阴梅云[1]2003年在《阿克拉霉素与顺铂合用对卵巢癌细胞抑制机理研究》文中提出目的 卵巢癌化疗中，顺铂(cisplatin, CDDP)应用普遍，但相关抗药性问题也越来越突出。因此，选择能有效与之配伍的药物是临床探索的问题之一。阿克拉霉素(aclarubicin, ACR)作为拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,topoⅡ)抑制剂之一，在卵巢癌的治疗中使用较少，并且与CDDP合用时相互作用机理尚不明确。为此，本研究通过ACR与CDDP联合用药的体外实验，旨在探讨卵巢癌化疗药物组合，为筛选有效抗肿瘤药物提供依据。材料和方法1材料卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）细胞株引自北京大学人民医院。ACR为深圳万乐药业有限公司产品。CDDP为昆明叁戎金属药业有限公司产品。免疫细胞化学试剂，一抗为鼠抗人topoⅡ抗体（美国Sandcruz公司），辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素化二抗购自武汉博海生物公司。RPMI-1640培养基、噻唑蓝(MTT)、RNA酶、蛋白酶K、中分子量蛋白标准、吖啶橙、嗅乙啶购自华美公司。2 方法2.1 细胞培养和药物作用浓度选择SKOV3细胞以RPMI-1640培养基培养，内含10%新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml，置37℃、5% CO2环境下培养。应用药物的血浆峰浓度(peak serum concentration, PSC)，其中ACR为6μg/ml；CDDP为3μg/ml进行相应实验分组。2.2 MTT方法检测药物对细胞的抑制率取指数生长期细胞，以1×105/ml细胞浓度接种于96孔培养板（100 μl/孔），加入无血清培养液稀释的药物10μl。实验组将ACR的PSC浓度(6μg/ml)分别与CDDP的1/10 PSC(0.3μg/ml)、PSC浓度(3μg/ml)、10×PSC浓度(30μg/ml)合用。同时设对照样品。不同药物及浓度均为3复孔。药物与细胞共同培养至24h， 每孔加<WP=5>入5mg/ml MTT 20μl。继续37°C孵育4小时后，离心吸去上清，加入200μl /孔DMSO终止反应。用酶标仪测570nm波长吸光值(A值)。计算抑制率，按金氏公式分析ACR与CDDP合用对卵巢癌细胞抑制效应。本实验重复2次。2.3 双荧光染色观察凋亡细胞将细胞与药物共同作用24h后，经1500rpm/min离心5分钟，悬浮于磷酸缓冲液中。配制吖啶橙和嗅乙啶各为0.5mg/ml 的混合染液。加荧光染液于细胞悬液内，吹打混匀、滴至载玻片上，置荧光显微镜下观察，每个样品定量计数300个细胞。按公式：凋亡细胞数 / 总细胞数×100%，计算调亡率，用按金氏公式分析实验结果。2.4 克隆抑制率检测 将细胞按1×105/ml浓度接种于培养瓶。细胞进入指数生长期后加入药物，每组均为3个实验瓶。药物与细胞共同孵育24h后，消化细胞，无血清培养液清洗。按1×103/ml细胞加入60mm2培养皿培养。连续培养7天后，0.5%结晶紫染色，镜下计数各组克隆形成数。按公式：（1-克隆形成数 / 接种细胞数）×100%，计算克隆抑制率，按金氏公式分析结果。2.5 DNA提取及电泳药物与细胞共孵育24h。离心收集细胞，加入细胞裂解液，4℃裂解20 min。经RNA酶(50μg/ml)37℃作用1h，蛋白酶K 50℃作用3h。以酚-氯仿法抽提DNA，70%乙醇洗涤后凉干。DNA沉淀溶于20μl TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA)，内含1mg/ml嗅乙啶。行1.5%琼脂糖凝胶电泳。紫外透射仪观察、记录。