1佛山市高明区人民医院骨一科 广东佛山 528500；2南方医科大学南方医院创伤骨科广东广州 510515
摘要：目的：分析EPO联合机械刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法：收集收集80例小鼠，将其分为对照组、低度组、中度组和高度组。对照组不使用EPO联合机械刺激，低度组使用低剂量EPO联合机械刺激，中度组使用中剂量EPO联合机械刺激，高度组使用高剂量EPO联合机械刺激。结果：随着剂量和强度的提升，骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路也有所升高，但一旦过高则会导致降低，差异显著（P＜0.05）。结论：EPO联合机械刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路会产生显著影响。
关键词：EPO；机械刺激；骨髓间充质干细胞；Wnt/β-catenin信号通路
如何增大骨量，是当前临床上得到了较多研究的问题。在当前的研究中显示，运动对骨的影响具有重要的意义，运动可以通过影响BMSCs成骨分化而影响骨量，大量的研究表明机械刺激是维持骨健康的重要影响因素[1]。体外机械刺激对BMSCs增殖及成骨分化有重要影响，但结论尚不统一，刺激强度可能是导致不一致结果的重要原因。而EPO和体外机械刺激相同，其剂量的不同也会对骨髓间充质干细胞成骨分化也会产生较大影响，所以研究不同强度机械刺激对BMSCs成骨影响具有重要的意义[2]。本研究分析了EPO联合机械刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响，具体如下：
1 对象和方法
1.1 对象
研究对象为我院实验动物中心提供的大鼠80只，均为雌性，体重180-220g。将其按照EPO注射以及机械刺激的强度，将其分为4组，即对照组、低度组、中度组和高度组。
1.2 方法
1.2.1 EPO注射
对照组大鼠不进行EPO注射，低度组进行低剂量注射（30u/kg）、中剂量注射（50u/kg））和高剂量注射（80u/kg））。每周注射3次，方法为腹腔注射。
1.2.2 机械刺激
美国flexcell公司生产的细胞柔性基底加载装置（FX 5000 tension）的作用机理是通过一个真空泵抽吸特制的柔性细胞培养膜形成负压而使培养膜产生拉伸应变从而使黏附生长的细胞受到张力的作用，细胞所受力的大小正比于培养膜的牵拉幅度即应变率（%），加载程序由FX 5000计算机软件自动控制。对照组不进行机械刺激，低度组负荷0.5N，频率5HZ，中度组负荷0.5N，频率10HZ，高度组负荷0.5N，频率20HZ。
1.2.3 BMSCs的培养方法及BMSCs的成骨分化方法
颈椎脱臼法处死SD大鼠，在75%的酒精浸泡5min，在无菌超净台取出双侧股骨和胫骨，并在75％酒精中浸泡5min，然后放在无菌PBS中浸泡5min，剪去骨骺端显露骨髓腔，用10ml无菌注射器吸取2-3ml LG-DMEM培养基冲出骨髓，反复冲洗2-3次后离心弃去脂肪层，所获细胞重新用4m1 10％（v/v）FBS的LG-DMEM基础培养基（含双抗）制成细胞悬液。将细胞悬液直接种入25cm2培养瓶中，并于37℃、5％CO2的培养箱内培养，第二天首次换液，以后每2-3天换液，7-10天后细胞融合80%即用胰酶消化传代，取第三代细胞用于实验。成骨诱导液：用含50mg/L抗坏血酸、0.1 mmol/L地塞米松、0.5 mmol/L β-甘油磷酸钠体积分数为10%FBS的DMEM培养基培养BMSCs，成骨诱导用作阳性对照。
1.2.4 Wnt/β-catenin信号通路分析
在对Wnt/β-catenin信号通路进行分析过程中，使用实时荧光定量PCR测定，各组BMSCs培养结束后，加入Trizol 1ml，研磨均匀，转入无RNA酶的EP管；加200μl氯仿，盖紧管盖，用力振荡15s，室温放置5min；4℃ 12000×g离心15min，离心后小心吸取上层水相，至另一干净的EP管中，约0.5ml，加入500μl异丙醇沉淀RNA，颠倒混匀后静置10min；4℃ 12000×g离心10min，小心取出EP管，弃去上层液体，每管加1ml 75%乙醇（DEPC水配制）洗涤RNA，温和振荡，悬浮沉淀；4℃ 7500×g离心5min，弃上清，通风橱中风干约30min；根据提取出的RNA量加DEPC水溶解RNA（20-40μl）；测OD值定量RNA浓度并计算RNA体积。
1.3 观察指标
骨髓间充质干细胞成骨分化检测指标为OSX以及bFGF的mRNA。同时需比较其Wnt以及β-catenin mRNA。
