2中南大学湘雅医学院医学检验系 湖南 长沙 410000
一、内容摘要
急性脊髓损伤患者日益增多，大部分急性脊髓损伤患者预后较差，给社会和家庭造成了沉重的负担。急性脊髓损伤基础研究较多，但是目前临床上治疗急性脊髓损伤的手段相对有限。Infliximab单抗能够阻断TNF-α与其受体结合，有效抑制一系列的炎性反应，而与甲基强的松龙的联合应用研究报道较少。本研究探讨不同时期应用Infliximab联合甲基强的松龙治疗SD大鼠急性脊髓损伤，观察其对NF-κB，c-IAP2，caspase3，FADD，TRADD的表达影响。探索Infliximab联合甲基强的松龙联合应用对脊髓损伤的可能保护机制及有效用药时间窗口，为后期的临床应用提供前期基础研究。提高我国急性脊髓损伤治疗水平，有效降低社会和家庭负担。
关键词：Infliximab；甲基强的松龙；急性脊髓损伤；保护机制
二、立项依据
研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义。
三、研究意义
脊髓损伤患者日益增多，据统计，美国每年约有11000例新发的脊髓损伤患者。男性患者占到75%以上，并死亡率极高。脊髓损伤后给家庭和社会带来沉重的负担，但是当前治疗脊髓损伤的方法非常有限。因此，研发新的药物治疗脊髓损伤至关重要。
四、研究方案
1.研究内容
1）急性脊髓损伤模型建立
所有实验和动物手术操作均获得医院动物伦理委员会批准。
本实验采用改良的Allen's 重物坠落打击装置，暴露胸10，打击脊髓，建立SD大鼠剂型脊髓损伤模型。
2）英夫利昔联合加强龙不同干预
急性脊髓损伤（ASCI）模型建立成功后，各实验组立即给予相应的药物治疗。
A:正常对照组不予干预处理；
B:假手术组于相同时间经腹腔给予注射用生理盐水1ml（显露出血约1ml，打击后出血约1ml）；
C:安慰剂治疗组经腹腔给予注射用生理盐水2ml；
D:甲强龙组（甲基强的松龙，30mg/kg；腹腔注射。D1：2小时注射，D2：6小时注射；D3：10小时注射）
E：英夫利昔组（英夫利昔单抗，5mg/kg；E1：2小时注射；E2：6小时注射；E3：10小时注射）
F: 英夫利昔单抗联合甲基强的松龙治疗组（甲基强的松龙，30mg/kg；腹腔注射；分两次给药，共2ml。F1：2小时注射；F2：6小时注射；F3：10小时注射）；
切口每日涂0.5%络合碘一次，用于观察BBB评分的大鼠每天给予青霉素4万u，双后肢交替注射，共给药5天。
2.研究方法
1）建立SD大鼠急性脊髓损伤模型
参照改良Allen’s重物打击法制作急性脊髓损伤（ASCI）动物模型10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉良好后将大鼠俯卧于手术台正中，并固定牢固。背部剃毛备皮后在体表扪及大鼠第12肋与脊柱交点定位T12棘突，以T12棘突为标志向上确定T10棘突位置并划线标记。常规消毒、铺单，以T10棘突为中心，取背部后正中纵行切口，逐层切开，显露T9～T11棘突及椎板及横突，从上至下观察横突基部后方首次出现副突的即为T10横突。去除T10棘突、椎板及T9、T11部分棘突、椎板，显露T9-T11段脊髓。然后将自制的缓冲垫（长为3mm、宽为2mm、厚约1mm的塑料垫片）依照大鼠脊髓背侧的曲度预弯，安置于T10处脊髓背侧，采用改良Allen’s打击装置（见图1）。
2）标本的获取
