U1小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究

王美霞, 金清龙, 潘煜, 王峰, 牛俊奇^[1]2006年在《U1小核核糖核酸嵌合体核酶细胞内抑制丙型肝炎病毒表达的研究》文中指出目的观察以U1小核核糖核酸为靶向基因构建的嵌合体核酶在细胞内抑制丙型肝炎病毒 (HCV)表达的作用。方法通过聚合酶链反应及克隆连接反应,将针对HCV核心区的特异性核酶序列代替了U1小核RNA的部分区域,构建出嵌合体核酶的真核表达载体;将其与带有荧光素酶报告基因的靶基因共转染Huh7细胞系,通过western blot及发光检测仪来判定抑制效率并与相同序列核酶的效率进行比较。结果 U1-嵌合体核酶构建成功;共转染结果显示核酶及嵌合体核酶对HCV表达均有抑制作用,但以嵌合体核酶的效率为高。结论以U1小核核糖核酸作为核酶载体可以增加核酶在细胞内的切割活性。

王美霞, 牛俊奇, 王峰, 田梅梅, 金清龙^[2]2006年在《U_1小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究》文中研究指明U1小核核糖核酸(U1 small nuclear RNA,U2 snRNA．)是只存在于真核细胞核内的一种小分子量的RNA,其生理作用是剪、接细胞核内的RNA前体,使其成为成熟的RNA。我们利用U1在细胞核内定位的特性,构建出U1-核酶嵌合体,观察其在细胞内外对HCV基因组的切割活性,以期为 HCV感染的基因治疗提供一种新的靶向载体。

王美霞^[3]2004年在《U_1小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究》文中研究指明丙型肝炎是当今严重威胁人类健康的疾病之一。世界上约有1%人口感染HCV，我国人口感染率约为3%。其难治的一个重要原因在于极易慢性化（85%以上），其中有20-40%发展为肝硬化、肝功能衰竭甚至肝细胞癌，严重危害了人类健康。 早在1989年Choo等建立了HCV RNA的cDNA文库从而确定了HCV存在以前人类就不断探索着一种能抑制HCV感染的方法。到目前为止。IFN-α被认为是治疗丙肝最有效的药物，但仅有20-30%病人对干扰素治疗获得持久应答；新近用干扰素联合利巴韦林持久应答率也只提高到40%，疗效远不能令人满意。为此，需要找到一种更有效的抗HCV方法。在抗HCV药物的开发筛选中，由于缺乏HCV复制细胞系以及小动物模型，使得这一进程进展缓慢。 基因治疗为HCV感染带来了希望。其中研究的热点之一是核酶用于抗病毒治疗。核酶是一种具有催化作用的小RNA分子，能与特异性RNA以碱基配对方式结合并使其在特定核苷酸部位发生裂解。在所有核酶形式中，锤头样核酶是最小最有特异性的，被研究得也最多。锤头样核酶由催化活性中心（22nt，裂解靶RNA）和两侧的侧翼部分（与靶RNA以碱基配对特异性结合）组成，其识别序列为NUX叁联体，其中N为A，C，U或G中任一碱基，X为A、C或U。反应条件要求在生理温度下，有Mg2+（10mM）存在时。大量的研究工作证实不论在体内或体外核酶确实能特异地切割靶RNA。但在实际应用中人们逐渐发现其不足。例如，由于细胞内RNA各自有特殊定位，病毒RNA在细胞内也是严格地隔室化分布，所以核酶在细胞内与底物不能象在试管内那样自由有效地接触并反应，从而降低了其切割效率；在细胞内环境中核酶活性会发生变化；在体外表达产物众多且具催化活性的核酶在细胞内可能没有活性；且未经修饰的核酶在细胞内和血清中都可能不稳定等。另外，为提高核酶的表达和稳定性所采取的一些策略又会干扰其催化活性。这些原因使得核酶在体内的抗病毒作用受到了极大限制。 要使核酶在体内同样高效地发挥作用必须找到有效的载体。这种载体应该具有下列四种重要性质：①能高水平表达；②具有高度稳定性；③具有活性结构；④在细胞内能正确定位。 存在于真核细胞核中的U1小核核糖核酸（U1snRNA）正是这样一种较为理想的载体。它是一种小分子量RNA，具有酶活性，主要参与核内非均一性RNA（包括mRNA前体）的剪接成熟过程，且只定位于核质中。其序列具有高度保守性（95%）。人类U1snRNA由163nt组成，具有m3G帽和四个茎-环结构。体内每分子U1 snRNA都是与7~8种蛋白质结合成小核核糖核蛋白体（snRNP），以RNP的形式存在和执行功能。到目前为止，人们已成功地利用U1snRNA作载体构建出U1嵌合体核酶（U1-Rz），并成功地在体外或细胞内切割了HIV-1 mRNA前体等。Alessandro Michienzi等在以U1-Rz切割HIV-1实验中得出如下结果：①无论细胞内外U1-Rz对HIV-1 RNA都显示出高效切割活性；②U1-Rz中的U1 snRNA在细胞内能形成U1 snRNP，但效率较野生型U1为低。这两个事实向我们提示：U1嵌合体核酶中U1与核酶二者对对方的活性功能都没有显着影响。 前人的研究中都是针对mRNA前体设计了U1嵌合体核酶。我们设想以HCV作为靶标。因为HCV是RNA病毒，其基因组既可作为模板复制出子代RNA，同时又起mRNA的功能指导翻译病毒蛋白。这样，针对HCV RNA的特异U1-Rz就可在复制和翻译两个水平上抑制病毒。故我们以人类U1 snRNA作载体，将核酶序列替代了它的第叁个茎-环区，构建出U1核酶嵌合体的原核及真核表达载体。选择该区作为替代区域是因为它不影响U1 snRNA在核内的准确定位及核内稳定性。嵌入的核酶序列裂解位点在HCV基因组核心（C）区，第381位之后。HCV的高度易变已成共识，但相对而言，其5’非编码区（5’-NCR）与核心区上游具有相对保守性。所以我们选择C区作靶点，这样可保证所构建U1-Rz对绝大多数HCV毒株有作用。同时，我们以同序列的单独核酶作为对照，以观察二者在细胞内外对HCV RNA切割效率的差异。该试验的作用底物为HCV NCR和部分C区基因，它与荧光素酶基因（luc）构成了融合基因，插入到真核表达载体pCMV/T7中。以luc表达的荧光素酶作为报告基因。先将携带U1-Rz、核酶及HCV基因的质粒pGEM-（U1-Rz）、pGEM-Rz 及pCMV/T7-NCRCΔ-luc在体外转录，其中NCRC△-luc RNA以[α-32P]UTP标记；然后U1-Rz及核酶RNA分别与靶RNA混合，研究不同体积比和作用时间下二者对底物的切割效率，并在二者的效率之间进行比较。经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影发现U1-Rz RNA能较高效地裂解HCV RNA，与相同序列的核酶相比二者之间没有明显差别。二者的切割效率随着作用时间延长、核酶：靶RNA的比例增大而增加。进一步以U1-核酶嵌合体以及核酶的真核表达载体pcDNA3.1（+）U1-Rz、pcDNA3.1（+）Rz分别pCMV/T7-NCRCΔ-luc通过脂质体介导共转染人肝癌细胞Huh7，在转染后48小时刮取细胞，制备细胞裂解液，取上清进行Western Blot及利用荧光素发光检测仪FLX800进行检测，结果发现pCMV/T7-NCRCΔ-luc能够在Huh7中表达荧光素酶，与阳性对照荧光素酶表达载体pGL3相比其产生荧光的量较少，可能是因为前者中荧光素酶的表达受到插

