徐海圣[1]2003年在《中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究》文中研究表明对患弧菌病的中华绒螯蟹进行了细菌性病原的分离和鉴定，从病蟹体内分离到叁株病原菌，其生理生化特性、菌株形态及菌落形态均一致，经鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)。人工注射感染健康蟹，2d内均发生死亡，死亡率100％，并且症状同自然发病症状相似，证实副溶血弧菌为中华绒螯蟹弧菌病的病原菌。药物敏感试验结果表明，此病原菌对链霉素、利福平、卡那霉素、复方新诺明、环丙沙星、氟哌酸、四环素、氟嗪酸、复达欣、菌必治、萘啶酸等药物高度敏感。分离菌株培养物经离心、(NH_4)_2SO_4沉淀、透析、浓缩及过滤除菌获得的ECP蛋白具有明胶酶、几丁质酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂酶、磷脂酶等多种酶活性及溶血活性，但不具有脲酶活性，对中华绒螯蟹具有明显的致病作用。利用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法，从其胞外产物中分离纯化出了2种胞外蛋白酶，用SDS-PAGE电泳测得两种蛋白酶的分子量分别为39.6kD和20kD。39.6kD蛋白酶活性在50℃～60℃范围内热稳定性最好，最适pH为9，而20kD蛋白酶的最适温度为50℃，最适pH为8。EDTA可抑制39.6kD蛋白酶的酶活性，金属离子Cu~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)对39.6kD蛋白酶有一定的抑制作用，而Ca~(2+)对酶有一定程度的激活作用，因此39.6kD蛋白酶是一种金属蛋白酶；PMSF可抑制20kD蛋白酶的酶活性，说明该酶属于丝氨酸蛋白酶类。这两种纯化的蛋白酶对体外培养Vero细胞及中华绒螯蟹肝胰腺细胞均具毒性作用。以实验中分离到的蟹源致病性的副溶血弧菌基因组DNA为模板，利用设计的特异引物，扩增出一条长约2kb的PCR产物，证明在其基因组DNA中含有相关胞外蛋白酶基因。 对患气单胞菌病(含腹水病)的中华绒螯蟹进行了细菌性病原的分离和鉴定，从病蟹体内分离到叁株病原菌，均为革兰氏阴性杆菌，单极生鞭毛，运动，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸产气等，经鉴定这叁株病原菌均属气单胞菌；再经其它生物学特性测定，两株与易损气单胞菌的形态特征、生理生化特性基本相同，故将这两株病原菌鉴定为易损气单胞菌(Aeromonas trota)；另外一株与嗜水气单胞菌的形态特征、生理生化特性基本相同，故将此株病原菌鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。蟹源致病性的易损气单胞菌和嗜水气单胞菌均可产生外膜蛋白、胞外蛋白酶、溶血素等致病因子。 根据气单胞菌已发表的气溶素基因序列设计引物，采用PCR技术，从蟹源致病性易损气单胞基因组中克隆出长为622bp的基因片断，内切酶BamHI对扩增产物进行酶切，产生长约570bp和50bp两条片断。研究还利用设计的特异引物，采用PCR技术，对蟹源致病性易损气单胞菌进行了快速分子鉴定的研究。 中华绒鳌蟹“抖抖病”是一种危害严重、流行面广的蟹病，为防治该病我们对病蟹进行了病原初步研究。研究发现，病蟹体内存在着大量的病原菌，能在3天内使健康蟹全部死亡，死亡率为100%，该细菌属革兰氏阴性杆菌，单极生鞭毛，运动，兼性厌氧，发酵葡萄糖产酸不产气，氧化酶、七叶普、过氧化氢酶阳性，能还原稍酸盐等，其形态特征及生理生化反应同豚鼠气单胞菌基本相同，故鉴定为豚鼠气单胞菌。我们用病蟹无菌组织滤液感染健康蟹，出现“抖抖病”的典型症状，并在患病中华绒蟹蟹的组织细胞超微结构中发现有病毒拉子，而且在病蟹无菌组织滤液中也发现了大量的球状病毒粒子，大小为60nm左右。因此，中华绒鳌蟹的暴发性死亡是由球状病毒和豚鼠气单胞菌等致病细菌共同感染而引起的 运用硫酸按盐析、GlcNAc一sePharose 6B亲合层析等方法从中华绒鳌蟹的血清中分离出一种天然的凝集素，经SDS一PAGE测得其分子量约为82kD，由单一亚基组成，由等电聚焦凝胶电泳测得其等电点(PI)为5.4。糖凝集抑制试验中检测到葡萄糖、半乳糖、甘露糖、乳糖、果糖、蔗糖等6种单糖对中华绒登蟹血清凝集素均没有抑制作用，但N一乙酞氛基糖GlcNAc、GalNAc、ManNAc等能抑制其凝集活性。热变性实验结果表明，当温度在10~50℃范围内时，凝集素仍保持强的凝集活性，但当温度升至60℃后，凝集活性迅速下降，至80℃失去凝集活性，在pH4.O一8.0的各缓冲液中保持较强的凝集活性，而在此pH值范围之外，凝集活性均有不同程度的下降。中华绒鳌蟹血清凝集素除可使外源红血细胞发生凝集外，还具有凝集细菌或杭菌作用。 为了防治中华绒鳌蟹的传染性疾病，使用各种杭菌剂仍被作为目前的主要对策，但是由于耐药性病原菌的形成以及环境污染问题等方面的考虑，正确使用疫苗或免疫增强剂来提高中华绒蟹蟹自身的杭病能力，是以后预防蟹病发生的途径。尽管甲壳动物的血淋巴液内不存在免疫球蛋白，但是具有非特异性免疫的性质，适当的诱导可提高血细胞的吞噬能力及多种体液免疫因子的数量和活性。研究发现，肌肉注射嗜水气单胞菌疫苗后一定时间内，中华绒鳌蟹血清溶菌酶、超氧化物酶歧化酶(S OD)、酚氧化酶(PO)活力均有所升高，免疫保护率为74.7%，证明肌肉注射嗜水气单胞菌疫苗的确能够增强中华绒餐蟹的免疫杭病能力。
