摘要：目的 通过观察药物FK1706对大鼠急性脊髓损伤（ASCI）后神经生长相关蛋白-43（GAP-43）表达的影响以及组织学和行为学方面的改变；探讨FK1706治疗急性脊髓损伤的疗效。方法 将150只雄性大鼠随机分为 A 组（假手术组）、B组（脊髓损伤组）、C组（FK1706组）。采用钳夹法建立大鼠T10脊髓损伤模型。A组行椎板切除术，不损伤脊髓组织，B组切除椎板后，使用钳压法损伤脊髓，C组脊髓损伤术后立即尾静脉注射FK1706（1.0mg／kg），与此同时，A、B组注入等量生理盐水。以后每天同一时间注射1次，分别于术后第1天、第3天、第7天、第14天、第28天，每组各取5只行BBB评分（Basso，Beattie and Bresnaha）评价后肢运动功能、HE 染色观察损伤后脊髓的形态学变化；RT-PCR检测 GAP-43 的表达。采用SPSS19.0进行数据分析，采用单因素方差分析，各组方差齐时，组间比较采用LSD-t检验，各组方差不齐时，采用Tamhane’s T2检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果 1、RT-PCR：大鼠脊髓损伤后各组各时间点损伤区域均有GAP-43 阳性表达。A组呈持续的低表达，实验观察期间未见明显波动。术后第1d，各组GAP-43 升高不明显（P＞0.05）。术后第3d，B、C组GAP-43均有不同程度升高，与A组相比（P＜0.05），且C组稍高于B组（P＜0.05）。术后第7d，B、C组GAP-43表达达到最高，C组明显高于B组（P＜0.05），且C组较术后3d明显升高（P＜0.05）。术后14d，B、C组GAP-43表达均有下降，C组最高，B组次之，3组间差异均具有统计学意义（P＜0.05）。术后28d，B、C两组基本回到基线水平，与A组相当（P＞0.05）。2、HE 染色：结果显示A组脊髓组织未见明显异常，B、C两组早期炎性水肿显著，光镜下逐渐可见囊腔形成。到4周后，B组囊腔内见胶质细胞聚集，形成瘢痕组织，C组胶质细胞稀疏分散，囊腔闭合，未见明显瘢痕形成。3、BBB 评分：A组运动功能正常，B、C组评分随时间呈上升趋势，于 7 d、14 d、及28d，C组评分高于B组（P<0.05）。结论 在急性脊髓损伤时，药物FK1706诱导 GAP-43基因的表达，减少胶质瘢痕的形成；促进轴突再生，有利于脊髓功能恢复。
关键词：脊髓损伤；FK1706；生长相关蛋白-43
前言
脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）发生率在全世界呈现居高不下的趋势。临床上急需一种安全高效的治疗脊髓损伤的药物。21世纪伊始，price[1]等报道他克莫司的衍生物FK1706，通过FK506的效应结构改变，保留其神经生长作用，却能削弱其免疫抑制作用。本实验旨在了解FK1706在SCI后的神经保护、营养作用。GAP-43是一种特异性神经元磷酸化蛋白质，在中枢神经系统发育过程中持续表达，发挥重要作用；因而被认为参与了神经发育的过程[2]。本实验通过建立大鼠T10急性脊髓损伤模型，给予注射药物FK1706治疗，通过HE 染色，RT-PCR结合琼脂凝胶电泳检测GAP-43 表达的情况并综合后肢运动功能的BBB评分结果，以研究FK1706在治疗急性脊髓损伤神经再生的效果，为临床提供实验依据。
方法
1.建立动物模型
大鼠术前8小时禁食，4小时禁水。腹腔注射10％的水合氯醛麻醉大鼠，注射量按0.3ml/100g计算。麻醉达成后，大鼠取俯卧位，术区备皮，消毒，以T10为中心取后正中切口，逐步显露T9—T11的棘突和椎板，利用显微手术器械，伸入椎板，将其咬除一小破口，然后逐渐扩大范围，直至将整个椎板咬除。使用脊髓钳夹器钳夹脊髓30s，造模成功后，再次消毒依次缝合切口。
2.分组