2.6 蛋白印迹分析topoⅡ表达收集各组细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入200μl预冷细胞裂解液4℃裂解40 min。经蛋白定量后，将10μg样品加入等量上样缓冲液，经10% SDS-PAGE电泳后，用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上。加入一抗，鼠抗人topoⅡ抗体4℃孵育过夜。羊抗鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h。二氨基联苯胺(DAB)显色后分析结果。2.7 免疫细胞化学检测泛素表达<WP=6> 药物作用后离心收集细胞、经4%多聚甲醛固定后，滴至涂有多聚左旋赖氨酸的载片上。用冷0.1M PBS (pH 7.4)冲洗。3%甲醇-过氧化氢室温孵育15 min封闭过氧化物酶。1%Triton X-100，40C过夜。冷PBS冲洗3遍，5min/次。湿盒内10%山羊血清孵育30 min，370C。滴加1:200(0.01M PBS稀释)一抗，小鼠抗人泛素单克隆抗体，于湿盒内40C孵育过夜。其后PBS清洗叁次，5min/次；滴加二抗，羊抗小鼠生物素IgG(1%BSA-PBS稀释)，湿盒内370C温育30 min。PBS冲洗后，滴加1:300稀释(0.01M PBS稀释) HRP标记的亲和素，370C温育40min。滴加DAB显色。苏木精复染，常规脱水、透明、封片、显微镜下观察记录。结 果1 MTT检测结果应用MTT检测可见：ACR单独作用后对卵巢癌抑制率为12.5±1.2%，CDDP单独用药依据作用浓度的不同，0.3μg/ml浓度下抑制率为6.20±3.2%；3μg/ml为23.5±1.2%，30μg/ml为56.3±2.2%，而与ACR共同作用后，其抑制率分别提高为18.5±4.3%、35.7±5.1%、78.2±4.0。以上结果用金氏公式分析两药的合并效应，结果表明，ACR与CDDP具有明显的协同效应。2 双荧光染色观察细胞凋亡将药物与细胞共同作用后，经吖啶橙、嗅乙啶双荧光染色观察可见：正常细胞呈绿色，依据常染色质和异染色质不同，荧光密度有所差异。凋亡细胞或可见凋亡小体，中晚期凋亡细胞呈橘红色或红色、染色质凝集、染色均匀，细胞核变小。计算各组细胞凋亡率，结果表明：ACR和CDDP合用与药物单用相比，细胞凋亡率明显增加。3 药物对细胞克隆抑制率的影响为判断不同药物作用后细胞的生存能
何静[2]2007年在《拓扑异构酶与卵巢癌预后及多药耐药关系的研究》文中研究表明卵巢癌是严重威胁妇女生命和健康的恶性肿瘤。近30年来卵巢癌患者的5年生存率一直徘徊于30%-50%之间,化疗对其总体生存率并无明显改善,这其中的主要原因是由于卵巢癌细胞对化疗产生了耐受性。拓扑异构酶是调节DNA空间构型动态变化的关键性核内酶,其在卵巢组织中的表达与卵巢癌多药耐药及生存预后存在相关性,但是具体机制有待进一步的研究。因此,本课题首先探讨了拓扑异构酶各亚型的表达与卵巢恶性肿瘤预后及耐药的关系,然后通过构建RNA表达载体对其进行生物学行为研究,以期获得拓扑异构酶与卵巢癌多药耐药相关性的直接证据。拓扑异构酶各亚型在卵巢组织中的表达及与临床病理和预后的关系目的:研究拓扑异构酶与卵巢癌预后及耐药的关系。材料和方法:应用RT-PCR方法检测47例卵巢癌,20例良性卵巢肿瘤,20例正常卵巢组织中TopoⅡα,TopoⅡβ和TopoⅠmRNA的表达情况,进行阳性率及半定量的比较,将结果与临床病理资料进行统计学分析,并进行单因素生存分析及Cox回归模型分析。结果:TopoⅡα在卵巢恶性组织及复发卵巢癌患者中高表达;TopoⅡβ在卵巢恶性组织中高表达,并且与患者是否存在远处转移存在相关性;经多因素生存回归分析显示,TopoⅡα还可作为卵巢恶性肿瘤预后的独立因素。结论:拓扑异构酶与卵巢癌预后及耐药密切相关,可作为判断卵巢癌预后和耐药的参考指标。