刘雪兰, 余为一, 李槿年[2]2006年在《中华绒螯蟹血清凝集素的生物学特性》文中研究指明将中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血清凝集素与动物(鳖、鲫鱼、鸡、鸽、兔、鼠、人A、B、O型)红细胞和细菌(八迭球菌、嗜水气单胞菌、短小芽孢杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、假单胞菌和拟态弧菌)进行凝集反应。结果表明,中华绒螯蟹血清凝集素有明显的选择性,与小白鼠红细胞和八迭球菌的凝集活性最高(P<0.01)。血清凝集价在蟹个体之间变化范围较大,性别之间无显着差异(P>0.05)。10 mmol/L的CaCl2和300 mmol/L的NaCl不影响凝集素与小鼠红细胞和细菌的凝集活性,600 mmol/L的NaCl可降低其活性。pH 5~9不影响蟹凝集素活性,但400 mmol/L的EDTA在pH 7.0可部分抑制其活性,100 mmol/L的EDTA在pH 5.0则可完全抑制其活性。在细菌刺激下,中华绒螯蟹血清凝集素活性在2 d达到峰值,随后逐步缓慢下降。接种细菌(八迭球菌)的数量(3.0×109~9.0×109)显着影响血清凝集素的产生(P<0.05),而环境水温度(18~30℃)和蟹体质量(35~80 g)的影响则不显着(P>0.05)。
李义[3]2007年在《中华绒螯蟹新型免疫调节剂及其酚氧化酶的纯化和性质研究》文中研究表明本文综述了甲壳动物免疫防御机制研究的现状及最新进展,首次比较系统地研究了左旋咪唑、米糠多糖、山药多糖及CpG寡脱氧核苷酸(ODN-2006)对中华绒螯蟹(Eriociteir sinensis)免疫功能和抗病力的影响;探讨了ODN-2006触发中华绒螯蟹血细胞酚氧化酶原激活系统的信号转导机制;从中华绒螯蟹血细胞破碎物上清液中分离纯化到了酚氧化酶并对其生物化学性质进行了研究。现将研究结果总结如下:(1)左旋咪唑对中华绒螯蟹免疫功能及抗病力的影响为研究饲料添加左旋咪唑(levamisole,LMS)对中华绒螯蟹的免疫调节作用,以0(对照)、100、200和300mg·kg~(-1)干饲料的剂量将LMS添加于基础饲料中,制成颗粒饲料投喂中华绒螯蟹7 d,然后投喂不含LMS的对照组饲料。在投喂含LMS的饲料之前(0周)和投喂后2、4、6、8周,采样测定中华绒螯蟹的血细胞总数(THC)、不同血细胞数量(DHC)、吞噬活性、呼吸爆发(超氧阴离子的释放)、酚氧化酶(PO)活性和溶菌酶(LSZ)活性;并在投喂含LMS的饲料后的第4周,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CL99920菌株,记录接种10d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,各LMS处理组的THC、透明细胞(HC)数量、吞噬百分率(PP)、呼吸爆发、PO活性和LSZ活性均显着地高于对照组(P＜0.05);颗粒细胞(GC)数量、血细胞吞噬指数(PI)与对照组无显着差异(P＞0.05);LMS处理的中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。由此表明,饲喂适量的LMS可增强中华绒螯蟹的免疫力和抗病力;在试验条件下,200 mg·kg~(-1)干饲料的剂量为最适添加剂量;LMS可作为中华绒螯蟹的新型免疫调节剂在疾病预防中使用。(2)两种植物多糖对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用为研究饲料添加米糠多糖(Rice bran polysaccharide,RBP)和山药多糖(Chinese yam polysaccharide,CYP)这两种高等植物多糖对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用,将RBP、CYP按0(对照)、1.0、2.0和4.0 g·kg~(-1)干饲料的剂量添加于基础饲料中投喂中华绒螯蟹,采取间隔投喂的策略,即每投喂7天试验饲料后再投喂7天对照饲料,整个试验持续6周。在试验开始后1、2、4、6周采样,对中华绒螯蟹的一系列免疫学参数进行测定,并在试验开始后2周,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株,记录接种7 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,饲料添加2.0～4.0 g·kg~(-1)的RBP、1.0～2.0 g·kg~(-1)的CYP能显着地提高中华绒螯蟹的THC和HC数量(P＜0.05),显着地增强血细胞的吞噬活性和HIS的PO活性(P＜0.05),显着地提高血清POD、SOD、ACP、ALP活性及抗菌活性(P＜0.05),并能明显地增强中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的抵抗力,但对血清LSZ活性的影响没有规律性。上述结果表明,饲喂2.0～4.0 g·kg~(-1)的RBP或1.0～2.0 g·kg~(-1)的CYP能显着地增强中华绒螯蟹的免疫功能和抗病力;两种植物多糖可作为中华绒螯蟹的新型免疫调节剂在养殖生产中试用。