150只SD大鼠共分三组，每组50只，假手术组（A组），脊髓损伤组（B组）、FK1706治疗组（C组），假手术组（A组）仅去除椎板，C组完成造模后按体重尾静脉注射FK1706（1.0mg/kg），每日1次，B、C组同时注入等量生理盐水。分别于术后第1天、第3天、第7天、第14天、第28天，过量10%水合氯醛麻醉大鼠，剪取损伤段脊髓上下0.5cm节段，每组每次随机选10只取标本，操作前行BBB运动评分，其中5只行RT-PCR，另5只行HE组织学染色。
3.观察指标
3.1 RT-PCR：于术后1、3、7、14、28天分别对大鼠进行过量麻醉。各组脊髓标本取出后，取其中5个标本进行PCR反应，凝胶成像系统图像采集，最后行Image J图像灰度值分析各DNA条带相对应的灰度值。
3.2组织学观察：采用HE染色：于术后第1天、第3天、第7天、第14天、第28天时每组分别取5只大鼠，经10%水合氯醛过量腹腔注射麻醉后，迅速从损伤部位中心取长约1cm脊髓，取出脊髓后，置入10％福尔马林液中保存备用。然后行石腊包埋及，最后进行HE染色并光学显微镜观察并照相。
3.3太鼠后肢运动功能观察：采用（Basso—Beattie—Bresnahan，BBB）评分对3组大鼠后肢运动功能进行评定，在同一时间由研究人员对大鼠后肢运动、躯干控制、肢体协调性等进行观察（观察时间持续5 min）并评分，最终结果取平均值。术后1d、3d、7d、14d、28d评定1次。
4、统计学分析
采用SPSS19．0统计软件进行实验数据的分析，以均数±标准差（`x±S）表示，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），各组方差齐时，比较差异采用t（LSD-t）检验。各组方差不齐时，采用Tamhane’s T2检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
结果
1、实验动物分析：纳入大鼠共150只，因麻醉药剂量过大致8只大鼠麻醉过深于术中死亡，予以补充。钳夹型脊髓损伤术后，大鼠均苏醒，术后伤口对合良好，未见明显红肿、渗液，B、C组大鼠前肢活动可，后肢不能运动，爬行时，后肢呈拖行状。每日定时按摩膀胱，帮助脊髓损伤大鼠排尿，以防尿路感染，但注意操作轻柔，以免挤破膀胱。
2、以100bp DNA ladder做参照物，条带自下往上分别是100bp、200bp、300bp、500bp、750bp、1000bp、1500bp、2000bp。目的基因242bp、管家基因163bp，目的基因和内参基因的分子量和预计相符，凝胶电泳结果可靠，电泳结果从左至右，第一个是假手术组，第二至第六个和第七至第十一分别是单纯损伤组和FK1706组的术后第1d、第3d、第7d、第14d、第28d。通过Image J计算两者的灰度值，用目的基因比内参基因，产生灰度比值。大鼠脊髓损伤后各组各时间点损伤区域均有GAP-43 阳性表达。A组呈持续的低表达，实验观察期间未见明显波动。术后第1d，各组GAP-43 升高不明显（P＞0.05）。术后第3d，B、C组GAP-43较A组均有不同程度升高（P＜0.05），且C组稍高于B组（P＜0.05）。术后第7d，B、C组GAP-43表达达到最高，C组明显高于B组（P＜0.05），且C组较术后3d明显升高（P＜0.05）。术后14d，B、C组GAP-43表达均有下降，C组最高，B组次之，3组间差异均具统计学意义（P＜0.05）。术后28d，B、C两组基本回到基线水平，与A组无异（P＞0.05）。
图3 各组GAP-43/β-actin比值分布图
3、脊髓标本HE染色光镜结果
术后第1天，第3天，第7天，第14天，第28天，过量水合氯醛麻醉致死大鼠，剪取病损脊髓节段，通过连续性观察脊髓组织HE染色横切片及冠状切片情况，了解病损区的病理形态。A组大鼠因术中为损伤脊髓组织，故未见明显水肿及囊腔征象，后期也未见明显致密胶质瘢痕形成；B组脊髓组织均可见钳夹处脊髓炎性水肿明显，细胞胀大，周围结构模糊，逐渐形成囊腔，胶质细胞生长，后期可见致密瘢痕组织。C组早期炎性水肿情况大致同前，胶质细胞分布稀疏，囊腔逐渐缩小闭合，也未见明显瘢痕组织产生。综上所述，致密胶质瘢痕结构对轴突的再生起着很大的限制作用，而FK1706却可以减少这种瘢痕形成，促进神经再生。