1.4 统计学分析
实验数据采用均数±标准差表示，采用SPSS13.0统计软件统计分析。多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐性，进一步采用 SNK 检验进行两两比较；若方差不齐，采用Kruska-Wallis H 检验；P<0.05，差异有统计学意义。
2 结果
2.1 EPO联合机械刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
通过本研究显示，随着剂量和强度的提升，骨髓间充质干细胞成骨分化所升高，但一旦过高则会导致降低，如表1所示：
表1 EPO联合机械刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化影响（）
注：“*”表示和对照组差异显著，“#”表示和低度组差异显著。
3 讨论
促红细胞生成素（erythropoietin EPO）是一种可调节红细胞生成的糖基化蛋白质激素，主要由肾脏产生。近年来发现，EPO受体（EPoR）除分布于造血组织外，还广泛分布于各种非造血组织，具有多种非造血生物作用，如促进血管生成、胚胎发育和抗炎等[3]。最近大量的研究发现EPO对骨的调节起极其重要的作用，Shiozama等[4]在BMSCs上发现EPOR，发现人重组EPO对BMSCs增殖及分化能力有重要作用，认为EPO可以通过以下方面增加骨量及促进骨折愈合：一方面，EPO直接作用于BMSCs促进其成骨分化，从而增加骨形成；另一方面，EPO可以作用于hSCs，通过激活Jak-stat等信号通路而释放骨形成蛋白（BMP2），从而间接促进骨形成；EPO还可以通过抑制破骨细胞的活性而增加骨形成。然而，Singbrant S等[5]发现给小鼠腹腔注射EPO后小鼠的松质骨下降26%并增加骨重塑，引起骨量下降；Holstein JH[6]等发现适量的EPO会增加骨形成并促进骨折愈合，而浓度过高时这种效果显著降低，所以体内实验结果显示EPO对骨量及骨折愈合的影响可能和EPO的浓度密切相关。
机械刺激是骨组织生长和发育的重要影响因素。机械刺激可通过影响骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化而影响骨量，Luu YK等[7]表明体外机械刺激表明低频机械刺激能增加骨髓间充质干细胞的分化，从而增加骨量。Zhang P等[8-9]发现给膝关节施以机械振动刺激，用0.5N负荷分别施加频率为5、10、15、20HZ的振动，结果发现10HZ的振动对骨膜表面的矿化面积、骨矿化率和骨形成率是最大的，这说明和振动的强度有关。体外实验结果也显示机械刺激对BMSCs的增殖及分化作用尚不统一，Luu等[10]认为机械刺激可增加BMSCs的增殖并能促进其成骨分化和抑制成脂肪分化；Koike[11]认为低强度的机械应力能够促进骨髓间充质干细胞的成骨分化；Li R[12]认为低强度的牵拉刺激力能够促进成骨分化，牵拉力太大产生更多的氧自由基，反而不利于骨形成，故机械刺激对BMSCs成骨影响可能与刺激强度相关。
本研究即分析了不同浓度的EPO以及不同强度的机械刺激对骨髓间充质干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响。通过本研究显示，随着EPO浓度的增加以及机械刺激强度的增加，骨髓间充质干细胞成骨分化会不断提升。但若EPO浓度过高以及机械刺激强度过高，则会导致这种成骨分化降低。
综上所述，除运动引起的局部机械刺激对骨产生作用外，体内EPO也可能是影响骨量的重要因素。经典Wnt/β-catenin信号通路是调节BMSCs成骨分化的重要信号通路，通过调节GSK-3β磷酸促进β-catenin进入细胞核与TCF/LEF等结合，启动成骨分化转录因子成骨。但若机械刺激和EPO若过量，则会对骨髓间充质干细胞成骨分化和骨量造成影响。
参考文献：
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基金项目：佛山市医学类科技攻关项目2015AB001084佛山市十三五医学重点专科和特色专科建设，合同编号：FSZDZK135059
论文作者:刘伟1,夏雄超1,严卓云1,刘圣曜2,李贝1,邓淞
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年7月22期
论文发表时间:2018/9/11
标签：干细胞论文; 骨髓论文; 机械论文; 强度论文; 信号论文; 剂量论文; 细胞论文; 《中国误诊学杂志》2018年7月22期论文;