（兰州市第一人民医院）
摘要：目的 探讨不同浓度氧对高糖培养的大鼠肾成纤维细胞（NRK）血管内皮生长因子（VEGF）和色素上皮衍生因子（PEDF）表达的影响。方法 按照常规方法体外培养NRK细胞，同步化后随机分为6组，包括正常对照组、高糖对照组、缺氧对照组、5%氧浓度组、12%氧浓度组、20%氧浓度组。采用半定量RT-PCR测定NRK细胞中VEGF和PEDF的表达变化情况。并用ELISA法检测培养液上清中VEGF与PEDF蛋白水平。结果 ①正常对照组中，VEGF和蛋白有弱表达，PEDF和蛋白有强表达；②高糖组的VEGF表达较正常对照组明显升高，PEDF表达明显下降，且呈时间依赖性；③缺氧对照组VEGF表达较高糖对照组明显升高，PEDF表达下降，且呈时间依赖性；④不同氧浓度组的VEGF表较达正常对照组均明显降低，PEDF表达明显上升，且呈剂量依赖性；⑤不同氧浓度组的VEGF表达较高糖对照组均明显降低，PEDF表达明显上升，且呈剂量依赖性；⑥在不同氧浓度组中，随着时间的延长，VEGF表达逐渐增加，而PEDF表达逐渐减少；比较P＜0.05，差异均具有统计学意义。结论 缺氧会导致高糖培养的NRK细胞中VEGF和PEDF表达失衡，分析其可能是导致糖尿病肾病发病的主要因素之一。
关键词：高糖；大鼠肾；纤维细胞；VEGF；PEDF
糖尿病肾病是糖尿病患者最主要的微血管病变之一，近年来，国内外研究证实[1]，缺氧对高糖体外培养的NRK细胞VEGF有上调作用，对PEDF有下调作用。但对于高氧环境下是否会下调肾组织细胞VEGF的表达并上调PEDF的表达目前还未见报道。基于此，本研究主要选择在体外培养NRK细胞，观察不同氧浓度对高糖培养后NRK细胞VEGF与PEDF及蛋白的表达和变化情况，探讨不同浓度氧对高糖培养的大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响。
1.资料与方法
1.1材料
按照常规方法体外培养NRK细胞，同步化后随机分为6组，包括：正常对照组5.6mmol/L的葡萄糖；高糖对照组15mmol/L葡萄糖；缺氧对照组15mmol/L的葡萄糖＋100μmol/L的CoCl2培养液；5%氧浓度组15mmol/L葡萄糖＋5%氧浓度；12%氧浓度组15mmol/L葡萄糖＋12%氧浓度组；20%氧浓度组30mmol/L葡萄糖＋20%氧浓度组。以上各组分别作用24h、48h后取样观察，每种条件准备3份，实验至少可获得3次可重复性结果。
1.2方法
各实验组培养时的氧浓度分别为5%、12%、20%，5%及12%氧培养用带有二氧化碳和氧气探针的两气孵育箱进行，20%氧培养用二氧化碳孵育箱进行，利用在培养液中加入CoCl2的方法模拟缺氧环境。
1.3观察指标
本实验选择不同浓度高糖加上缺氧及在不同的作用时间下用半定量RT-PCR测定NRK细胞中VEGF和PEDF的表达变化情况。并用ELISA法检测培养液上清中VEGF与PEDF蛋白水平。
1.4统计学方法
本课题研究数据均采用SPSS21.0软件进行分析，仅在P＜0.05时代表差异显著。
2.结果
2.1 NRK细胞中VEGF蛋白含量及PEDF蛋白含量表达情况对比
