肌细胞甚至衰老心肌细胞中β受体表型均在不断变化，不同年龄的心肌细胞β1、β2受体表达均不相同。
未成熟心肌细胞发育过程中，β受体存在动态变化的过程，主要表现为未成熟心肌细胞表达β2受体为主，随着心脏发育和成熟，β2受体表达逐渐下调，β1受体表达逐渐上调，直到表达为成熟表型，以β1受体为主。这一点提示我们不同年龄的心脏β受体的表达具有特异性，在进行基础研究及临床治疗均应该注意个体化和差异化。但本次试验仅仅揭示了上述现象，β受体表达变化的具体机制有待进一步研究。
【参考文献】
[1]吴益平，陈道中.未成熟心肌的特点及未成熟心肌保护的研究进展[J].湖南医学，Vol.20 Nov.6 June9 2009.
[2] Leon P.Collis,Shekhar Srivastava,William A.et al.β2-Adrenergic receptor agonists stimulate L-type calcium current independent of PKA in newborn rabbit ventricular myocytes[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007;293:2826-2835.
[3] Bristow MR,Anderson FL,Port JD,et al.Differences in β-adrenergic neuroeffector mechanisms in ischemic versus idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Circulation,1991; 84:1024-1039.
[4] XU Shu-zhen,WANG Cai-xia,ZHAO Wei,et al.Influence of Matrix Met-alloproteinase on myocardial Remodeling in Neonatal rats after Asphyxia[J].Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2006,21(18):1214-1216.
[5] Mohsin Khan,Sadia Mohsin, Daniele Avitabile,et al. β-Adrenergic Regulation of Cardiac Progenitor Cell Death Versus Survival and Proliferation[J].Circ Res. 2013;112:476-486.
基金项目：湖北省卫生计生科研基金资助面上项目（WJ2017M219）
论文作者:李昌健,席世兵,李涛
论文发表刊物:《心理医生》2017年6期
论文发表时间:2017/5/27
标签：受体论文; 心肌论文; 小鼠论文; 细胞论文; 未成熟论文; 蛋白论文; 成熟论文; 《心理医生》2017年6期论文;