侯幼红[1]1994年在《药物和化学试剂对致病酵母细胞表面疏水性和粘附性的影响》文中研究说明本研究旨在观察某些药物和化学试剂(药剂)对白念球菌(白念)和新生隐球菌的细胞表面疏水性(CSH)的影响，以及CSH与二酵母粘附上皮细胞(培养单层Vero细胞)的关系。以探讨医源性因素(药物等)如何影响致病酵母由寄居转变成致病的过程及其机理，现概括如下。 1、用微生物粘附碳氢化合物法(MATH)和~(?)H掺标放射计数法(RC)分别建立了测定二酵母CSH％及其粘附率的方法。并确定了10~(?)孢子／ml悬液浓度作为测CSH和粘附率的最适酵母浓度。 2、用具有代表性的二十种药剂短时及低浓度作用于白念后，以观察白念的CSH和粘附率变化的关系。结果显示，抗真菌剂二性霉素B(AmB)和氟康唑(FCZ)均致白念粘附率降低，却致CSH降低(AmB)和升高(FCZ)，并伴有随CSH变化的菌壁表层特征性超微形态的可逆改变。氨苄青霉素(AMP)和雌二醇(ESD)对白念粘附无影响。但可致白念发生类似AmB和FCZ所致的CSH变化和相应壁表层形态改变。此外，引起较高CSH变化的化学试剂凝血素(LC)、PHA、岩藻糖(FC)、β—疏基乙醇(β—ME)及胰酶(TP)等却致白念粘附率降低。这些资料提示，药物和化学剂引起白念CSH变化，并不影响白念与上皮细胞的粘附，CSH与粘附不相关(r=-0.0395)，白念CSH交化伴有胞壁表层的可逆性改变。 3、用同样药剂和方法，来观察新生隐球菌的CSH和粘附率变化。结果显示，二种抗真菌剂AmB和FCZ也均使新生隐球菌表现类似白念的相应CSH和粘附率的变化及其随CSH变化的形态改变。AMP却致新生隐球菌的CSH和粘附变化与白念的相应变化不一致，这说明AMP使不同酵母的CSH呈双相改变。ESD致新生隐球菌CSH和粘附的变化与白念相应变化一致，与上述观察同时出现的荚膜丢失，也说明新生隐球菌的荚膜与其CSH和粘附无关。化学试剂PHA、ConA、FC、β—ME及TP均致新生隐球菌的CSH和粘附率降低，而L(?)增加新生隐球菌的粘附。可见，同一药剂作用不同酵母会产生不一致的CSH和粘附的改变，并且荚膜对CSH、粘附及胞壁形态改变不起决定作用。新生隐球菌的CSH与其粘附性不相关(r=-0.0899)。 总之，某些药剂体外作用白念和新生隐球菌可出现不均一性的CSH和粘附性的改变，二酵母CSH对其粘附的影响呈多样性。提示某些药物应用后虽可改变致病酵母的CSH，但并非是引起其粘附性增加的主要或唯一机理。
陈玉洁[2]2015年在《酸马奶源酵母菌代谢物对致病性大肠杆菌的抑菌作用机理研究》文中研究表明酸马奶是一种传统乳制品饮料,能滋养血管、舒缓心情和促进消化。研究表明酸马奶对心血管、消化系统疾病、肺结核、糖尿病、腹泻等有辅助治疗作用。酵母菌是酸马奶中的主要微生物之一,在其代谢过程中会产生具有抑菌作用的物质,如有机酸和毒素蛋白等,而有关酸马奶源酵母菌代谢物在动物上的应用,目前尚无系统的报道。因此,本试验分离筛选了酸马奶中对牛源野生致病性Escherichia coli O8有较强抑菌作用,且能产生较多抑菌物质的酵母菌菌株,并将其纯化培养后,提取得到酵母菌代谢物。研究了酸马奶源酵母菌代谢物对致病性Escherichia coli O8的体外抑菌作用机理和抑菌谱,并研究了其对感染致病性Escherichia coli O8小鼠的体内抑菌和免疫作用机理,为该类酵母菌代谢物的应用提供理论基础。试验一酸马奶源产抑菌物质酵母菌的分离筛选和鉴定分离纯化后,染色法观察酸马奶中酵母菌的形态特征,生化鉴定法鉴定酸马奶中酵母菌的属,牛津杯法筛选产抑菌物质(毒素蛋白)较多的酵母菌,26S rDNA扩增法鉴定该酵母菌的种。结果表明,酸马奶中的酵母菌菌落呈乳白色,直径在0.2～1 mm之间,有放射状真假菌丝。结合生化鉴定,分离出的5株酵母菌,分属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces),酿酒酵母属(Saccharomyces),假丝酵母属(Candida)和白冬酵母属(Leucosporidium)。其中2株酵母菌对致病性Escherichia coli O8有较强的抑菌作用,将其进一步鉴定,该2株酵母菌为马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)试验二酸马奶源酵母菌代谢物的粗提及其抑菌组分测定乙酸乙酯萃取法粗提酵母菌代谢物,高效液相色谱法测定其有机酸组成,试剂盒法测定其毒素蛋白浓度。