新乡医学院三全学院 河南新乡 453003
摘要：目的：研究女贞子总三萜的制备方法及其抗氧化活性。方法：用甲醇浸提，石油醚、乙酸乙酯先后萃取，乙醇热溶冷沉法纯化制备总三萜，并采用2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）法测定总三萜的抗氧化能力。结果：制备女贞子总三萜纯度为93.33%，浓度在214.9μg/mL时，对DPPH的清除率为94.65%，与VC的清除率96.78%接近。结论：乙醇热溶冷沉法制备女贞子总三萜纯度高，其抗氧化能力与VC接近。
关键词：DPPH法；抗氧化；总三萜；女贞子
基金项目：河南省高等学校重点科研项目(名称：牛膝茎叶化学成分及抗癌活性研究，编号：17A350002)
项目经费来源：校级科技创新团队
Abstract: Objective: To determine the content of total saponins of Ligustrum lucidum and its antioxidant capacity. Methods: The total saponins of Ligustrum lucidum were isolated by methanol extraction, petroleum ether and ethyl acetate successively, and the total saponins were purified by heat soluble cold precipitation method of melt. The antioxidant capacity of total saponins was determined by the method of 2,2-two phenyl-1-bitter hydrazine (DPPH). Results: The content of total saponins of Ligustrum lucidum was 93.3%. When the concentration was 214.9 g/mL, the scavenging rate of DPPH was 94.65%, which was closed to of VC clearance(96.78%). Conclusion: The total saponins of Ligustrum lucidum were highly purified by heat soluble cold precipitation method of melt, and the antioxidant ability was closed to VC.
Key Word: DPPH; antioxidant activity; total saponins; Ligustrum lucidum
女贞子为木犀科植物女贞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果实，是一味补肾滋阴、养肝明目的中药，可用于肝肾不足、头晕耳鸣、头发早白及两目昏糊等病症。三萜类化合物为其主要化学成分，且含量高，有文献报道其含量可达到6.08%[1-4]。三萜类化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理活性[5-6]，Xiao等[7-9]从五味子中分得的三萜类化合物具有抗HIV活性。DPPH是一种稳定的有机自由基，有机溶液呈紫色，在波长为517nm波长处具有最大光吸收。自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可以通过吸光度的变化进行定量分析［10-11］。本文利用女贞子中三萜类化合物在冷热乙醇中溶解度差异不同的进行分离纯化，通过测试女贞总三萜对DPPH自由基的清除能力，评价其抗氧化活性。
1仪器与试药
1.1实验材料
女贞子药材于2017年11月采自河南省新乡市原阳县新乡医学院三全学院校园内，经新乡医学院苏慧慧鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实；熊果酸购自中国食品药品检定研究院（批号：110742-201622）；2,2-二苯基-1-苦基肼（DPPH）；VC、高氯酸为优极纯；香草醛、冰乙酸、甲醇、无水乙醇均为分析纯。
1.2实验仪器
T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；FA2004电子F分析天平（批号：14D101-1000，上海良平仪器仪表有限公司）；HH恒温水浴锅(金坛市中大仪器厂)；旋转蒸发仪(R206)(上海申生科技有限公司)；SHZ-3循环水式多用真空泵、CCA-420低温冷却水循环泵（郑州杜普仪器厂）。
2方法与结果
2.1总三萜的提取
取女贞子药材30kg，100L甲醇浸提3次，每次4-7天，合并浸提液，60℃减压回收溶剂至浸膏状。以水分散混悬，石油醚萃取至颜色不再加深，回收溶剂至浸膏，备用。水相继续用乙酸乙酯萃取至颜色不再加深，回收溶剂至浸膏，烘干后得到乙酸乙酯部位950g。
2.2总三萜的纯化
取50g乙酸乙酯部位，65℃超声振荡溶于500mL无水乙醇中，自然冷却至室温，析出三萜沉淀，抽滤，室温下用无水乙醇洗涤。滤液与前母液合并。合并后母液60℃减压浓缩至溶液浑浊，开始析出固体，自然冷却至室温，析出三萜沉淀。抽滤，室温下用无水乙醇50mL洗涤。滤液与前母液合并。同上述方法再分离一次，合并3次沉淀物，得到总三萜类，烘干得25.61g。