表1研究数据显示，正常对照组中，VEGF和蛋白有弱表达，PEDF和蛋白有强表达；高糖组的VEGF表达较正常对照组明显升高，PEDF表达明显下降，且呈时间依赖性；缺氧对照组VEGF表达较高糖对照组明显升高，PEDF表达下降，且呈时间依赖性；不同氧浓度组的VEGF表较达正常对照组均明显降低，PEDF表达明显上升，且呈剂量依赖性；不同氧浓度组的VEGF表达较高糖对照组均明显降低，PEDF表达明显上升，且呈剂量依赖性；在不同氧浓度组中，随着时间的延长，VEGF表达逐渐增加，而PEDF表达逐渐减少；比较P＜0.05，差异均具有统计学意义。见下表1、图1、图2、图3。
表1 NRK细胞中VEGF蛋白含量及PEDF蛋白含量表达情况对比（）
图3 不同条件培养24h和48h的ICAM-1mRNA电泳图
3.讨论
近年来我国糖尿病患者发病几率逐年增长，机体长期处于高血糖水平会增强血红蛋白与氧的亲和力，从而引起组织缺氧。在缺氧过程中，易导致机体微循环功能障碍，从而使得肾脏、神经功能等受到一定损伤。蒋晓立[2]等学者研究中曾提出，VEGF和PEDF是咽部新生血管形成促进因子和抑制因子中作用最强的两种因子。认为VEGF和PEDF可保持平衡状态，从而对新生血管的生成造成一定的抑制作用。但当VEGF和PEDF之间失衡时，则会使得糖尿病视网膜形成新生血管。邓浩[3]等研究指出，缺氧诱导的视网膜新生血管小鼠模型中，可发现视网膜细胞产生的抑制性PEDF的量与氧浓度成正相关。
此外，有研究表明，在缺氧条件下 体外培养的大鼠NRK细胞VEGF和PEDF表达失衡，PEDF表达下降的同时VEGF表达增加。本研究中，正常对照组中，VEGFmRNA和蛋白有弱表达，PEDF和蛋白有强表达；高糖组的VEGF表达较正常对照组明显升高，PEDFmRNA表达明显下降，缺氧对照组VEGF表达较高糖对照组明显升高，PEDF表达下降，均呈时间依赖性，且mRNA变化趋势和蛋白定量一致；不同氧浓度组的VEGF表较达正常对照组均明显降低，PEDF表达明显上升，不同氧浓度组的VEGF表达较高糖对照组均明显降低，PEDF表达明显上升，均呈剂量依赖性；在不同氧浓度组中，随着时间的延长，VEGF表达逐渐增加，而PEDF表达逐渐减低；这一结果与李思佳[4]等学者研究结果符合。证实了VEGF、PEDF表达的变化与糖尿病肾脏病变的发病有关。
综上所述，高糖培养的NRK细胞中VEGF和PEDF表达会由于缺氧状态及不同氧浓度状态而发生一定变化，临床中可将VEGF和PEDF的表达作为预防糖尿病肾病发生的主要监测指标。
参考文献
[1]陈洁，陈兴强，符薇薇. 雷帕霉素对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响[J]. 中国免疫学杂志，2017，33（1）：47-51.
[2]蒋晓立，陈学波，吴广宇，et al. VEGF抗体对高糖状态下人肾小球系膜细胞生长、增殖和迁徙的影响[J]. 中国中西医结合肾病杂志，2016，17（3）：215-217.
[3]邓浩，丁振宇，王椿，et al. VEGF对大鼠胰岛瘤细胞增殖、凋亡及胰岛素分泌功能的影响[J]. 四川大学学报（医学版），2016，47（1）：33-38.
[4]李思佳. 1，25（OH）2D3对高糖诱导的牛视网膜血管内皮细胞中表达水平变化及对细胞凋亡水平的影响VEGF[J]. 实用防盲技术，2016，11（3）：115-117.
论文作者:王洁敏,董彦平,蒲华丽,刘婷婷,尹虹（通讯作者）
论文发表刊物:《航空军医》2018年22期
论文发表时间:2019/1/22
标签：浓度论文; 细胞论文; 对照组论文; 蛋白论文; 依赖性论文; 较高论文; 葡萄糖论文; 《航空军医》2018年22期论文;