【摘要】 目的 分析和检测浸润性导管癌细胞(IDC)、乳腺非典型性上皮增生细胞(ADH)及乳腺典型性上皮增生细胞(UDH)中的多个微卫星位点杂合性缺失的模式和频率,讨论乳腺癌疾病发展的杂合性缺失变化规律.方法 选用我院４０例IDC病理标本,３５例ADH 病理标本及３２例UDH 病理标本进行研究分析,所有标本均采用PCR扩增－变性聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染法做LOH 分析,对各自位点的杂合性缺失模式和频率进行分析,并进行各自分析和比较.结果 各组细胞微卫星位点杂合度比较无明显差异P＞０．０５;IDC疾病、ADH 疾病和UDH 疾病在D１７S８５５、D３S１０２９及D３S１４４７这三个位点上均有LOH 频率发生,各组存在显著性差异P＜０．０５;在D３S１０２９位点,属于阳性淋巴结转移状态其LOH 发生频率为６２．５％高于阴性淋巴结转移状态的LOH 发生频率２０％(P＜０．０５).结论 D１７S８５５、D３S１０２９及D３S１４４７这三个位点的LOH 发生频率有可能是乳腺癌发病初期的分子变化模式,D３S１０２９位点的LOH 频率在判定乳腺癌淋巴结向阴性或阳性转移上有很高的价值. 【关键词】 散发性乳腺癌;乳腺增生;微卫星位点;杂合性缺失【中图分类号】Q４９２．７【文献标识码】B 【文章编号】１００８－６３１５(２０１５)１２－１３７０－０１
乳腺增生在临床上是一种多发病及常见病,其发病部位通常是乳腺导管及小叶,或是腺泡上皮等,是一种良性增生[１].而乳腺癌则属于临床上十分常见的恶性肿瘤疾病,其发病率和死亡率逐年上升,为此临床应加强对乳腺癌的诊断和治疗,降低死亡率.临床病理学认为,IDC 疾病是由UDH、ADH 及DCIS(导管原位癌)这三个阶段发展而来,且临床已证实这三种疾病引发IDC 疾病的危险系数逐渐增大,这些均是乳腺癌的癌前病变因子[２].为此本文主要探讨上述三种疾病的多个微卫星位点杂合性缺失的模式和频率,现报告如下.
１ 资料与方法１．１ 一般资料 选用我院４０例IDC病理标本(IDC组),３５例ADH 病理标本(ADH 组)及３２例UDH 病理标本(UDH 组)进行研究分析,所有标本均为女性,其中IDC组中经检验后淋巴结转移呈现阳性的有１３例,２７例呈现阴性.IDC组年龄范围在２０岁~６５岁,ADH 组年龄范围在２１岁~６７岁,UDH 组年龄范围在２２岁~６８岁.
１．２ 方法 先对１０７例标本进行杂合度检测,在对其进行杂合性缺失分析.采用的检测方法是PCR－变性聚丙烯酰胺凝胶电泳－银染法,所使用的PCR 仪是由美国公司提供的,电泳仪是北京公司提供的,凝胶分析系统是由上海公司提供的,试剂是由上海公司提供的常规核酸扩增试剂.具体检验步骤如下:首先是显微切割.将所有石蜡包埋标本进行切片,取１５－２０张左右.使用常规HE方法进行染色之后,采用１０×物镜对切片上的正常细胞和病变细胞进行分离,并将分离出来的乳腺癌细胞或增生细胞分别置于EPP管中,并于４℃保存.同时采用相同的分离方式提取出各组的正常细胞,作为各组DNA 的正常对照.其次是提取DNA.将上述提取出的病变细胞EPP管进行离心,将上层的乙醇抽吸完全后,晾干,加入提前调配好的DNA 提取缓冲液,并放置在５６℃的温水中,当EPP管中的组织细胞完全消化后再取出,再次离心,将上层清澈的部分抽吸后装在PCR管中,并放置在９５℃下保存,作为PCR反应的模板之用.再次是PCR扩增.本研究中所使用的引物系列和微卫星位点信息均由基因数据库提供,详细数据可见表１.