拓扑异构酶RNA表达载体的构建目的:构建TopoⅡαRNA表达载体。材料和方法:采用化学合成法合成了4对siRNA,通过RT-PCR检测其对TopoⅡα的沉默效果,从中筛选出一对沉默效果最好的siRNA,并根据质粒psilencer4.1插入片段的设计要求,合成双链DNA,并同时合成一对无关序列作为阴性对照。经退火,质粒双酶切,连接,转化,筛选阳性克隆,并经测序鉴定,测序成功后经Lipofectamine2000介导转染至高表达TopoⅡα的卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/DDP,经细胞毒性实验筛选出表达重组质粒的细胞株。结果:成功构建了分别表达psilencer4.1-TopoⅡα,psilencer4.1-阴性对照,空psilencer4.1质粒的叁种细胞株。结论:RNA表达载体的成功构建为进一步的基因功能研究奠定了基础。RNA干扰卵巢癌TopoⅡα表达逆转其耐药的体外实验目的:研究拓扑异构酶Ⅱα与卵巢癌耐药的关系及相关机制。材料和方法:分别采用瞬时转染和稳定转染进行RNA干扰实验。通过RT-PCR及WesternBlot检测siRNA对目的基因TopoⅡα的沉默效果,通过法,胞内药物浓度的检测,流式细胞仪检测细胞DNA周期检测转染前后耐药改变情况及可能的耐药机制。结果:瞬时和稳定RNA干扰都能有效的抑制目的基因的表达,转染后SKOV3/DDP耐药指数及胞内药物浓度降低,细胞G_0-M期含量增加,S期含量减少。结论:从体外实验的角度获得了DNA拓扑异构酶与卵巢上皮癌多药耐药相关性直接证据。印证临床观察的结果,即DNA拓扑异构酶在肿瘤细胞的多药耐药中发挥重要的作用。
阴梅云, 阎蕴力, 周娜静, 郑力芬[3]2003年在《阿克拉霉素协同顺铂杀伤卵巢癌细胞中泛素表达》文中指出为探讨泛素在阿克拉霉素(aclarubicin,ACR)协同顺铂(cisplatin,CDDP)杀伤卵巢癌细胞中的作用,应用ACR及CDDP的药物血浆峰浓度,分别及共同作用SKOV3卵巢癌细胞株24h。采用吖啶橙、嗅乙啶双荧光染色观察细胞活率;克隆培养观察克隆形成率,以及免疫细胞化学方法检测泛素表达。结果可见:细胞活率,ACR组为78.3±3.1;CDDP组为70.1±6.6;ACR和CDDP共用组为50.8±3.2(P<0.05)。克隆培养显示,ACR和CDDP共用组能够显着抑制细胞的生存能力。同时,两药共用组细胞内泛素表达水平明显高于药物单用组。以上结果表明:ACR与CDDP合用能够提高对卵巢癌细胞杀伤效果,泛素-蛋白质降解途径在其中发挥重要作用。
王卫华[4]2007年在《NF-Y和Sp1在顺铂上调卵巢癌细胞topoⅡ表达中的作用》文中研究指明目的:卵巢癌因为缺乏有效的早期诊断方法,被发现时往往多为晚期,其死亡率居妇科肿瘤首位。目前,对卵巢癌患者化疗仍是最重要的辅助手段,尤其在晚期卵巢癌治疗中具有极为重要的意义。加之卵巢癌细胞在化疗过程中容易产生耐药,因此寻找更为有效的化疗方案是提高卵巢癌疗效的重要途径。目前多选用顺铂为一线化疗药物,同时由二线化疗药物与之配伍,其中以拓扑异构酶II(topoII)抑制剂最为常用,二者可通过不同的作用机制抑制肿瘤细胞的繁殖[1]。许多研究表明,癌细胞对DNA topoII抑制剂的敏感性依赖于topoIIα的表达,如果癌细胞中topoIIα表达减少,则其对DNA topoII抑制剂的敏感性就减低,且容易产生耐药。在对细胞株和临床样本的观察中发现,耐药细胞中topoIImRNA表达减少、启动子活性降低,转录因子NF-Y和Sp1水平下降。人类topoIIα和β启动子区均含GC盒,及数各个CCAAT盒(ICBs)。NF-Y和Sp1能够分别作用于topoII基因启动子区的ICBs和GC盒,调控topoIIα和β的表达,且同时发现NF-Y和Sp1具有协同作用[2]。阴梅云教授在此前的研究首次发现,CDDP能够上调卵巢癌细胞SKOV3中同工酶α和β的表达,猜想这可能与topoII启动子区转录因子的调节有关。