结果表明,经提取Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae酵母菌得到的4种代谢物分别为K. marxianus pH 2、K. marxianus pH 8、S. cerevisiae pH 2、S. cerevisiae pH8,其主要抑菌组分为有机酸和毒素蛋白。有机酸以丙酸、乳酸和抗坏血酸为主,毒素蛋白含量为68.31～74.99 mg/100g。而且.经提取得到的酵母菌代谢物具有耐热性强,与温度呈负相关和pH耐受性较强的特征。试验三酸马奶源酵母菌代谢物的体外抑菌作用和抑菌谱肉汤稀释法测定Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae酵母菌的4种代谢物对致病性Escherichia coli O8的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。酶标比浊法测定了代谢物对Escherichia coli O8生长曲线的影响,微生物粘附法测定了代谢物对Escherichia coli O8细胞表面疏水性的影响,邻硝基苯β-D-半乳毗喃糖苷法测定了代谢物对Escherichia coli O8细胞膜渗透性的影响,常规方法测定了代谢物对Escherichia coli O8电导率、细胞壁、DNA和RNA大分子物质的影响。并分析了酵母菌代谢物对常见病原菌的抑菌谱。结果表明,K. marxianus pH 2、K. marxianus pH8、S. cerevisiae pH 2、S. cerevisiae pH 8代谢物对Escherichia coli O8的最小抑菌浓度分别为0.025 0、0.100 0、0.025 0、0.025 0 g/mL；最小杀菌浓度分别为0.1000、0.2000、0.1000、0.2000 g/mL。Escherichia coli O8生长曲线呈S形,其细胞表面特性为强碱弱酸性及相对亲水性。该类代谢物能抑制Escherichia coli O8生长,增加Escherichia coli O8细胞表面疏水性和细胞膜渗透性,破坏其细胞膜和细胞壁的完整性,使细胞质外渗,增加菌液中碱性磷酸酶的含量和菌液的电导率。另外,该类酵母菌代谢物具有较广的抑菌谱。试验四酸马奶源酵母菌代谢物的体内抑菌作用一、Escherichia coli O8对小鼠的致病规律选取昆明系小鼠144只,随机分为18组,每组8只,其中9组为对照组,9组为试验组。测定时间分别为0、2、4、8、12、24、36、48、72 h。对照组小鼠注射无菌PBS后采集不同时间点的小肠组织样品；试验组小鼠注射50%致死剂量Escherichia coli O8菌悬液,观察不同时间点小鼠临床症状并采样,常规制备石蜡切片,HE和PAS染色后观察小肠病理切片。结果表明,与对照组相比,试验组小鼠感染Escherichia coliO8后0～72 h之间,小肠绒毛长度、V/C(绒毛长度/隐窝深度)比值、肌层厚度、肠上皮淋巴细胞和杯状细胞数量先减小后增大,隐窝深度先增大后减小注菌后36h小鼠感染最严重,72 h开始恢复。二、防治小鼠感染Escherichia coli O8酸马奶源酵母菌代谢物最优剂量的筛选选取昆明系小鼠150只,随机分为15组,每组10只,分别为空白对照组,阴性对照组,阳性对照组,K. marxianus pH 2、K. marxianus pH 8、S. cerevisiae pH 2、S. cerevisiae pH 8高、中、低剂量组。空白对照组和阴性对照组小鼠灌胃无菌PBS 7 d；阳性对照组小鼠灌胃环丙沙星7 d,剂量为0.13g/kg-bw;K. marxianus pH 2、K. marxianus pH 8、S. cerevisiae pH 2、S. cerevisiae pH 8组小鼠灌胃高、中、低剂量的4种代谢物7 d,分别为10 000、5 000、2 500 mg/kg.bw；除空白对照组外,其他组于第4d注射50%致死剂量的Escherichia coli O8菌悬液。