图6 C组术后1d、3d、7d、14d、28d脊髓HE染色结果
4、3组大鼠术后BBB运动功能评分
BBB评分：BBB评分选定每日固定时间，固定人员实施，大鼠情绪平缓，精神舒适，保证测量时不产生偏倚。B组和C组大鼠术后苏醒均出现了明显后肢肌力降低，接近0级。随着时间的推移，肌力有不同程度的增高，后肢肌肉萎缩，C组可逐渐出现前后肢协调运动。总体呈现好转的趋势。A组后肢运动功能无障碍，表明术中操作未误伤脊髓组织。在各时间点，B和C组与A组的评分差异均显著（P<0．05），B和C组相较，其差异在术后前3天不具统计学意义（P>O．05）。在术后第7、14、28天C组明显高于B组（P＜0.05）。并且B组从14d后评分升高幅度渐趋于平缓，而C组的升高幅度仍较明显，结果详见（表2、图7）。此表明尾静脉注射1.0mg/kg的FK1706无法短期内改善脊髓损伤后肢的运动功能障碍，但对于改善大鼠运动能力的潜能较大，随着时间延长，对大鼠的神经功能恢复是有利的。
表2 各组BBB评分结果
图7 各组BBB评分折线图
讨论
为了模拟外伤对脊髓造成的损害，本实验选择的是钳夹型脊髓损伤模型，此模型操作简便，造模成功率高。能够造成不同脊髓平面、不同严重程度的损伤[3]。能很好的模拟脊髓损伤病理生理改变，是目前研究脊髓损伤后相关病理机制常用的模型制作方法。本实验选择雄性SD大鼠，主要是因为相关文献报道，一些性激素对神经轴突的生长有促进作用，如黄体酮[4]，为避免这些因素的影响，本实验选择雄性SD大鼠。造模后脊髓损伤的大鼠均出现排尿困难，因此在术后1周内需人工轻柔按摩下腹部帮助其排尿，注意不能用力过猛，挤破膀胱。
脊髓损伤分原发和继发性脊髓损伤，目前SCI 后抑制轴突再生的主要机制包括轴突生长微环境的改变，主要表现为脊髓损伤后组织周围中存在大量抑制轴突再生的因子。这些因子主要有髓鞘相关糖蛋白（myelin-associated glycoprotein，MAG）、少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte myelin glycoprotein，OMgp）、轴突引导因子及溶血磷脂酸．它们通过Ras 同源基因Rho 相关螺旋卷曲蛋白激酶（Ras homolog gene/a Rho –associated coiled coil-forming protein kinase，Rho-ROCK）信号通路细胞信号途径，作用于轴突的生长锥，导致生长锥塌陷，抑制神经生长[5]。同时继发性脊髓损伤时，各种刺激因素，促使星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞的大量增生，这其实是一种损伤保护机制，但是研究证明胶质瘢痕这种致密结构明显的限制了轴突再生[6]。另外胶质瘢痕本身可分泌生长抑制因子，如硫酸软骨素蛋白多糖（chodroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）目前研究较多，主要通过与生长因子相互作用共同影响轴突再生[7]。
综上所述，脊髓损伤过程中大量轴突再生因子的分泌及抑制胶质瘢痕的形成对轴突再生影响极大，这将为脊髓损伤神经再生治疗提供理论基础。