2.3总三萜含量测定
2.3.1标准曲线的制备
精密称取3.3mg熊果酸定容至25mL容量瓶，加甲醇溶解定容，摇匀即得浓度为0.132mg/mL的对照品溶液。精密称取熊果酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于试管中，100℃水浴蒸干甲醇，加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2mL和1.00mL高氯酸溶液，密塞，在60℃水浴加热15min后，移入冰水浴，再加入5.00mL冰乙酸摇匀，在545nm处测定吸光度。以熊果酸对照品浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线，结果见图1。回归方程为：Y=42.28X-0.003，r=0.9999，表明熊果酸在含量为0.00~0.0213mg范围内与吸光度呈良好线性关系。
2.3.2重复性试验
精密称取同一样品10.0mg，共5份，按“2.3.5”项下制备样品溶液，精密吸取供试品溶液1.0mL，按标准曲线项下自“100℃水浴蒸干甲醇”开始操作，在517nm处测定吸收值，RSD为3.08%，表明该方法重复性良好。
2.3.3稳定性试验
精密称取同一样品10.0mg，按“2.3.5”项下制备样品溶液，精密吸取供试品溶液1.0mL，按标准曲线项下自“100℃水浴蒸干甲醇”开始操作，分别在0、30、60、90、120min 517nm处测定其吸光度值，RSD为1.41%，表明样品在120min内稳定性良好。
2.3.4加样回收率试验
取同一样品10.0mg，共6份，精密称定，分别精密加入对照品3.0mg，按“2.3.5”项下制备样品，精密吸取供试品溶液1.0mL，按标准曲线项下自“100℃水浴蒸干甲醇”开始操作，测定各样品的吸光度值，RSD值为1.28%。
2.3.5总三萜含量的测定
精密称取制备好的三萜样品10.0mg，至100mL容量瓶，加甲醇溶解，定容至刻度备用。精密吸取样品溶液1.0mL至试管中，按“2.3.1”项下方法，从“100℃水浴挥干甲醇”开始测定总三萜含量，得总三萜含量为93.33%，RSD值为3.12%。
2.4抗氧化实验
2.4.1 DPPH溶液的配制
DPPH母液：精密称取14.40mg DPPH至50mL容量瓶。用乙醇溶解，定容。
DPPH稀释液：精密吸取20mL DPPH母液至100mL容量瓶，用乙醇定容。
2.4.2样品溶液的配制
精密称取30.7mg女贞子三萜样品，至100mL容量瓶中，无水乙醇溶解，定容至刻度，备用。
2.4.3抗氧化标准曲线的绘制
取11.3mg VC至100mL容量瓶，用乙醇定容，得VC浓度为0.113mg/mL。精密吸取上述VC溶液0.1、0.2、0.6、0.8、1.6、2.0、4.0、6.0、10.0、16.0、20.0mL置于25mL容量瓶中，乙醇定容。分别吸取上述不同浓度VC溶液1.0mL至试管中，依次加入2.0mL DPPH稀释液，摇匀，避光反应30min后在517nm处测吸光度D1。再分别吸取上述不同浓度VC溶液1.0mL至试管中，分别加入2.0mL乙醇，摇匀，避光反应30min后在517nm处测吸光度D2。取1支试管，加入2.0mL DPPH和1.0mL乙醇，摇匀，避光反应30min后在517nm处测吸光度D0。按照以下公式计算VC对DPPH的清除率：
2.4.4总三萜抗氧化能力的测定
分别吸取不同体积0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0mL的样品溶液各两份至不同的试管中，一份样品加入2.0mL DPPH稀释液、不同体积的乙醇溶液使总积均为10.0mL，摇匀，避光反应30min后用无水乙醇作参比，在517nm处测定测定吸光度D1。另一份样品加入乙醇溶液使总体积均为10.0mL，摇匀，避光反应30min后用无水乙醇作参比，在517nm处测定测定吸光度D2。取2.0mLDPPH溶液至试管中，加入8.0mL乙醇溶液，摇匀，避光反应30min后用无水乙醇作参比，在517nm处测定测定吸光度D0。计算样品溶液DPPH清除率。以VC及样品浓度（μg/ml）为横坐标，DPPH清除率为纵坐标绘制曲线，结果见图2。
由图2可知，女贞总三萜具有清除DPPH能力，随着总三萜浓度增大，DPPH清除率呈逐渐增加的趋势，当浓度超过约107.45μg/ml，清除率达到92.59%，之后随着浓度的增大清除率变化不大。
3 结论
本实验利用女贞子中三萜类化合物在冷热乙醇中溶解度差异较大的特性制备女贞子总三萜，该方法简单，高效，总三萜纯度达93.33%。
在DPPH清除实验中，女贞子三萜显示了良好的清除自由基的能力，在浓度为3.07~245.6μg/mL范围内，其抗氧化活性均接近Vc。通过测定女贞总三萜对DPPH的清除率，结果表明其具有抗氧化活性，样品浓度在214.9μg/mL时，对DPPH的清除率为94.65%，与VC的清除率96.78%接近，这与姚文红等[13]对女贞花的研究结果相类似。该研究可为女贞子的综合开发利用提供参考。
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论文作者:李彦灵 罗冬梅 吴振静 杨可佳 陈文婷 王志佳 闫福林（通讯
论文发表刊物:《临床医学教育》2018年12期
论文发表时间:2018/12/11
标签：女贞子论文; 溶液论文; 乙醇论文; 精密论文; 光度论文; 样品论文; 抗氧化论文; 《临床医学教育》2018年12期论文;