(3) CpG寡脱氧核苷酸对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用将ODN-2006(含3个CpG基序)、ODN-R(含1个反向CpG基序)按0(对照)、1、5和25μg·kg~(-1)体重的剂量体腔注射中华绒螯蟹(0.1 mL·只~(-1)),同时设注射等体积的0.85%生理盐水的对照组,研究了两种ODN对中华绒螯蟹免疫功能的调节作用。在注射ODNs或生理盐水之前(0 d)和注射后第1、3、5、8 d采样,对中华绒螯蟹的一系列免疫学参数进行测定,并在注射ODNs后第3 d,按1.2×10~7 cfu·kg~(-1)体重的剂量,体腔注射接种中华绒螯蟹致病性嗜水气单胞菌CL99920菌株,记录接种7 d后中华绒螯蟹的累积死亡率。结果显示,25μg·kg~(-1)ODN-2006能显着地提高中华绒螯蟹的THC、吞噬活性和呼吸爆发活性(P＜0.05),显着地增强血清PO、SOD、ACP、ALP、溶血素及抗菌活性(P＜0.05),但对中华绒螯蟹的DHC、血清POD及LSZ活性没有显着影响(P＞0.05)。此外,25μg·kg~(-1)ODN-2006能明显地增强中华绒螯蟹对致病性嗜水气单胞菌的抵抗力。与此相对,25μg·kg~(-1)ODN-R除对血清PO活性具有显着的增强作用外(P＜0.05),对其他免疫学参数没有明显的影响(P＞0.05)。上述结果表明,ODN-2006能显着地增强中华绒螯蟹的免疫功能和抵抗力,是中华绒螯蟹潜在的新型免疫调节剂,可进一步加以研发和利用。(4) CpG寡脱氧核苷酸触发中华绒螯蟹proPO激活系统的信号转导途径以0、5、10、15、20和25μg·mL~(-1)浓度的ODN-2006体外处理中华绒螯蟹血细胞30min,研究了ODN-2006对中华绒螯蟹PO活性的影响。结果显示,10μg·mL~(-1)以上浓度的ODN-2006能显着地增强血细胞胞内外受ODN刺激的PO(PO_S)活性及胞外总PO(PO_T)活性(P＜0.05),但胞内PO_T活性有所下降;ODN-2006诱导的胞内外PO活性的上升或下降均显示出剂量依赖性。由此表明,在试验条件下,ODN-2006能刺激中华绒螯蟹血细胞脱颗粒,但不能刺激血细胞合成新的proPO。进一步以10μg·mL~(-1)ODN-2006和一定浓度的特异性信号激活剂或抑制剂分别单独或联合体外处理中华绒螯蟹血细胞30 min,通过检测血细胞胞内外PO活性的增减情况,对ODN-2006触发proPO激活系统的信号转导途径进行了探讨。结果显示,用氟化钠(G蛋白激活剂)处理血细胞,胞内外PO_T活性均增加;用8-Br-cAMP(PKA激活剂)或咖啡因(磷酸二酯酶抑制剂)或白屈菜赤碱(PKC抑制剂)处理血细胞,胞内PO_T活性增加,胞外PO_T活性下降;用佛波酯(PMA,PKC激活剂)处理血细胞,胞外PO_T活性增加,胞内PO_T活性下降;用叁羟基异黄酮(酪氨酸蛋白激酶抑制剂)处理血细胞,胞内外PO_S活性及胞外PO_T活性均上升,胞内PO_T活性下降。当用白屈菜赤碱和ODN-2006或PMA共同处理血细胞时,白屈菜赤碱对ODN或PMA诱导增强的胞内外PO_S活性及胞外PO_T活性具有较强的抑制作用。此外,试验发现氟化钠、PMA及叁羟基异黄酮与ODN-2006对血细胞脱颗粒具有协同刺激作用,ODN-2006可部分地解除被8-Br-cAMP、咖啡因或白屈菜赤碱对血细胞脱颗粒的抑制作用。上述结果表明,ODN-2006可能经由G-蛋白介导的PKC途径活化中华绒螯蟹血细胞proPO系统,并通过酪氨酸蛋白激酶途径进行负调控。(5)中华绒螯蟹酚氧化酶的分离纯化及其生物化学性质以中华绒螯蟹的HLS为材料,利用凝胶过滤和离子交换层析等方法,对中华绒螯蟹的酚氧化酶(PO)进行了分离纯化和生物化学性质研究。试验发现,中华绒螯蟹酚氧化酶原(proPO)的相对分子质量约为76.4 kDa,在试验操作过程中极易发生降解或自身降解,变成有活性的大小约70.1 kDa的PO。以L-二羟苯丙氨酸(L-DOPA)为特异性底物对PO活性进行研究发现,中华绒螯蟹PO的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,对L-DOPA和邻苯二酚的K_m值分别约为2.63 mmol·L~(-1)和6.25 mmol·L~(-1)。中华绒螯蟹PO对苯硫脲极为敏感,对硫脲、半胱氨酸、抗坏血酸及苯甲酸也很敏感。根据中华绒螯蟹PO对抑制剂的敏感性和对底物的亲和力,将其鉴定为邻二酚氧化酶(o-diphenoloxidase)。中华绒螯蟹PO对胰蛋白酶抑制剂SBTI较为敏感,但几乎不受另一种胰蛋白酶抑制剂TLCK的影响,推测该酶在蛋白酶性质上与胰蛋白酶存在着一定的相似性。此外,中华绒螯蟹PO的活性可被二乙基二硫代氨基甲酸钠(DETC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、Cu~(2+)、Zn~(2+)及Ca~(2+)强烈抑制,Cu~(2+)能有效地恢复被DETC或EDTA抑制的PO活性,表明该酶很可能是一种Cu-金属酶(Cu-metalloenzyme)。