GAP-43生长相关蛋白-43是一种神经元特异性磷酸化蛋白质，由238个氨基酸组成，具有引导轴突生长及突触发育的作用，与改变细胞形态等密切相关。在神经系统发育过程中表达较高，被认为是轴突生长和突触的形成过程中的分子标记物[8]。成人后，中枢神经系统中GAP-43呈低水平表达，在脊髓损伤突触重建过程中，新发神经末梢中大量分泌GAP-43，去除轴突生长的条件，只要存在突触再生，GAP-43表达也会高水平进行，一旦突触重建完成，GAP-43表达即下降，接近正常时的维持量。因此GAP-43基因是神经再生表达过程中的一个典型特征，可随损伤的情况选择性表达，以适应机体的变化。GAP-43被国际列为研究神经损伤修复中，神经再生及可塑性的首选分子探针[9]。因此在中枢神经系统损伤部位采用一些干预手段促进GAP-43持续上调对中枢神经系统再生有重要意义。而在本实验中尾静脉注射FK1706后损伤脊髓病损区域GAP-43的表达明显升高，且到术后14d仍持续较高水平。单纯损伤组的GAP-43的升高可模拟损伤后未干预状态GAP-43的水平，实验组与单纯损伤组相比仍有显著升高，在第7天达到最高水平，随后逐渐降低，恢复至假手术组的水平，这与GAP-43的基因表达时空性相吻合，综合以上，证实FK1706对脊髓损伤后神经功能的改善与其轴突再生相关。
本实验采取术后第1天，第3天，第7天，第14天，第28天过量水合氯醛麻醉致死大鼠，剪取病损脊髓节段，通过连续性观察脊髓组织HE染色横切片及冠状切片情况，了解病损区的病理形态。A组大鼠因术中为损伤脊髓组织，故未见明显水肿及囊腔征象，后期也未见明显致密胶质瘢痕形成；B组脊髓组织均可见钳夹处脊髓炎性水肿明显，细胞胀大，周围结构模糊，逐渐形成囊腔，胶质细胞生长，后期可见致密瘢痕组织。C组早期炎性水肿情况大致同前，胶质细胞分布稀疏，也未见明显瘢痕组织产生。综上所述，致密胶质瘢痕结构对轴突的再生起着很大的限制作用，而FK1706却可以减少这种瘢痕形成，促进神经再生。
以上从微观角度证明了FK1706对轴突再生有一定作用，但如果没有宏观上的症状改善的证据支持，显然验证力度不足，为了能准确评价脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复情况，我们采用了BBB（Basso，Beattie，Bresnahan）行为功能评定量表。此评定量表，操作简便，无需特殊设备，且评分分级精细，分值能比较客观反应大鼠后肢神经功能，特别对运动功能的细微改善也能表现出来，所以此法可以更精确反映大鼠脊髓损伤后运动功能恢复的情况。本实验结果显示假手术组大鼠后肢运动功能正常。FK1706组大鼠后肢运动功能较对照组恢复更快且其恢复时间持续更长，伤后1周，FK1706组大鼠可观察到足掌不负重或部分负重着地步行，伤后2周，FK1706组可观察到部分大鼠足掌持续负重着地步行，时而出现前后肢的协调运动，伤后4周，FK1706组可观察到大部分大鼠足掌持续负重着地步行，前后肢运动更为协调，而相同时段单纯损伤组后肢运动功能恢复较慢且恢复持续时间较短，从伤后2周到伤后4周，单纯损伤组大鼠后肢运动能力恢复不明显，到4周时，只能部分负重步行，罕有四肢协调运动。结合BBB评分结果可见FK1706组评分明显优于单纯损伤组大鼠，且在后期FK1706组评分仍有较大的上升幅度。由这些试验结果可以看出尾静脉注射FK1706能有效促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复。
目前研究FK1706的神经再生机制的文献，国内外都鲜有报道。FK1706作为他克莫司（Tacrolimus，FK506）的一种衍生物，它通过改变他克莫司的免疫抑制效应区，明显弱化免疫抑制作用，保留其促进轴突再生的效应。而对FK506的神经再生机制，目前已有做过一些研究。所以FK1706的神经再生机制研究可以借鉴FK506的研究。FK1706治疗脊髓损伤促进了GAP-43表达显著上调及改善后肢运动能力可能与以下机制有关。有研究表明FK1706经FK506变构后，分子上仍存在能与FK506结合蛋白52（FK506 Binding Protein 52，FKBP52）结合的部位[10]，所以可能存在FK1706-FKBP52复合物，该复合物与胞浆内的钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）结合，并抑制CaN的活性。