李莉1 李刚2(通讯作者) 曹红2 舒欣2 王万志3 胡立立3
（1黔西南州人民医院全科医学科 贵州 兴义 562400）
（2中山大学附属第三医院感染性疾病科 广东 广州 510000）
（3黔西南州人民医院肿瘤科 贵州 兴义 562400）
【摘要】目的：探讨CHB患者肝组织中IL-32与IL-1β、TNF-α细胞因子相关性。方法：收集诊断为CHB的患者，共106例。根据患者肝组织标本，分为轻、中、重度CHB组。收集两院健康人群的正常肝组织标本100例，作为对照组。对比CHB组和对照组IL-32与IL-1β、TNF-α水平；轻、中、重度CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α水平；CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α的相关性。结果：CHB组和对照组IL-32与IL-1β、TNF-α水平比较有差异（P<0.05）；轻、中、重度CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α水平比较有差异（P<0.05）；IL-32与IL-1β、TNF-α均呈正相关，相关性系数分别为0.652、0.687，比较有差异（P<0.05）。结论：CHB患者肝组织中IL-32表达明显高于健康人群，IL-1β、TNF-α细胞因子的过量表达可能与IL-32有关。
【关键词】CHB；肝组织；IL-32；IL-1β；TNF-α
【中图分类号】R512.62 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）20-0111-02
全球有约3.5亿人感染乙肝病毒（hepatitis virus B， HBV）。HBV是一种嗜肝DNA病毒，在肝细胞内复制对肝细胞不直接造成损伤[1]。目前认为机体免疫系统针对病毒及病毒抗原的免疫反应在清除病毒的同时导致肝细胞损伤而发生肝炎。多种细胞因子在HBV感染后表达增高、聚集肝组织，诱导多种免疫细胞分化、成熟、聚集肝组织，导致肝内细胞因子网络活化，引起肝组织损伤，发生病毒性肝炎[2]。目前IL-32、IL-1β、TNF-α炎症因子水平与CHB的关系是研究的热点[3]。因此本文拟CHB患者肝组织中IL-32与IL-1β、TNF-α细胞因子相关性，以了解IL-32在CHB肝损伤发生中的作用，为以炎性因子为靶点的CHB治疗提供依据。
1.资料与方法
1.1 资料
收集广州中山大学附属第三医院感染科和我院2012年10月—2017年9月明确诊断为CHB的患者，共计106例，根据患者肝组织标本，分为40例轻度CHB组、30例中度CHB组、36例重度CHB组。收集两院健康人群的正常肝组织标本100例，作为对照组。CHB组男55例，女51例，平均年龄46.38±13.82岁。对照组男66例，女34例，平均年龄43.25±15.28岁。两组性别和年龄比较无差异。
1.2 入选标准
（1）CHB组确诊有乙肝病毒感染，病史大于3月。（2）所有研究对象临床资料完整，知情同意。
1.3 排除标准
（1）脑、肝、肾等重要脏器功能不全者。（2）严重精神障碍、认知功能障碍者。
1.4 研究方法
测定IL-32与IL-1β、TNF-α指标：
所有研究对象纳入研究后，抽取早餐空腹肘部静脉血。进行实验室检查。（1）用Percoll不连续密度梯度离心分离肝内MNCs：把盛有肝组织的器皿置于冰上，把肝组织剪碎至约1mm3大小，加入预先制冷的1640培养基（含10% FBS）中悬浮，把组织悬浮液过200目不锈钢网，用注射器内芯轻轻研磨，并加入1640培养基（含10% FBS）冲洗，取滤液约40～45ml转入50ml离心管中，550r/min离心3分钟，把上清转入另一个50ml离心管，1500r/min离心10分钟，弃上清，3ml 40% percoll重悬沉淀，缓慢加至3ml 70% percoll分离液上，2400r/min离心20分钟，从40%与70%percoll分界面上小心吸取肝内MNCs细胞，然后洗涤，调整细胞浓度为106/ml。（2）构建IL-32表达载体及IL-32 siRNA载体A构建IL-32表达载体：提取人全基因组DNA，合成扩增IL-32基因片段的引物，PCR扩增IL-32基因，双酶切后连接至pCMV表达载体；菌落PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。B构建IL-32 siRNA载体：在pubmed基因库中获取IL-32编码序列；利用软件设计针对IL-32基因序列的siRNA序列；合成siRNA序列并插入pGenesil-1表达载体；菌落PCR鉴定、酶切鉴定、测序鉴定。（3）IL-32表达载体及IL-32 siRNA载体分别转染MNC细胞，real-time PCR、ELISA分别检测转染前后TNF-α、IL-8、MIP-2、IL-1β、IL-6等细胞因子的表达水平。
1.5 观察指标
对比CHB组和对照组IL-32与IL-1β、TNF-α水平；轻、中、重度CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α水平；CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α的相关性。
1.6 统计学