刘雪兰[4]2002年在《中华绒螯蟹血清凝集素生物学特性的研究》文中提出为了研究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis，俗名河蟹)的免疫机制，探索提高其防御能力，提供在生产实践中有效地防治河蟹疾病的科学依据，本研究用微量凝集试验、正交试验设计、(SDS-)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫酶斑点技术等方法研究了河蟹血清凝集素的生物学特性。 微量凝集反应的结果表明，河蟹血清凝集素与部分动物红细胞(鼠、鸡、兔、鸽、人A、B、O型)和某些细菌(嗜水气单胞菌J-1株、八迭球菌)能发生不同程度的凝集作用，并且与鼠红细胞和与八迭球菌的凝集效价明显高于与其他动物的红细胞或细菌的凝集效价(P＜0.01)；与鲫鱼、鳖的红细胞以及大肠杆菌、短小杆菌、金黄色葡萄球菌、拟态弧菌H-7株、假单胞菌1.2株等细菌不发生凝集。来源于不同河蟹个体的血清凝集素对同种动物红细胞或细菌的凝集效价表现出较大的变化范围；不同性别河蟹的血清凝集素具有相同的凝集谱并且在凝集活性方面没有显着差异(P＞0.05)。 在与鼠红细胞的凝集反应中，河蟹血清凝集活性不受0.01mol／L CaCl_2和0.3mol／L NaCl的影响，但是可被0.6mol／L NaCl降低；在0.1～0.4mol／LEDTA(pH5.0)条件下，其血凝活性被完全抑制。 本研究还设计了河蟹体重、水温、细菌浓度等叁因素叁水平的正交试验，研究叁种因素对河蟹血清凝集素产生的影响作用。结果表明，水温和体重不是重要的影响因素(P＞0.05)；注射不同浓度的细菌能够显着影响凝集素的产生(P＜0.05)，在注射细菌1～2天后凝集价可达到峰值，随后下降，在12～14天接近对照水平。此外，用细菌3次注射河蟹(间隔5～7天／次)可以刺激血清凝集素的凝集价的升高，但是增长效果不明显(P＞0.05)。 首次用鼠红细胞膜作为介质吸附河蟹血清中的凝集活性分子，经解脱、复性，提取了凝集分子，建立了以鼠红细胞膜吸附、提取凝集素的方法。提取的凝集素经过SDS-PAGE可获得3条蛋白带，其分子量分别为120 100、117 300、114 600。 用吸附提取的凝集素免疫小鼠，分离鼠抗血清，以凝集素的血凝抑制试验和免疫酶斑点法通过检测该血清中抗凝集素的抗体效价，检验凝集素的免疫原性，结果表明，河蟹血清凝集素具有较好的免疫原性。
曹广力, 朱越雄, 薛仁宇, 贡成良[5]1999年在《中华绒螯蟹血清中外源凝集素的凝集作用及影响因素》文中指出中华绒螯蟹血清中的凝集素可凝集人、兔、豚鼠、小白鼠、鹌鹑、鸡、蟾蜍、鳝鱼等动物血细胞，但不凝集鲫鱼血细胞；此外，该凝集素亦可凝集双球菌、蕈状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌等细菌。该凝集素凝集活性可被L-山梨糖、D-果糖、D-半乳糖轻微抑制，并表现出对pH和温度的广泛适应性，在pH为2－12，温度为8℃－64℃范围内均具凝集活性。中华绒螯蟹血清中的凝集素对上述几种动物血细胞的凝集效价高于罗氏沼虾和克螯虾。
王晶晶[6]2013年在《中华绒螯蟹免疫致敏现象及相关分子机制的初步研究》文中研究说明免疫致敏在无脊椎动物抵御外界病原重复感染中发挥着重要的作用，也为无脊椎动物的病害防治提供了一定的参考。目前在很多种无脊椎动物中都发现了免疫致敏现象，但免疫致敏相关的机制研究却十分有限。本研究采用免疫学方法检测了细菌重复刺激前后中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)死亡率及细胞和体液免疫指标的变化；采用RACE、RT-PCR和原核重组表达等分子生物学技术对中华绒螯蟹Dscam (Down syndrome cell adhesion molecule)、Peroxinectin和Masquerade叁种黏附分子进行了克隆表达及功能研究，并初步探讨了其在免疫致敏过程中的可能作用。经过灭活的嗜水气单胞菌免疫的中华绒螯蟹在免疫后7d再次接受活的嗜水气单胞菌刺激时的存活率显着高于未免疫组、藤黄微球菌免疫组和生理盐水对照组。灭活嗜水气单胞菌免疫组中华绒螯蟹的血细胞吞噬作用显着高于藤黄微球菌免疫组，且相比嗜水气单胞菌初次免疫时显着升高并能维持较长时间，吞噬指数也显着增加。经嗜水气单胞菌免疫的血清对同种菌的抗菌能力要强于对不同种菌的抗菌力，具有一定程度的特异性，而藤黄微球菌免疫组的血清对嗜水气单胞菌无明显的抗菌能力。嗜水气单胞菌免疫后的血清PO活性升高的趋势较藤黄微球菌组明显，而溶菌酶活性在两次处理前后并无明显差异。中华绒螯蟹Dscam基因和Masquerade基因的cDNA全长分别为5125bp和1525bp。Dscam基因的编码蛋白包含10个Ig功能域和6个FN3结构域，在Ig2，Ig3和Ig7区域检测到多种可变剪接体。Masquerade基因的编码蛋白含有trypsin-like丝氨酸蛋白酶功能区。Dscam基因、Peroxinectin基因和Masquerade基因在各组织中均呈组成型表达，分别在心脏、血细胞和肝胰脏、血细胞中表达量最高。Dscam蛋白和Peroxinectin蛋白主要定位于血清及细胞膜上。检测叁个基因的mRNA在中华绒螯蟹接受不同菌刺激后的表达水平发现，Dscam基因和Peroxinectin基因对酵母菌刺激的反应较强烈，而Masquerade基因对鳗弧菌的刺激有明显的响应。在遭受嗜水气单胞菌第二次刺激后，Dscam基因mRNA的表达水平与初次免疫时相比显着升高；而Peroxinectin和Masquerade基因表达量均在嗜水气单胞菌初次免疫后升高，再次刺激后前者显着下降后者则无显着变化。截取保守区域共2.57kb进行体外原核重组表达，发现体外重组Dscam蛋白具有促包囊化作用。Peroxinectin和Masquerade重组蛋白均具有促吞噬、促包囊化活性，Masquerade重组蛋白还具有抗大肠杆菌活性。综上所述，中华绒螯蟹在接受相同菌重复刺激时免疫功能增强，且这种增强的免疫保护作用具有一定的特异性，说明中华绒螯蟹中存在免疫致敏现象。黏附分子Dscam，Peroxinectin和Masquerade均参与了中华绒螯蟹对病原的免疫防御反应，并可能以不同的方式参与中华绒螯蟹的免疫致敏。该结果丰富和发展了无脊椎动物免疫致敏现象的研究，并为进一步揭示免疫致敏的分子机制奠定了基础。