依照２５μl反应体系,先是９５℃预变性４分钟,其次是９５℃变性４５秒,再次是５２~６０℃退火１分钟,然后是７２℃复性１分钟,上述操作持续４５次后,最后经７２℃延伸１０分钟.最后是进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测.取出上述PCR扩增后的产物１０μl混合１０μl的２×甲酰胺上样缓冲液,并经９５℃加热变性及１０分钟的冰上骤冷后使DNA 成单链.最后将其放置在２５０伏电压中电泳４小时后取出银染进行分析.１．３ 评定方式 评定本次杂合性缺失的标准是将某一病例的正常细胞PCR 产物与经８％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果进行比较,若电泳谱表中出现２个条带则为杂合子,并将其当做微卫星位点的LOH 进行分析;若电泳谱表中仅出现１个条带则为纯合子,不用进行LOH 分析.最后将正常组织的电泳条带与杂合子的病理组织相互对比,若某一个等位基因条带的病理祖师相对密度降低５０％以上或是消失的则为LOH,若第一次显示为阳性结果则经两次重复实验均显示为阳性后可排除假阳性.最后采用凝胶分析系统对凝胶结果进行拍照后保存.１．４ 统计学方法 采用SPSS１９．０软件进行数据的统计和分析,用(％)来表示计数资料,以x２ 进行检验,若差异比较P＜０．０５则具有统计学意义.
２ 结果
２．１ 各组细胞微卫星位点杂合度比较 如表２所示,本次抽选４个微卫星位点在各组的杂合度都比较高,其中IDC组的杂合度平均为(７０．１％±２．５％),ADH 组的杂合度平均为(６６．９％±２．６％),UDH 组的杂合度平均为(６４．１％±２．１％),组间比较,无显著性差异P＞０．０５.数据表明,本次研究所选取的位点均满足LOH 分析的要求.
３ 讨论
有研究数据表明,肿瘤细胞的多个微卫星位点的杂合性缺失是肿瘤基因组不稳定的一个标志.在本文研究中的,通过对４个位点进行研究,不同疾病(IDC、ADH 和UDH)其发生LOH 的位点也不尽相同.其中IDC组和ADH 组所有的位点均出现LOH,UDH 组除D１７S５７９位点外,其余３个位点出现LOH,由此可见,乳腺癌疾病越严重其发生变化的微卫星位点数量越多,由此表明IDC疾病的发展与多个遗传基因的累积改变有很大联系.此外,本研究中还发现在D１７S８５５、D３S１０２９及D３S１４４７这三个位点上均有LOH 频率发生,且频率高低名次排序是IDC、ADH、UDH,这与其他研究学者的结论一致[３].研究学者指出,发生淋巴结阴阳性转移也是判定IDC患者肿瘤分期的一个指标.本研究中的D３S１０２９位点,其阳性LOH 频率高于阴性LOH 频率,因此,临床上可将D３S１０２９的LOH 变化规律当做预测乳腺癌转移风险的一个关键指标.参考文献[１] 曹伟,张长乐．胃癌微卫星不稳定研究进展[J]．中国普外基础与临床杂志,２０１３,０７:８２６－８３１．[２] 赵璋,张宁,龙江,张蓓,何肖敏,黄坚．肝细胞癌基因组５q１３．２与８p２３．１ 位点的杂合性缺失分析[J]．肿瘤学杂志,２０１５,０１:３４－３８．[３] 陈诗哲,马天骏,周文琪,李金明,郭艳芳．基因的单核苷酸多态性与乳腺癌关系的研究进展[J]．现代生物医学进展,２０１４,２２:４３８２－４３８５．
论文作者:肖飞 胡波 宋亚锋
论文发表刊物:《中国综合临床》2015年12月供稿
论文发表时间:2016/3/9
标签：位点论文; 乳腺癌论文; 标本论文; 电泳论文; 缺失论文; 频率论文; 细胞论文; 《中国综合临床》2015年12月供稿论文;