本实验选用顺铂和足叶乙甙合用,通过体外作用于卵巢癌细胞系SKOV3,采用免疫印迹方法观察用药前后肿瘤细胞内转录因子NF-Y和Sp-1的表达,进一步了解CDDP对topoII基因上游调控因素的影响。全面探讨药物作用机理,从而减少耐药性产生,为临床合理配伍用药提供理论依据。方法:1细胞培养卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3为本实验室所冻存。以内含10 %胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100μg·mL-1链霉素、4 mmol·L-1谷氨酰胺及1 mol·L-1 HEPES的RPMI-1640培养液,置37℃、5 % CO2条件下体外培养。2药物浓度选择、试验分组参考药物的血浆峰浓度(PSC),其中CDDP为3μg/ml;VP-16为5μg/ml,进行试验分组。实验组:①CDDP组:分别用CDDP的1/10PSC浓度,PSC浓度,10×PSC浓度作用于细胞。②VP-16+CDDP组:用VP-16的PSC浓度分别与CDDP的上述叁种浓度合用。同时设空白对照组。3核蛋白的抽提及Western blot分析3.1核蛋白的抽提及含量测定取对数生长期细胞,经0.25%胰蛋白酶消化后,加入培养液吹打均匀,以1×105细胞浓度接种于高压过的无菌培养瓶中, 24h后加入药物与细胞共培养。取培养细胞5×106-7个/ml弃去培养液,细胞用预冷的PBS洗涤两遍;加入1ml预冷的PBS,用细胞刮刀将细胞刮下,将此混合液移入1 mL Eppendorf管中,4℃,3 000g离心10min,弃上清。通过两次核裂解法裂解细胞,具体操作步骤参照(核蛋白抽提试剂盒操作步骤)。将最后所得上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白。用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度,分装,-70℃保存,避免反复冻融。3.2 Western blot分析3.2.1上样:各种目的蛋白的测定取其适宜上样量,对NF-Y和Sp1蛋白的测定,分别上样进行Western blot分析。在4℃条件下分别经8%和10%SDS-PAGE凝胶电泳后。根据上样蛋白的分子量并依据预染蛋白分子量Marker切下大小合适的凝胶,并切去凝胶左上角标记凝胶方位。3.2.2转膜:以110 mA恒流状态下,4℃电转移3.0~3.5 h,用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上.3.2.3封闭:转移结束时,取出硝酸纤维素膜(每次取出都要注意分清正反面),在封闭液中4℃过夜。封闭结束后,在TS-1脱色摇床上TPBS洗膜3次,每次10 min,经5%脱脂奶4℃封闭过夜。封闭后加入一抗,兔抗人NF-YA多克隆抗体、兔抗人SP1多克隆抗体, 4°C孵育过夜。同样用TPBS洗膜3次,每次10 min,加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1∶5000)二抗,室温孵育2h。3.2.4显色:反应结束后,取出硝酸纤维素膜,同前,用TPBS洗膜3次,PBS洗膜1次,每次10 min,将膜从PBS液中取出,在滤纸上吸干,置干净小平皿中,用ECL或DAB显色后分析结果。4统计学方法:所有资料均用计算机统计软件SPSS14.0进行统计分析。实验数据以均数±标准差(X±S)表示,组间比较采用单因素方差分析,蛋白印迹试验应用HPIAS-1000系统进行条带峰值面积和光密度定量。判断标准:以P<0.05,为有统计学意义。结果:Western blot分析显示,分别在105 kD和32 kD位置附近出现Sp1和NF-Y的蛋白条带,光密度值分析结果显示(见table2、3):1 NF-Y蛋白的表达:不同浓度顺铂作用后,NF-Y蛋白表达量均明显高于对照组,经统计分析,叁组与对照组相比,差别均有显着性,P<0.01。