祝倩倩[7]2017年在《中华绒螯蟹和南极磷虾组织蛋白酶家族的酶学性质研究》文中认为中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)和南极磷虾(Euphausia superba)是具有重要经济价值的甲壳动物。甲壳动物体液内无免疫球蛋白,也缺乏抗体介导的免疫反应,但是甲壳类动物具有先天性免疫防御系统,可预防病原微生物的侵袭。组织蛋白酶是一类溶酶体蛋白酶,主要分为丝氨酸类组织蛋白酶(如组织蛋白酶A,CatA)、半胱氨酸类组织蛋白酶(如组织蛋白酶B,CatB;组织蛋白酶H CatH;组织蛋白酶L,CatL)、天冬氨酸类组织蛋白酶(组织蛋白酶D,Cat D),参与蛋白质水解、先天免疫防御反应、抗原递呈、细胞凋亡等生理活动。本研究通过设置了一系列的影响中华绒螯蟹组织蛋白酶进行酶促反应的因素(浸提时间、pH、温度、金属离子以及激活剂与抑制剂),来探究各组织蛋白酶的酶学性质。(1)中华绒螯蟹肝胰腺组织浸提时间达到120 min时,Cat A和CatD的酶活达到最高,Cat B、CatH、CatL各自的最佳浸提时间分别为30 min、60 min、90 min。(2)CatA、CatB、CatL、CatD反应的最适pH都为5,CatH的最适反应pH为7,说明组织蛋白酶主要为酸性蛋白酶。(3)CatA和CatB最适反应温度为45℃,CatH和CatD的最适反应温度55℃,CatL最适反应温度为65℃,说明CatL耐高温。(4)Mg2+对CatA无明显作用,对CatB激活作用,对Cat H、CatL和CatD有抑制。而Ca2+、Mn2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+对CatA、CatB、CatH、CatL和CatD均有不同程度的抑制作用。(5)DTT对CatA和CatD的活性具有一定的抑制作用,对CatB、Cat H和CatL有一定的激活作用。EDTA、E-64和亮抑蛋白酶肽则抑制CatA、CatB、CatH、CatL和Cat D活性,其中E-64和亮抑蛋白酶肽对半胱氨酸蛋白酶(CatB、CatH、CatL)的抑制作用较显着。(6)中华绒螯蟹在注射Escherichia coli、Staphylococcus aureus和Saccharomyces cerevisiae12 h后,CatB、CatH、CatL和CatD的活性都显着提高,CatA的活性显着减低,说明Cat A、CatB、CatH、Cat L和Cat D参与自身免疫防御反应。南极磷虾(E.superba)自身内源性组织蛋白酶可以高效降解蛋白质,严重影响南极磷虾(E.superba)的贮藏、运输与保鲜。研究南极磷虾组织蛋白酶的一些基本性质,旨在为南极磷虾的贮藏、运输与保鲜以及组织蛋白酶的应用提供理论指导。因此通过研究南极磷虾不同自溶条件(自溶时间、自溶pH、自溶温度、金属离子以及激活剂与抑制剂)的变化来探究CatB、CatH、Cat L、Cat D的酶活变化,从而达到控制自身蛋白降解的目的。(1)南极磷虾在自溶30 min时,Cat B和CatD的剩余酶活较高;自溶60 min时,Cat H和CatL的剩余酶活较高。(2)南极磷虾自溶缓冲液pH为5时,CatB剩余酶活最高;自溶缓冲液pH为6时,CatH剩余酶活最高;自溶缓冲液pH为4时,CatL剩余酶活最高;自溶缓冲液pH为8时,CatD剩余酶活最高。CatB、CatH、CatL、CatD在各自最适自溶缓冲液pH时,均具有较高显着性。(3)南极磷虾在不同温度(-20℃,0℃,20℃,40℃,60℃)下自溶,自溶温度为0℃时,Cat B和CatL的剩余酶活最高;自溶温度为20℃时,CatD的剩余酶活最高;自溶温度为40℃时,CatL的剩余酶活最高。(4)在南极磷虾自溶缓冲液中加入浓度为5 mmol/L的Mg2+,Cat B、CatH和CatL被激活,Ca2+、Mn2+、Pb2+、Cu2+、Zn2+(浓度均为5 mmol/L)对其有抑制作用,且Mg2+相较于其他金属离子显着性差异较大。Mg2+和Zn2+对CatD无显着性作用,Ca2+、Mn2+、Pb2+和Cu2+对Cat D具有抑制作用,Cu2+的抑制作用较为显着。(5)在南极磷虾自溶缓冲液中加入2 mmol/L的DTT和L-Cys可激活CatB、Cat H、Cat L和CatD的活性,EDTA(2 mmol/L)、E-64(0.1 mmol/L)和亮抑蛋白酶肽(0.1 mmol/L)则使CatB、CatH、CatL和CatD的活性受到抑制,E-64和亮抑蛋白酶肽对半胱氨酸蛋白酶(CatB、CatH和Cat L)的抑制较为显着。
