林密[1]2004年在《羊支原体性肺炎多重PCR病原快速诊断技术与敏感性药物筛选试验研究》文中研究表明本试验从多重PCR病原快速诊断方法和药物肪治等方面对羊肺炎霉形体病进行了研究，为生产上防治该病提供了科学依据。 建立了一种可以同时识别山羊肺炎支原体和绵羊肺炎支原体的多重PCR检测方法。根据这两类病原的16SrRNA保守核酸序列设计了两对引物，用这两对引物对绵羊肺炎霉形体标准株Y98、丝状支原体亚种PG_3、分离物HD株、肺炎霉形体、葡萄球菌、大肠杆菌进行扩增，结果表明标准株Y98、HD株及丝状支原体山羊亚种PG_3均扩增出与预期结果相符的466bp和273bp的片段，具有很好的特异性。该方法能检测到1pg的绵羊肺炎霉形体DNA，10pg的丝状支原体山羊亚种DNA，具有高度的敏感性。该多重PCR检测羊传染性胸膜肺炎的病原方法与直接培养法和血清学诊断方法的结果进行比较，可见多重PCR方法与直接培养法的差异显着，多重PCR比直接培养法更敏感；多重PCR方法与血清学方法的差异不显着，两者敏感性差异无统计学意义。但是从统计结果分析可见，多重PCR方法更适合早期诊断。 测定了环丙沙星，氧氟沙星，单诺沙星，红霉素，罗红霉素，泰勒菌素，泰妙菌素，四环素等8种药物对羊肺炎支原体两个标准株Y98租PG_3及HD株的体外抑菌浓度以及红霉素与氧氟沙星、泰勒菌素和四环素对PG_3和四环素与氧氟沙星、泰勒菌素对Y98的联合药敏作用。结果表明，这8种抗菌药物对PG_3和Y98、HD株的MIC(μg/mL)分别为：环丙沙星0.223，0.00223，0.00327；氧氟沙星0.281，0.0140，0.0104；单诺沙星0.136，0.0140，0.013；红霉素0.0218，无效，无效；罗红霉素0.0327，无效，无效；泰勒菌素0.0771，0.0390，0.13；泰妙菌素0.0417，0.0520，0.091；四环素0.1950，0.0520，0.0520。可见红霉素和罗红霉素是PG_3的高敏药物，而Y98对喹诺酮类药物高度敏感。氧氟沙星与红霉素、四环素对PG_3的联合药敏指数均为1，是相加作用。红霉素与泰勒菌素、四环素对PG_3的联合药敏指数均为1.5，是无关作用。四环素与氧氟沙星、泰勒菌素对Y98的联合药敏试验指数均为0.5，是协同作用；泰勒菌素与氧氟杀星的联合药敏试验指数为1，是相加作用。联合药敏试验结果为进一步开发对氧传染性胸膜肺炎高效、价廉的复方新兽药奠定了基础。 用上述药物进行了预防和治疗试验，结果表明泰妙菌素、单诺杀星可作为绵羊肺炎支原体的首选药物，而红霉素和泰勒菌素可作为山羊肺炎支原体的首选药物。预防剂量是5mg/kg.BW，治疗剂量是10mg/kg.BW，疗程是1—2周。
黄海碧[2]2016年在《绵羊肺炎支原体检测方法的建立及黏附蛋白的研究》文中进行了进一步梳理绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)可感染绵羊和山羊引起传染性胸膜肺炎,以纤维素渗出性肺炎为主要特征,在很多国家和地区都报道有该病原的存在。内蒙古及周边地区是全国的主要养羊区,近年来随着养殖方式的转变,养殖密度大幅增加,该病在这些地区分布和流行的趋势也日益增强,给养羊业带来巨大的经济损失。开展该病防控工作的首要任务是建立准确的诊断方法和研发有效的疫苗,目前关于这方面的工作还不很完善,因此,本研究在对华北部分地区分离的菌株进行了鉴定和分子流行病学调查的基础上,建立了分子水平上的荧光定量PCR检测方法和血清学水平上的间接ELISA诊断方法,并预测了该病原的3个黏附蛋白,对其功能进行了验证,筛选出了优势抗原表位和功能结构域,以期更深入的了解了该病原的致病特性。本研究对分离自华北大部分地区的227株绵羊肺炎支原体进行了实验室传统的分离和鉴定试验及分子生物学鉴定,并分别扩增了16s rDNA、EFTU基因、HSP70基因及16s-23sr DNA。选取其中具有地方代表性的14株菌株,对扩增产物进行了测序,发现利用EFTU基因构建的系统进化树与依据16s rDNA构建的系统进化树标准区别不大,提出EFTU基因可以作为新的分子靶标来分析MO的遗传进化关系和种属鉴别分类,加之其在支原体种间的保守性,建议EFTU基因可以作为MO分子生物学鉴定的特异性基因。在此基础上构建了基于EFTU基因的MO EvaGreen实时荧光定量PCR检测方法,通过试验验证,该方法在特异性、敏感性和稳定性上都优于普通PCR检测方法。根据本实验室基因组测序的注释结果和生物信息学软件分析结果,将预测的黏附蛋白P130、P129和P71按保留完整功能结构域和突变位点的要求共截短表达为9段蛋白。利用大肠杆菌表达系统分别表达9段截短蛋白,重组蛋白纯化后免疫小鼠进行免疫学试验,筛选优势抗原区。结果表明,经P130-3和P71-3段蛋白免疫可以显着提高小鼠的细胞和体液免疫指标,在其它的免疫试验中两者的效果也比较明显。建立了绵羊气管上皮细胞分离鉴定的方法,成功分离到绵羊气管上皮细胞,并在此基础上构建了MO的感染模型,验证了其对气管上皮细胞的黏附能力。应用该模型检测了重组蛋白的黏附能力以及蛋白抗血清对全菌的抑制黏附能力,发现P130-3和P129-2效果比较明显,提示其片段上的结构域在菌体黏附过程中起到重要作用。综合考虑以上试验结果,P130-3的检测性能总体水平比较高,为筛选出的最优截短蛋白。用筛选的性能最优的蛋白P130-3作为诊断抗原,建立了MO的间接ELISA血清学检测方法,并对各反应条件参数进行了优化。最后,比较了建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法、P130-3间接ELISA方法、商品化的间接血凝检测试剂盒以及病原分离培养方法对临床样品检测的敏感性,结果表明,间接ELISA血清学检测方法敏感性最高。
参考文献：
[1]. 羊支原体性肺炎多重PCR病原快速诊断技术与敏感性药物筛选试验研究[D]. 林密. 河北农业大学. 2004
[2]. 绵羊肺炎支原体检测方法的建立及黏附蛋白的研究[D]. 黄海碧. 内蒙古农业大学. 2016