结果表明,K. marxianus pH 2低剂量、K. marxianus pH 8中剂量、S. cerevisiae pH 2低剂量、S. cerevisiae pH 8低剂量小鼠存活率较高,表明低剂量(2 500mg/kg-bw)的酵母菌代谢物为最优灌胃剂量。三、酸马奶源酵母菌代谢物防治小鼠感染Escherichia coli O8的效果选取昆明系小鼠464只,随机分为8组,每组58只。分别为空白对照组,阴性对照组,阳性对照组,蒙药复方组(剂量为25 g/kg-bw),K. marxianus pH 2、K. marxianus pH 8、S. cerevisiae pH 2和S. cerevisiae pH 8组(剂量为2 500mg/kg-bw),处理同前。流式细胞术测定小鼠外周血淋巴细胞及其亚群,ELISA法测定小鼠血清中细胞因子和酶,称重法测定小鼠脏器指数,细胞培养法测定小鼠NK细胞活性,平板涂布法测定小鼠盲肠微生物数量,碳廓清法测定小鼠巨噬细胞吞噬功能,并测定小鼠存活率。结果表明,阴性对照组小鼠注射Escherichia coli O8后,各指标出现不同程度变化,机体盲肠菌群失调,免疫能力降低,抗病力下降。4种酵母菌代谢物组、阳性对照组和蒙药复方组可以不同程度维持小鼠正常盲肠微生物比例,提高机体的免疫机能和存活率。综合得出：酸马奶源酵母菌代谢物对致病性Escherichia coli O8有较好的抑菌效果,能提高感染牛源致病性Escherichia coli (E. coli)O8小鼠的免疫机能和抗病力。
阿琪玛[3]2017年在《厩螫蝇抗菌蛋白提取液对致病性大肠杆菌的抑菌作用机制研究》文中研究指明本研究旨在研究厩螫蝇抗菌蛋白提取液对牛源致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)O1、O2、O8、O78的体外抑菌作用以及对感染致病性E.coli O8小鼠肠黏膜屏障的影响,为厩螫蝇抗菌蛋白提取液对牛源致病性E.coli的体内外抑菌效果提供理论基础。研究包括以下5个方面:(1)采用有机溶剂乙醇、乙酸乙酯、丙酮、氯仿、石油醚对五谷虫进行抑菌物质的提取,发现抗菌肽提取方法有体外抑菌效果,确定提取方法后应用于厩螫蝇。试验结果表明厩螫蝇抗菌蛋白提取液对致病性E.coli O8抑菌圈直径为25.55±0.39mm。提取液蛋白浓度为0.653±0.021mg/mL。(2)研究表明本地区牛源优势致病性E.coli O1、O2、O8和O78对小鼠具有较强的致病性,因此选择4种菌株进行体外抑菌试验。结果表明,厩螫蝇抗菌蛋白提取液对以上致病性E.coli均有破坏细胞膜和细胞壁通透性的作用,在24h内有效抑制细菌的生长,可检测到细胞内的蛋白物质和释放到培养液中的离子,使蛋白含量和电导率升高,从而达到抑菌效果,2种提取液具有较广的抑菌谱。(3)试验分为空白对照组仅灌服生理盐水、阴性对照组注菌并灌胃生理盐水、阳性对照组、厩螫蝇高剂量组、厩螫蝇中剂量组、厩螫蝇低剂量组,连续7d,2次/d,在第5d末期给药后,腹腔注射80%MLD菌液。结果表明,阴性对照组与空白对照组相比,可显著降低小鼠盲肠乳酸菌和双歧杆菌数量,肠球菌和肠杆菌的数量显著升高(P<0.05);使小肠绒毛长度、隐窝深度、小肠绒毛长度/隐窝深度(V/C)值、肌层厚度、淋巴细胞和杯状细胞数量显著降低(P<0.05)。厩螫蝇中剂量组和阳性对照组可以调节肠道菌群结构,对小肠的机械屏障有较好的修复作用,其效果接近于阳性对照组。(4)阴性对照组与空白对照组相比血清IL-2、IL-4、IL-10、Ig A、Ig M、IgG、INF-γ、T3、T4、胰岛素含量显著降低(P<0.05),血清IL-6、IL-8、TNF-α、ACTH、CORT、GH、血糖含量显著升高(P<0.05)。阳性对照组和厩螫蝇中剂量组可以提高被E.coliO8感染小鼠免疫球蛋白、抗炎因子含量,降低促炎因子含量,调节机体血清中各指标平衡,提高机体的抗逆性。阴性对照组与空白对照组相比,免疫脏器指数、NK细胞活性和吞噬细胞吞噬能力显著降低(P<0.05),厩螫蝇中剂量组和阳性对照组可以增加小鼠免疫脏器水平,显著提高NK细胞活性和吞噬细胞的能力(P<0.05)。