李根亮[8]2008年在《中华绒螯蟹精子顶体反应影响因素及相关蛋白的研究》文中研究说明顶体反应(Acrosome reaction, AR)是受精作用的重要过程,影响AR的因素也将在精卵顺利完成受精作用的过程中起直接作用；AR前和AR过程中的精子膜蛋白(Spermic membrane proteins, SMPs)及顶体反应释放蛋白(Proteins released during AR, PRAs)(包括蛋白水解酶)在维持精子形态结构、新陈代谢和生殖功能中发挥着重要作用,尤其与精卵识别、结合和融合等受精活动密切相关。本文以成熟雄性中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为实验材料,提取、分离了AR前SMPs (Spermic membrane proteins before AR, SBAs)和AR第叁阶段SMPs (Spermic membrane proteins during phase third of AR, SDAs)及PRAs (包括蛋白水解酶),并通过电泳比较分析其异同,从而推测它们对AR的影响；制备了这叁类精子蛋白的抗血清；通过统计分析和光镜观察等手段研究了水化作用、精子悬液密度、胰酶、Ca2+、温度、贮存液成分、冷冻贮存时间等多种理化因素及以上叁类精子蛋白的抗血清对精子AR的影响；并在此基础上总结了叁种简易高效诱导AR的新方法,即冷冻法、胰酶-Ca2+法和抗血清法。首先,通过分级分离的方法,从中华绒螯蟹的精荚中分离到游离精子。然后分别研究了水化作用、精子悬液密度、胰酶、Ca2+、温度、低温贮存对精子AR的影响。结果显示,AR前精子存在从未发生水化作用到发生水化作用的阶段性过程；高密度精子悬液下所得精子全部发生AR但处于反应的第二阶段,无Ca2+人工海水(Calcium-free artificial sea water, Ca2+-FASW)中的低密度精子未发生反应,而人工海水(Artificial sea water, ASW)中的低密度精子有一些发生了反应,说明精子悬液密度明显影响AR；胰酶加Ca2+和低温可高效诱导精子发生AR且低温诱导不需要Ca2+, AR时间只与贮存时间有关。第二,用冷冻法诱导精子发生AR,分离提取了PRAs包括蛋白水解酶；经反复冻融和离心法制备了SBAs和SDAs。并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native polyacrylamide gel electrophoresis, Native-PAGE)比较了AR释放的蛋白水解酶、AR前和AR过程中的精子内蛋白水解酶的异同。结果显示,AR前和AR过程中的精子蛋白及PRAs中先后出现12种活性蛋白水解酶,有些是AR前已具有的并一直保持着较高的活性或逐渐减少乃至消失,有些水解酶活性是AR过程中产生的并持续到反应结束或逐渐提高,尤其在PRAs中达到最高。又通过SDS(十二烷基磺酸钠)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和Naive-PAGE比较了以上各种蛋白的电泳图谱,结果显示,SMPs在AR前后有一些变化,且PRAs中也有SMPs组分。第叁,利用提取分离的SBAs和SDAs及PRAs免疫小鼠,制备抗血清。然后又利用双向扩散对抗血清的效价和特异性进行了检测。结果显示,SBAs和SDAs及PRAs的抗血清的效价分别为1：8、1：8和1：32,且都能与精巢、输精管和贮精囊等组织粗提液形成沉淀线,叁类蛋白都存在于以上叁种组织中,而不存在于雄性中华绒螯蟹的血清中。用这叁类抗血清分别与精子共孵,发现SBAs抗血清能高效诱导精子发生AR并达到反应的第4阶段,且反应精子外形轮廓清晰,证明该法既可以作为AR的高效诱导方法,又可以作为观察AR精子形态的有效手段。从以上实验可以看出,AR前中华绒螯蟹精子存在水化作用阶段,机械性挤压和低温(或温差)是AR的重要诱因,Ca2+对AR的外部诱导物胰酶具有激活作用；Ca2+-FASW低密度(5×106个mL)机械匀浆法和胰酶法可获得高质量不反应精子,冷冻法、胰酶-Ca2+法和抗血清法可高效诱导AR；有多个实验证据表明中华绒螯蟹精子存在获能阶段。
孙立梅[9]2013年在《高比例棉粕饲料中添加蛋氨酸及其替代物对中华绒螯蟹摄食和生长的影响》文中研究说明为了解决棉粕等植物蛋白源替代鱼粉后产生的不良影响,本研究选取我国重要的经济型甲壳动物--中华绒螯蟹为试验对象,在高比例棉粕饲料中添加晶体蛋氨酸以优化饲料中的氨基酸比例,同时发挥蛋氨酸的诱食作用以改善饲料的适口性和营养价值,采用动物营养学方法探讨了外源补充蛋氨酸对幼蟹摄食和生长的影响。在上述试验的基础上,进一步研究了饲料中分别添加甜菜碱和牛磺酸替代外源补充的晶体蛋氨酸对幼蟹生长性能和生理指标的影响,旨在节约外源补充蛋氨酸,提高机体对蛋氨酸的同化效率和饲料利用率。主要研究结果和结论如下：1、高比例棉粕饲料中补充蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹摄食、生长及抗氧化酶活性的影响以40%棉粕为主的混合蛋白源制成基础饲料,分别在其中添加0.00%、0.14%、0.28%、0.42%、0.56%蛋氨酸(分别记为0.00%Met、0.14%Met、0.28%Met、0.42%Met和0.56%Met),配制了5种等氮等能的试验饲料,以全鱼粉组(64.4%鱼粉)作为对照,探讨了在高比例棉粕饲料中补充蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹(0.39±0.02)g的摄食率、生长率和机体抗氧化酶活性的影响。