不同浓度顺铂组间比较,差别有显着性,P<0.01,且随顺铂浓度的增高,NF-Y蛋白的表达依次增强(见Fig1 B)。单用VP-16作用组,NF-Y蛋白的表达则明显低于对照组(1.45±0.12vs 1.99±0.02),差别有显着性,P<0.01。而两药合用的叁组与对照组(1.99±0.02)相比,NF-Y蛋白的表达量略有升高,经统计学处理,差异有显着性,P<0.05。(Fig.1 A B)2 SP1蛋白的表达:不同浓度顺铂作用后,Sp1蛋白表达量均明显高于对照组,差异有显着性,P<0.01。同时发现不同作用浓度的顺铂组间比较, SP1蛋白表达量依次增加,但经统计学分析,只有10CDDP与1/10CDDP组比较,差异有显着性,P<0.05。VP-16作用组与对照组相比,Sp1蛋白于药物作用后表达量有明显降低(0.38±0.03 vs 0.66±0.02),差别有显着性,P<0.01。两药合用的组Sp1蛋白的表达量均有增加,与对照组(0.66±0.02)相比,差异有显着性,P<0.05。(Fig.2 C D)结论:本实验结果表明,CDDP作用后,转录因子NF-Y和Sp1的表达水平增加,进而可能通过NF-Y和Sp1分别与topoIIα和β基因中特定的序列结合,上调SKOV3卵巢癌细胞中topoII同功酶α和β表达,使卵巢癌细胞对topoII抑制剂敏感性增强。结合此前我们研究发现的CDDP对topoII基因下游产物表达的影响,全面探讨药物的作用机理,对减少CDDP的耐药性,提高相关肿瘤的治疗疗效具有参考意义。
叶霈智[5]2006年在《浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究》文中进行了进一步梳理成人AL初治患者约有30%左右难治,CR后仍有60%左右最终复发难治,甚至造血干细胞移植后复发。难治性急性白血病对治疗反应差,诱导缓解率低,复发率高,生存期短,是白血病治疗中的难题,目前仍以联合化疗为主要治疗方法。多药耐药性(MDR)的形成是难治的主要原因。研究MDR现象产生的机制及克服方法是提高白血病疗效的主要途径之一。已被证实具有逆转肿瘤/白血病细胞多药耐药性的化合物、生物制剂和中药很多,但现有逆转剂大多数停留在体外研究阶段,且存在不良反应大、临床疗效不满意等缺点,临床应用受到限制。我科既往MDR相关研究表明,浙贝母生物碱体外具有逆转白血病细胞MDR的生物活性,并能增加急性白血病细胞内抗癌药物浓度。临床预实验显示,常规化疗加用浙贝母粉,治疗组完全缓解率显着高于对照组,对难治及复发白血病患者优势更为明显,且能提高Pgp高表达患者临床疗效。在上述研究基础上,我们在国内首次进行以中药为主,干预围化疗期难治性急性白血病前瞻性随机、双盲、多中心临床研究。严格遵守随机双盲临床研究原则,统一制定临床研究方案和病例观察表,拟定规范的难治性白血病诊断标准;由计算机产生随机排列表划分治疗组和对照组,两组比例为1:1。在使用标准化疗方案的同时,于化疗开始前3天加用颗粒剂,治疗组为浙贝母颗粒,每次1袋(10g),每日3次;对照组为麦芽颗粒,每次1袋(10g),每日3次。除此以外,不加用任何具有逆转白血病多药耐药性的中西药。所有病例均连续服药14天,以标准化疗疗程为一个治疗周期。若一个疗程无效,可随下一周期化疗继续服用颗粒剂,继续观察一个疗程,并记作另一人次。研究者使用统一制定的《浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究》CRF表,参加临床研究者需经过一定的培训,充分了解临床研究方案,严格记录化疗前后各项指标(骨髓及外周原始细胞、外周血象、MDR相关蛋白、安全性指标)和不良事件,判定临床疗效。最终对研究结果分两次揭盲,并进行统计分析。