浙江北生药业汉生制药有限公司 浙江省 322100
摘要：目的 建立奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的适用性试验。方法 按《中国药典》2015年版四部无菌检查方法要求，采用薄膜过滤法，对奥扎格雷钠注射液（规格5 ml:80 mg）进行无菌检查方法适用性试验。结果 奥扎格雷钠注射液采用薄膜过滤法，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌，进行无菌检查方法学验证，验证结果符合《中国药典》2015年版四部无菌检查方法适用性试验要求。结论 该方法可作为奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法。
关键词：奥扎格雷钠注射液；无菌检查；薄膜过滤法；方法学适用性试验
中图分类号：R284.1；R917.101 文献标志码：A 文章编号：1007-7693
奥扎格雷钠注射液主要用于治疗急性血栓性脑梗塞和脑梗塞所伴随的运动障碍，及改善蛛网膜下腔出血手术后的脑血管痉挛收缩和并发脑缺血症状。临床上也可联合用药，如与纳洛酮注射液联合用药治疗脑梗死。与低分子肝素钙治疗不稳定型心绞痛效果显著，有助于改善患者血液流变学指标。有研究表明奥扎格雷钠注射液对慢性阻塞性肺病有保护作用。奥扎格雷钠注射液无抑菌性，可直接采用薄膜过滤法进行该产品的无菌检查。本文对奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法进行试验研究，以确定奥扎格雷钠注射液的无菌检查方法的有效性。
1 仪器与试剂
1.1 供试品 奥扎格雷钠注射液（规格：5 ml:80 mg；批号：1704271、1704272、1704273；），供试品均由浙江北生药业汉生制药有限公司提供。
1.2 培养基和试剂 硫乙醇酸盐流体培养基（批号：150605）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：150629）、胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：1612262）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：1611283）、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1310292），培养基生产厂家均为北京三药科技开发公司。聚山梨酯80（批号：20150608），生产厂家为国药集团化学试剂有限公司。
1.3 试验菌株 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F) 98003]、生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941]，菌种均来自浙江省食品药品检验研究院，所用菌种均为3代菌种。
1.4 仪器 集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、隔水式电热培养箱（上海浦东荣丰科技仪器有限公司）、生化培养箱（上海申贤恒温设备厂）、电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）、立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、电热恒温鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、集菌仪（杭州高得(泰林)医疗器械有限公司）、生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌至胰酪大豆胨液体培养基中，30～35 ℃培养18～24小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100 cfu的菌悬液，稀释级别为10-7、10-7、10-4、10-7，。接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35 ℃培养18～24小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100 cfu的菌悬液，稀释级别为10-5。接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20~25 ℃培养24~48小时。取经培养的菌液培养物1 ml，加入9ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，10倍稀释成含菌数不大于100cfu的菌悬液，稀释级别为10-5。接种黑曲霉的新鲜培养物，至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20~25℃培养5~7天。取培养物，加入3ml含0.05%（ml·ml-1）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液将孢子洗脱，吸出孢子悬液转移至无菌空试管作为原液，加含0.05%（ml·ml-1）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍稀释成含菌数不大于100cfu的菌悬液，稀释级别为10-3。
2.2 试剂的制备
培养基及所选的的溶剂按照《中国药典》2015年版四部无菌检查的规定进行配制、分装和灭菌后备用。
2.3 培养基适用性检查
2.3.1 无菌性检查 每批培养基随机取5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30~35℃，培养14天，胰酪大豆胨液体培养基置20~25℃，培养14天，观察，无菌生长。
2.3.2 灵敏度检查 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种，作为空白对照，培养3天；取每管装量为9ml的胰酪大豆胨液体流体培养基7支，分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种，作为空白对照，培养5天，逐日观察结果。培养基的灵敏度检查符合规定。结果见表1：
表1 培养基灵敏度检查结果
Tab 1 The medium sensitivity tests results
注：+表示浑浊或有菌生长；“-”表示澄清或无菌生长。下同。
Note: +, cloudy or bacterial growth; -, clear or no bacterial growth. The same as below.