CaN是受钙离子/钙调素调控的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶，细胞信号传递过程中起脱磷酸化作用，主要分布在神经元胞体和轴突、树突中。作为一种胞内信号蛋白，目前研究发现CaN在中枢神经系统参与了许多神经细胞功能的调节。CaN可直接影响GAP-43的磷酸化，使GAP-43产生增多，活性增强，而达到减轻轴突损伤并促进轴突再生的作用[11]。尚有文献报道神经营养作用可能与诱导损伤部位产生热休克蛋白70（HSP70）增多有关[12]，已经知道，HSP70是一种伴侣蛋白，它可通过对抗应激，保护线粒体以及对凋亡过程进行干扰而抗凋亡，进而促进神经轴突的生长[13]。综合以上，可能是FK1706促进神经再生的部分原因，尚需进一步实验设计加以验证。总之，在脊髓损伤后尾静脉注射FK1706可有效促进脊髓损伤大鼠后肢的运动功能恢复，同时可促进损伤脊髓组织上调GAP-43的表达。
结论
在急性脊髓损伤时，药物FK1706加强 GAP-43基因的表达，减少胶质瘢痕的形成；促进轴突再生，有利于脊髓功能恢复。
参考文献
[1]R. D. Price，T. Yamaji，H. Yamamoto，Y. Higashi，K. Hanaoka，S. Yamazaki，M. Ishiye，I. Aramori，N. Matsuoka，S. Mutoh，T. Yanagihara，B. G. Gold，FK1706，a novel non-immunosuppressive immunophilin：neurotrophic activity and mechanism of action. European journal of pharmacology 509，11-19（2005）.
[2]J. H. Skene，R. D. Jacobson，G. J. Snipes，C. B. McGuire，J. J. Norden，J. A. Freeman，A protein induced during nerve growth（GAP-43）is a major component of growth-cone membranes. Science（New York，N.Y.）233，783-786（1986）.
[3]M. Joshi，M. G. Fehlings，Development and characterization of a novel，graded model of clip compressive spinal cord injury in the mouse：Part 2. Quantitative neuroanatomical assessment and analysis of the relationships between axonal tracts，residual tissue，and locomotor recovery. Journal of neurotrauma 19，191-203（2002）.
[4]N. Hashimoto，H. Yamanaka，T. Mizushima，K. Noguchi，Increased expression of 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase mRNA in dorsal root ganglion neurons of adult rats following peripheral nerve injury. Neuroscience letters 340，45-48（2003）.
论文作者:王帅,徐杰
论文发表刊物:《航空军医》2017年第17期
论文发表时间:2017/11/9
标签：脊髓论文; 损伤论文; 轴突论文; 大鼠论文; 后肢论文; 术后论文; 胶质论文; 《航空军医》2017年第17期论文;