本次研究病例来源于在全国12家医院,为2004年1月～2006年4月间住院患者,共127例(治疗组66例,对照组61例)。研究结果表明:①两组患者性别、年龄、病型、病程等基线资料均衡可比。②疗效结果显示,两组完全缓解(CR)病例分别为26例、占39.4%(治疗组)与15例、占24.6%(对照组);部分缓解(PR)病例分别为24例,占36.4%(治疗组)与17例,占27.9%(对照组);未缓解病例(NR)病例分别为16例,占24.2%(治疗组)与29例,占47.5%(对照组)。两组病例疗效整体比较,经秩和检验,有统计学意义(P<0.05),治疗组优于对照组;两组病例有效性(CR+PR)比较,经χ2检验,具有显着统计学意义(P<0.01),治疗组有效率显着高于对照组(75.8%>52.5%)。③疾病分型与疗效关系分析结果,两组间ALL患者有效性(CR+PR)比较,经χ2检验,具有统计学意义(P<0.05),治疗组高于对照组(92%>60%)。④性别与疗效关系分析结果,治疗组男性患者疗效与对照组相比,经秩和检验,有统计学意义(P<0.05),治疗组疗效优于对照组。⑤病程与疗效关系分析结果,治疗组病程<6个
代聪伟[6]2006年在《紫杉醇作用机理及多药联合对卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用》文中提出目的:紫杉醇(paclitaxel, PTX)是卵巢癌化疗的一线药物,铂类联合PTX已经成为晚期卵巢癌的标准化疗方案。患者无疾病进展生存时间及总生存时间得以改善,但复发和耐药问题依然严重,长期生存率并未提高。最近,寻找一种与PTX、铂类均无交叉耐药且疗效确切的药物与之配伍治疗晚期卵巢癌成为热门研究课题。足叶乙甙(etoposide, VP-16)为拓扑异构酶II(topoisomerase, TopoII)抑制剂,单独用于二线化疗治疗卵巢癌有效率为25%。本实验旨在探讨PTX、顺铂(cisplatin, CDDP)联合应用及加入VP-16后叁药联合对卵巢癌细胞株SKOV3的抑制作用,为临床配伍用药提供理论参考。PTX的抗癌机理除了作用于微管系统外,还与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。从生化水平来看,细胞凋亡的特征与特异性的酶学作用分不开,研究其酶学变化,是认识细胞凋亡的重要途径。其中TopoII和半胱氨酸蛋白酶(caspase)家族的效应酶caspase-3是与细胞凋亡有关的酶类。本文旨在探讨紫杉醇对TopoII和caspase-3的表达有无影响,研究其抗癌机理。方法:1.细胞培养:SKOV3细胞以RPMI-1640培养基培养,内含10%新生牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml,置37℃、5%CO_2环境下培养。2.测定药物的半数抑制浓度(IC_(50)):用对数生长期细胞进行实验。实验组分
参考文献：
[1]. 阿克拉霉素与顺铂合用对卵巢癌细胞抑制机理研究[D]. 阴梅云. 河北医科大学. 2003
[2]. 拓扑异构酶与卵巢癌预后及多药耐药关系的研究[D]. 何静. 广西医科大学. 2007
[3]. 阿克拉霉素协同顺铂杀伤卵巢癌细胞中泛素表达[J]. 阴梅云, 阎蕴力, 周娜静, 郑力芬. 细胞生物学杂志. 2003
[4]. NF-Y和Sp1在顺铂上调卵巢癌细胞topoⅡ表达中的作用[D]. 王卫华. 河北医科大学. 2007
[5]. 浙贝母颗粒逆转急性白血病多药耐药临床研究[D]. 叶霈智. 北京中医药大学. 2006
[6]. 紫杉醇作用机理及多药联合对卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用[D]. 代聪伟. 河北医科大学. 2006
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