2.4 菌液计数
2.4.1 分别取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌菌液1ml加入培养皿。分别注入胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml，30~35℃培养3天，计数，每种菌液做两个平行样。
2.4.2 分别取白色念珠菌菌液、黑曲霉孢子菌悬液1ml加入培养皿，注入沙氏葡萄糖琼脂培养基约15~20ml，20~25℃培养5天，计数，每种菌液做两个平行样。
2.5 验证组的制备及培养
2.5.1 试验菌对照组 取一套三联封闭式集菌培养器，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，按无菌操作方法，直接在每个培养器内注入100ml硫乙醇酸盐流体培养基。同法在三个封闭式集菌培养器内注入100ml胰酪大豆胨液体培养基。将已注入硫乙醇酸盐流体培养基的三个集菌培养器中分别接种10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及生孢梭菌菌液。置30~35℃温度，培养5天，逐日观察生长情况，并记录。将已注入胰酪大豆胨液体培养基的三个集菌培养器中分别接种10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉菌悬液。置20~25℃温度，培养5天，逐日观察生长情况，并记录。
2.5.2 供试品试验组 取供试品60支/每批，消毒供试品安瓿瓶外壁，分三组，每组20支。取三套两联封闭式集菌培养器，照无菌检查法操作，将20支药液全部泵入两联集菌培养器（每批号供试品同法制备三组，得到六个加入供试品的集菌培养器），不加冲洗液，直接泵入培养基100ml，其中3个集菌培养器中泵入硫乙醇酸盐流体集菌培养，另外3个集菌培养器中泵入胰酪大豆胨液体培养基。向已注入硫乙醇酸盐流体培养基的供试品3个集菌培养器中，分别接种10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及生孢梭菌菌悬液。置30~35℃温度，培养5天，逐日观察生长情况，并记录。向已注入胰酪大豆胨液体培养基的供试品的集菌培养器中，分别接种10倍稀释制成每1ml含菌数不大于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌及黑曲霉菌悬液。置20~25℃温度，培养5天，逐日观察生长情况，并记录。
2.5.3 阴性对照组 用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜，按无菌操作方法，不加供试品、不加菌液，直接在每个培养器内注入100ml硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。
2.5.4 供试品检查 按供试品试验组的操作（不加试验菌液），对供试品进行无菌检查。
2.5.5 验证取三个批号供试品进行试验。验证结果见下表2～5。
表2 菌液稀释级别及计数结果
Tab 2 The dilution and cfu of bacteria liquid
结果表明：供试品试验组和试验菌对照组培养器中实验菌均生长良好。与试验菌对照组比较，含供试品各容器中的试验菌均生长良好，说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计。
3 讨论
3.1 薄膜过滤法 《中国药典》2015年版要求“只要供试品性状允许应优先采用薄膜过滤法”，薄膜过滤法是将规定量的供试品或供试液通过薄膜过滤处理，使产品中可能存在的微生物过滤时被阻留、富集在微孔滤膜上，然后接种适宜的培养基，使滤膜上阻留的微生物得以生长繁殖到肉眼能观察到的状态而被检出。奥扎格雷钠注射液无菌检查方法学验证采用封闭式薄膜过滤法进行，结果符合要求。
3.2 阳性菌选择 根据《中国药典》2015年版通则无菌检查的规定，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。奥扎格雷钠注射液无抑菌性，无菌检查方法学验证阳性菌采用金黄色葡萄球菌，验证结果符合要求。
3.3 奥扎格雷钠注射液无抑菌性，采用直接过滤药液，无冲洗量。试验过程中，为充分发挥滤膜的最大过滤效率，在过滤药液前先用pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液润湿滤膜。
3.4 采用上述方法对规格为5ml：80mg奥扎格雷钠注射液进行无菌检查方法学验证，验证结果符合《中国药典》2015年版的规定。故可照此检査方法和检查条件进行供试品的无菌检查。
参考文献：
[1]Wang C H, Yi L G.Study on the Compatibility Stability of Ozagrel Sodium for Injection and Injection Containing Fructose[J].Chin Pharm(中国药房), 2016，27(2):191-192.
[2]Wang X W, Yu D Z, Fang X, On Bacterial Endotoxin Test For Ozagrel Sodium for Injection[J].Chinese Pharmaceutical Affairs(中国药事), 2017, 31(4):403-406.
论文作者:张春景 王晓旦 王强 周欣盈 黄庆春
论文发表刊物:《中国医学人文》2017年第12期
论文发表时间:2018/3/5
标签：培养基论文; 注射液论文; 蛋白胨论文; 缓冲液论文; 格雷论文; 滤膜论文; 氯化钠论文; 《中国医学人文》2017年第12期论文;