大鼠在各规定时间点先使用10%水合氯醛溶液腹腔注射行过剂量麻醉。随后取仰卧位，常规备皮消毒后做胸腹联合纵形切口。切开皮下后于左侧胸肋交界处开胸，进入胸腔后迅速打开心包，显露心脏。使用7号钝性空心针头经心尖部插入左心室，并将针头置于主动脉管口处，打开灌注开关。确认灌注液顺畅流入后，将灌注针头固定牢靠。剪开右心耳作为液体流出道，用已于40℃水浴预热的肝素钠溶液约500ml行持续灌注(灌注压为110cmH2O,流速6-7滴/秒)。由肝脏和流出液体颜色判断灌注效果，当肝脏由棕褐变为浅白色且右心耳处流出液体清亮时停止肝素钠灌注并改用4%多聚甲醛缓冲液行组织灌注固定，约15-20分钟(压力、流速同上)，多聚甲醛液灌注量约200ml。随后取出胸10为中心的大鼠胸段脊髓标本，长约1cm，放入4%多聚甲醛缓冲液行后固定过夜。
3）HE染色及观察
将石蜡切片依次按顺序放入二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中浸泡，各5分钟；随后使用0.01M PBS缓冲溶液漂洗切片，5分钟×3次。切片脱蜡水化后使用苏木精液染色30-40秒,自来水洗去苏木精液,1%盐酸乙醇分化1-3秒,自来水洗1-2秒,促蓝液返蓝5-10秒,自来水冲洗1-2秒,然后使用0.5%伊红液染色30-40秒,自来水再次冲洗1-2秒。染色后放入70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇和无水酒精浸泡行梯度酒精脱水，新鲜二甲苯透明，树脂封片。最后使用奥林巴斯光学显微镜观察并采集图像信息。
五、结果
利用荧光显微镜在低倍镜（×50）视野下对脊髓水平横断面进行低倍视野整体观察，随后利用高倍视野(×200)进行拍摄。激发光波长550nm，观察cy3红色荧光；激发光波长480nm，观察FITC荧光；激发光波长340nm，观察DAPI荧光。相同视野分别拍摄后使用IPP 6.0软件将三张照片叠加。
六、讨论
1.TNF-α在脊髓损伤中的作用
脊髓损伤后，TNF-α的水平在1小时内达到峰值。TNF-α是许多细胞因子和生长因子活化的发起者，同样募集许多免疫细胞。干扰级联反应中的一个细胞因子，中断整个级联反应。例如，阻断TNF-α减少IL-6和IL-1β的活性，阻断IL-1β减少IL-6，阻断IL-12和IL-23减少IFN-γ。TNF-α的主角作用，使之成为脊髓损伤和其它炎性疾病有效的作用靶点。足够的证据表明细胞因子之间是相互协同作用，而不是添加剂的作用。例如，协同因子包括IL-1和TNF-α，TNF-α和INF-γ, IL-1β和IL-6。一个新兴的概念是，中枢神经系统中的细胞因子有生理作用和神经调节功能，有助于轴突之间的信号传导，但是超过一定的浓度时出现细胞毒性[1]。
2.英夫利昔
fliximab是一种特异性阻断α肿瘤坏死因子的人鼠嵌合型单克隆抗体，与TNF的转膜受体结合，抑制TNF的生物活性，属于目前可使用的TNF拮抗剂。美国FDA已经批准治疗传统治疗不佳的活动性Crohn疾病，与甲氨蝶呤联合应用治疗中重度内风湿性疾病。最近，有研究表明英夫利昔单抗联合加强龙治疗脊髓损伤存在协同作用[2]。
针对以上问题，并以前期研究基础，通过改变英夫利昔单抗的使用时间，观察其联合加强龙对SD大鼠SCI的治疗效果，获取最佳治疗方案。
参考文献
[1]李晓宁, 吴磊, 覃业校,等. 夹脊电针联合甲基强的松龙对ASCI大鼠脊髓组织NMDA受体亚单位NR1蛋白表达的影响[J]. 针灸临床杂志, 2017, 33(10):64-67+91.
[2]李亚丽, 刘合玉, 夏彬. 减重平板训练联合甲基强的松龙对脊髓损伤大鼠运动功能和脑源性神经营养因子及其受体TrkB表达的影响[J]. 中国康复医学杂志, 2016, 31(8):852-856.
论文作者:沈雄杰1,高戈2, 石婷1
论文发表刊物:《中国医学人文》2019年第09期
论文发表时间:2019/10/31
标签：脊髓论文; 损伤论文; 强的松龙论文; 乙醇论文; 甲基论文; 大鼠论文; 强龙论文; 《中国医学人文》2019年第09期论文;