采用SPSS17.0软件，计数资料χ2检验，计量资料t检验或方差分析，P＜0.05为差异有意义。
2.结果
2.1 CHB组和对照组IL-32与IL-1β、TNF-α水平
CHB组和对照组IL-32与IL-1β、TNF-α水平比较有差异（P＜0.05），见表1。
2.3 CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α的相关性
IL-32与IL-1β、TNF-α均呈正相关，相关性系数分别为0.652、0.687，比较有差异（P＜0.05）。
3.讨论
本次研究发现CHB组和对照组IL-32与IL-1β、TNF-α水平比较有差异（P＜0.05），即CHB患者的IL-32、IL-1β及TNF-α水平表达高于健康人群。有文献指出HBV编码的HBx蛋白诱导肝细胞表达IL-32，而且发现CHB患者肝组织中IL-32表达增高，且IL-32表达水平与CHB炎症程度呈正相关，因此推测IL-32在CHB肝损伤发生中起重要作用。同时HBV、HCV、Influenza A等多种病原体均可诱导免疫细胞及非免疫细胞表达IL-32，IL-32通过活化NF-κB和p38 mitogen-activated protein kinase（MAPK）信号通路诱导TNF-α、IL-1β细胞因子表达，在慢性丙型病毒性肝炎（CHC）肝组织炎症及纤维化发生中起重要作用[4]。
本次研究还发现轻、中、重度CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α水平比较有差异（P＜0.05）。即随着CHB损伤的加重，会造成IL-32与IL-1β、TNF-α水平表达的升高，这可能与IL-32、IL-1β、TNF-α参与CHB肝脏损伤有关[5]。TNF-a在细胞免疫和炎症反应中扮演重要的角色[6]。有研究显示TNF-a可激活单核-巨噬细胞释放TNF-a而影响肝脏免疫系统，同时TNF-a表达上升后可使大量炎性细胞粘附于血管内皮，促进肝脏纤维化[7]。IL-1β为急性期炎症指标，可刺激造血细胞和T、B细胞增殖分化，调节宿主对微生物感染的免疫反应[8]。IL-1β水平上升后可以可以促进粘附分子表达上升，引起单核细胞聚集与浸润，促进CHB病情的发展。IL-32是新发现的促炎症细胞因子，肝内细胞因子聚集及活化CHB肝损伤的重要原因。有学者发现CHB患者的病理肝脏组织中IL-32水平为健康人群的1.23倍[9]。基本与本次研究一致。
本次研究发现轻、中、重度CHB患者IL-32与IL-1β、TNF-α水平比较有差异（P＜0.05），即IL-32表达的上升会造成IL-1β、TNF-α表达升高，之间互为因果，互相恶化。因此本文认为CHB患者肝组织中IL-32表达明显高于健康人群，IL-1β、TNF-α细胞因子的过量表达可能与IL-32有关。
【参考文献】
[1]邹勇,郑常龙,杨小安.HBV-ACLF患者外周血和肝脏IL-32的表达水平与肝损伤的相关性[J].新医学,2018,49(02):94-98.
[2]曾明曦,康长明,王琼芳,等.炎症因子IL-32、IL-1β、IL-18及EpCAM在肝细胞肝癌诊断和生存预测中的作用[J].陕西医学杂志,2017,46(12):1672-1673.
[3]梁美莲,陈小燕,张凡,等.IL-32γ活化Akt通路诱导肝星状细胞LX-2表达MMP[J].中华肝脏外科手术学电子杂志,2017,6(04):328-331.
[4]邹美银,章幼奕,朱勇根,等.乙肝病毒相关肝细胞肝癌与IL-32表达相关性研究[J].中华肿瘤防治杂志,2017,24(12):835-838+844.
[5]陈少东,张利敏,王瑶瑶,等.α-干扰素联合柴胡疏肝散治疗慢性乙型肝炎的临床观察及对TNF-α、IL-6的影响[J].中国医院药学杂志,2017,37(17):1716-1720.
[6]郑侠,范启林,许露露,等.TNF-α在D-GalN/LPS诱导急性肝衰竭中的作用研究[J].药学研究,2017,36(07):409-413+431.
[7]刘鑫,白梅荣.蒙药红花对急性肝损伤大鼠TNF-α表达及肝细胞凋亡的影响[J].中国医科大学学报,2017,46(02):116-119.
[8]王传敏,石庆凤,汤守兵,等.乙型肝炎患者血清IL-1β、γ-IFN、HA、LN和PCⅢ在肝炎肝纤维化时水平的变化及其意义[J].临床和实验医学杂志,2015,14(09):718-721.
[9]蔡宗发,邵孔健.炎症相关因子IL-1β、TGF-β及MCP-1在肝细胞肝癌中的表达变化[J].中外医学研究,2017,15(25):60-62.
[9]陈文,王沛明,张祎,等.基于TLR4通路初探黄芩对内毒素血症大鼠肝肺组织中细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-a以及氧化应激因子MDA、SOD水平的影响[J].中药药理与临床,2016,32(03):87-92.
项目名称：贵州省科技计划项目.
项目编号：黔省专合字（2012）113号.
论文作者:李莉1,李刚2(通讯作者),曹红2,舒欣2,王万志3
论文发表刊物:《医药前沿》2018年7月第20期
论文发表时间:2018/7/27
标签：细胞因子论文; 患者论文; 水平论文; 组织论文; 相关性论文; 细胞论文; 损伤论文; 《医药前沿》2018年7月第20期论文;