结果表明：与全鱼粉对照组相比,0.42%Met组的增重率、特定生长率和饲料系数均无显着差异(P>0.05),但其显着高于0.00%Met、0.14%Met和0.28%Met组(P<0.05)；增重率和特定生长率则显着高于0.56%Met组(P<0.05)；0.42%Met和0.28%Met组的摄食量与对照组相似,当蛋氨酸的补充量低于0.28%或高于0.42%时,幼蟹的摄食量均有所下降：对照组的蛋白质沉积率最高(23.20%),在各试验组中,0.28%Met和0.42%Met组之间的蛋白质沉积率无显着差异(P>0.05),但显着高于0.00%Met、0.14%Met和0.56%Met组(P<0.05)；分析幼蟹的肠道胰蛋白酶活性,发现0.42%Met组与对照组之间无显着性差异(P>0.05),但均显着高于其他各试验组(P<0.05);0.28%Met、0.42%Met和0.56%Met处理组的血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和谷胱甘肽过氧化物酶活性与对照组无显着差异(P>0.05)。结果提示,在高比例植物蛋白(40%棉粕)的基础饲料中,补充0.42%Met能够显着提高中华绒螯蟹幼蟹的生长率、消化率和抗氧化酶的活性。2、甜菜碱替代外源补充蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹摄食、生长及血清生化指标的影响试验共设计了5种等氮等能的饲料,以混合蛋白源配制基础饲料(棉粕占40%),对照组饲料添加0.4%晶体蛋氨酸(记作C),试验组分别用甜菜碱替代外源添加量的25%、50%、75%和100%晶体蛋氨酸（分别记作25%S、50%S、75%S和100%S)。以初重为(0.28±0.01)g的幼蟹为研究对象,进行为期8周的养殖试验,探讨植物性蛋白源饲料中添加甜菜碱部分或完全替代外源补充的蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹摄食、生长和血清生化指标的影响。结果表明：分析幼蟹的增重率、特定生长率和摄食量,50%S组显着高于对照组(P<0.05),75%S和100%S组显着低于对照组(P<0.05),然而,饲料系数在50%S组最低,显着低于其他各组(P<0.05),25%S、75%S和100%S组的饲料系数与对照组相比无显着性差异(P>0.05)；甜菜碱部分或完全替代外源补充蛋氨酸对幼蟹的体成分无显着影响(P>0.05),但是50%S和75%S组幼蟹的肝胰腺脂肪含量显着低于对照组、25%S和100%S组(P<0.05)；肠胰蛋白酶活性、淀粉酶活性和脂肪酶活性均呈现先升高后降低的趋势,在替代比例为50%时达到最高值,显着高于对照组(P<0.05)；各替代组幼蟹血清的胆固醇、甘油叁酯和低密度脂蛋白含量显着低于对照组(P<0.05),与此同时,各替代组幼蟹血清的高密度脂蛋白含量显着高于对照组(P<0.05)。结果提示,甜菜碱可以替代饲料中外源添加的50%晶体蛋氨酸,同时饲料中总蛋氨酸含量不宜低于0.56%。3、牛磺酸替代外源补充蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹摄食、生长及抗氧化性能的影响试验共设计了5种等氮等能的饲料,以混合蛋白源配制基础饲料（棉粕占40%),对照组饲料添加0.4%晶体蛋氨酸(记作C),试验组分别用牛磺酸替代外源添加量的25%、50%、75%和100%晶体蛋氨酸(分别记作25%S、50%S、75%S和100%S)。以初重为(0.28±0.01)g的幼蟹为研究对象,进行为期8周的养殖试验,探讨了植物性蛋白源饲料中添加牛磺酸部分或完全替代外源添加的蛋氨酸对中华绒螯蟹幼蟹摄食、生长和免疫性能的影响。结果表明：25%S组显着高于对照组和其他各替代组(P<0.05),100%S组显着低于对照组和其他各替代组(P<0.05),然而,饲料系数在25%S组最低,但是与对照比相比差异不显着(P>0.05)；牛磺酸部分或完全替代外源添加的蛋氨酸对幼蟹的体成分无显着影响(P>0.05),但是各替代组幼蟹的肝胰腺脂肪含量显着低于对照组(P<0.05)；各替代组幼蟹肠脂肪酶活性显着高于对照组(P<0.05)；幼蟹的血清丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性和酚氧化酶活性在各组之间无显着性差异(P>0.05)。结果提示,本试验条件下,牛磺酸替代25%外源补充的晶体蛋氨酸为最佳。
金兴坤[10]2014年在《模式识别受体在中华绒螯蟹特异性先天免疫中的功能研究》文中研究表明中华绒螯蟹是我国重要的养殖经济动物品种,是长江流域居民的重要传统食物。随着对其集约化养殖的大规模发展,由细菌,病毒或立克次氏体引起的各种疾病随之大规模爆发,造成了巨大的经济损失。因此针对该物种先天免疫系统以及生物防御机制的深入研究刻不容缓。先天免疫和适应性免疫(获得性免疫)是动物宿主(Host)防御病毒、细菌和寄生虫等病原体(Pathogen)的两种免疫防御形式,两者间本质的区别在于：适应性免疫包括抗原特异性识别和免疫记忆,而先天免疫则没有。目前认为,先天免疫存在于所有后生动物中,而适应性免疫则仅存在于高等脊椎动物。无脊椎动物先天免疫“非己”识别的基础是其体内存在某些模式识别受体(PRRs),能够特异性地识别并结合病原体表面保守的病原相关分子模式(PAMPs),如脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(GLU)等。通过识别PAMPs,这些受体可以激活免疫系统中的蛋白酶以及通过免疫细胞内的信号转导途径引发免疫反应。本研究通过RNA-Seq高通量二代测序技术,构建了中华绒螯蟹血细胞经病原相关模式分子差异诱导后的转录组文库,从中筛选得到了无脊椎动物重要的模式识别受体分子。