牛俊奇, 王峰, 王美霞, 华瑞, 温小玉^[4]2006年在《丙型病毒性肝炎基因治疗实验研究》文中研究指明目的:分别设计能特异切割HCV基因组的核酶、U_1-嵌合体核酶、10-23脱氧核酶(10-23DNAzyme)及小干涉RNA,以期用于丙型肝炎的基因治疗。方法:(1)设计合成针对HCV RNA基因组非编码区及核心区特定位点的叁种核酶,克隆入质粒载体pGEM并进行体外转录,对HCV基因组进行体外切割;(2)选择其中切割效率最高的核酶与U_1小核核糖核酸构建成嵌合体核酶,观察在细胞水平对HCV RNA的切割效率;(3)设计合成针对HCV 5,-NCR区不同位点的10-23DNAzyme,观察不同镁离子浓度及时间下对HCV的切割效率。结果:核酶及U_1小核核糖核酸嵌合体核酶在细胞水平对HCV RNA均具有切割活性,二者的切割活性基本相等;核酶的切割位点越靠近起始密码子则其切割效率越高;针对HCV基因组设计的小干涉RNA在细胞水平能有效抑HCV的复制和表达。结论:核酶、U1嵌合体核酶、10-23脱氧核酶在细胞水平中都显示了较高效的抗HCV作用,作为有前途的基因治疗药物可以进一步用于动物实验研究。

侯伟, 沃健儿, 刘克洲^[5]2005年在《核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略》文中进行了进一步梳理核酶 (ribozyme)是一类具有催化活性的RNA分子 ,可通过碱基配对特异地与相应的RNA底物结合 ,并在特定的位点切割底物RNA分子。自美国科学家Cech和Altman等发现核酶至今的 2 0多年来 ,人们利用核酶可以特异性地切割靶RNA序列的特点

参考文献：

[1]. U1小核核糖核酸嵌合体核酶细胞内抑制丙型肝炎病毒表达的研究[J]. 王美霞, 金清龙, 潘煜, 王峰, 牛俊奇. 中华肝脏病杂志. 2006

[2]. U_1小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究[C]. 王美霞, 牛俊奇, 王峰, 田梅梅, 金清龙. 2006年浙江省感染病、肝病学术会议论文汇编. 2006

[3]. U_1小核核糖核酸嵌合体核酶靶向抑制HCV表达的研究[D]. 王美霞. 吉林大学. 2004

[4]. 丙型病毒性肝炎基因治疗实验研究[C]. 牛俊奇, 王峰, 王美霞, 华瑞, 温小玉. 增强自主创新能力 促进吉林经济发展——启明杯·吉林省第四届科学技术学术年会论文集（下册）. 2006

[5]. 核酶在抗病毒基因治疗中的设计策略[J]. 侯伟, 沃健儿, 刘克洲. 医学综述. 2005

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