其中C型凝集素蛋白(C-type lectin domain,CTLD containing proteins)家族基因具有庞大的基因组分子多样性(至少存在40种以上的亚型分子),从而能够在蛋白质水平产生丰富的功能多样性。同时,本研究还发现单个免疫基因能够通过转录水平的外显子可变剪切调控,从而使得单个免疫分子产生数以万级的分子多样性,例如免疫球蛋白超家族基因Dscam,并针对其在中华绒螯蟹先天免疫系统中的重要功能进行了深入研究。针对无脊椎动物模式识别受体C型凝集素在甲壳动物中的分子多样性和特异性免疫功能,我们基于E.sinensis进行了以下研究。通过本实验室成功构建的一系列基于RNA-Seq的表达序列标签cDNA文库以及血细胞转录组文库,我们克隆得到四条C型凝集素基因,分别是EsLecA、EsLecF和EsLecG。通过序列比对和聚类分析发现上述基因序列均具有一个N端信号肽和一个C端糖类识别功能域(Carbohydrate Recognition Domain)。转录水平检测结果表明(1)EsLecA和EsLecG在所有检测组织中均表达；(2)经脂多糖(LPS)诱导后,EsLecA和EsLecG在肝胰腺、鳃和血细胞等免疫器官中均有不同程度的诱导表达；而EsLecF仅在肝胰腺中特异性表达,并且经LPS诱导后能够大量表达。原核表达重组rEsLecA、rEsLecF和rEsLecG蛋白能够广泛结合不同的病原微生物,包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌,并且其微生物结合活性是钙离子不依赖的。病原微生物生长抑制检测和抗菌活性检测结果表明rEsLecA、rEsLecF和rEsLecG蛋白均能够不同程度地抑制细菌生长甚至直接杀死细菌。体外细胞包裹实验验证了rEsLecA、rEsLecF和rEsLecG蛋白均具有不同程度的细胞调理活性,并能够在体外刺激血细胞的包裹活性。通过上述研究,初步阐明了中华绒螯蟹C型凝集素具有核酸水平的分子多样性和蛋白水平的功能多样性,为甲壳动物乃至其他无脊椎动物先天免疫特异性分子机制的研究提供了重要参考。近年来,无脊椎动物先天免疫的特异性水平及其免疫记忆受到了极大关注,“替代适应性免疫”(Alternative adaptive immunity)在节肢动物、软体动物以及棘皮动物等无脊椎动物中的发现,使得“适应性免疫是脊椎动物免疫的一种专有特征”这一传统观点受到了严峻挑战。节肢动物Dscam基因可通过外显子选择性剪切方式产生惊人的分子多态性从而特异性地识别不同的病原体。我们从大量转录组信息的分析中发现并成功克隆得到了中华绒螯蟹Dscam基因(EsDscam),通过生物信息学比对分析发现其由典型功能域组成,包括1个信号肽(Signal-peptide),10个免疫球蛋白功能域(Immunoglobulin,Ig domains),6个叁型纤连蛋白功能域(Fibronectin type Ⅲ domains,FNⅢ),一个跨膜功能域(Transmembrane domain, TM)和一个细胞质尾(Cytoplasmic tail)。在EsDscam中我们通过TA克隆测序技术发现了4个可变剪切区：Ig2功能域的N端部分(25个亚型),Ig3功能域的N端部分(30个亚型),Ig7功能域(18个亚型)和跨膜功能域(2个亚型),至少可以产生27000种不同的亚型。EsDscam在E.sinensis的所有组织中均广泛表达,尤其是在免疫系统、消化系统和神经系统中表达最高。使用脂多糖(LPS)、肽聚糖(PGN)和葡聚糖(GLU)分别对E.sinensis进行体内免疫刺激后,EsDscam基因在血细胞中表现出了差异诱导表达模式。通过RACE-PCR技术,我们发现EsDscam具有两种表达类型,分别是跨模型(Transmembrane或Membrane-bound)和分泌型(Secreted或Cytosolic).且与跨模型相比,分泌型在不同模式分子(PAMPs)刺激后显着表达。免疫荧光定位结果证明EsDscam蛋白定位在中华绒螫蟹血细胞表面。本研究初步阐明中华绒螯蟹Dscam基因能够通过外显子可变剪切产生数以万级的分子多样性及其经病原刺激后的差异诱导剪切现象,为后续针对其免疫识别的功能多样性研究提供数据支持,为中华绒螯蟹乃至甲壳动物疫苗的研发提供了一定的理论基础。
参考文献：
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[3]. 中华绒螯蟹新型免疫调节剂及其酚氧化酶的纯化和性质研究[D]. 李义. 南京农业大学. 2007
[4]. 中华绒螯蟹血清凝集素生物学特性的研究[D]. 刘雪兰. 安徽农业大学. 2002
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[6]. 中华绒螯蟹免疫致敏现象及相关分子机制的初步研究[D]. 王晶晶. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2013
[7]. 中华绒螯蟹和南极磷虾组织蛋白酶家族的酶学性质研究[D]. 祝倩倩. 青岛科技大学. 2017
[8]. 中华绒螯蟹精子顶体反应影响因素及相关蛋白的研究[D]. 李根亮. 河北大学. 2008
[9]. 高比例棉粕饲料中添加蛋氨酸及其替代物对中华绒螯蟹摄食和生长的影响[D]. 孙立梅. 华东师范大学. 2013
[10]. 模式识别受体在中华绒螯蟹特异性先天免疫中的功能研究[D]. 金兴坤. 华东师范大学. 2014