阴性对照组与空白对照组相比,CD3~+、CD4~+、CD19~+和CD4~+/CD8~+含量显著降低(P<0.05),CD8~+含量显著升高(P<0.05),厩螫蝇抗菌蛋白提取液可以提高感染小鼠CD3~+、CD4~+、CD19~+和CD4~+/CD8~+含量,降低CD8~+含量,厩螫蝇中剂量组和阳性对照组可调节小鼠外周血淋巴亚群含量,减少抑制性T细胞的含量增强机体免疫功能。阴性对照组与空白对照组相比,小肠上清液中IL-2、IL-13、IL-4、IFN-γ、SOD和T-AOC含量显著降低(P<0.05),IL-6、TNF-α和5-OH含量显著升高(P<0.05)。厩螫蝇中剂量组和环丙沙星组可提高感染小鼠IL-2、IL-13、IL-4、IFN-γ、SOD和T-AOC含量(P<0.05),显著降低IL-6、TNF-α和5-OH含量(P<0.05),由此可知,致病性E.coli O8可破坏肠粘膜屏障,厩螫蝇中剂量组效果最佳。(5)通过高通量焦磷酸测序对各处理组致病性E.coli小鼠盲肠中微生物的生物多样性进行研究,结果表明,不同处理之间盲肠微生物的多样性存在显著性差异,不同组间的微生物菌落结构与厩螫蝇抗菌蛋白提取液浓度相关。
宋延君[4]2017年在《ADH1基因与白念珠菌耐药性和致病力的相关性研究》文中提出白念珠菌易于感染、难以防治的主要原因在于其致病机制复杂且耐药现象严重。近年来,国内外研究者陆续发现一些新的基因可能与白念珠菌的致病过程或耐药机制相关,因此,深入研究这些基因的具体功能对进一步了解白念珠菌的致病机理并缓解其耐药现状具有重要意义。目的近年来已有零星报道推测乙醇脱氢酶I(Alcohol dehydrogenase I,adh1p)的编码基因ADH1可能与白念珠菌的致病力和耐药性相关,本课题组前期研究也发现,ADH1基因的表达产物Adh1p可能参与白念珠菌对唑类药物耐药,但这些推论迄今尚无直接证据支持。因此,本课题通过直接敲除白念珠菌ADH1的双等位基因,旨在直接证实ADH1基因是否确实影响菌株自身的致病力及其对药物的敏感性,并初步探讨其对线粒体有氧呼吸的影响,为今后临床上白念珠菌感染的防治及新型抗真菌药物的开发提供了重要的理论依据。方法第一部分:首先采用SAT1-Flipper基因敲除策略构建白念珠菌ADH1基因缺失菌和回复菌,该方法以标准菌SC5314为亲本菌,诺尔斯菌素(nourseothricin,NAT)为筛选标记,pSFS2为载体构建敲除质粒,通过两轮同源重组分别替代目的基因的两条等位基因,并以套式PCR的方法进行鉴定。随后进行菌株生长动力学实验,将亲本菌、基因缺失菌和回复菌分别等浓度培养,在不同的时间点测量各菌株的OD600值,从而绘制各菌株的生长曲线并计算倍增时间。第二部分:分别通过酵母菌微量液基稀释法CLSI M27-A3、M27-S4和琼脂点板实验(Spot assay),观察并测定各菌株对氟康唑(fluconazole,FLC)、伊曲康唑(itraconazole,ITR)、伏立康唑(voriconazole,VRC)、酮康唑(ketoconazole,KCZ)、两性霉素B(amphotericin B,AmB)和卡泊芬净(Caspofungin)等抗真菌药物的最低抑菌浓度(MIC80)和菌落生长情况,以判断ADH1基因的缺失对不同机制抗真菌药物体外敏感性的影响。第三部分:除药物敏感性实验外,本课题同时通过一系列实验从不同层面考察ADH1基因缺失对白念珠菌致病力的影响。(1)菌丝形成实验:分别将各菌株置于四种常用的固体和液体菌丝诱导培养基(Spider、Lee’s、YPD+10%FBS和SLAD)中培养,以考察ADH1基因对菌丝形成能力的影响;(2)生物膜形成实验:采用XTT还原法测定各菌株在RPMI-1640液体培养基中的生物膜形成情况,以考察ADH1基因对生物膜形成能力的影响;(3)体外粘附实验和细胞表面疏水性实验:分别将各菌株置于Spider和YPD液体培养基中培养,以考察ADH1基因对白念珠菌细胞的粘附能力和相对疏水性的影响;(4)实时荧光定量PCR(Real-Time RT PCR)实验:考察并分析目的基因敲除前后菌丝和粘附特异性相关基因ALS1、ALS3、HWP1和CSH1 mRNA水平的表达情况;(5)体内感染实验:分别以小鼠,秀丽隐杆线虫和蜡螟模型作为体内感染模型,考察ADH1基因在不同的体内环境中对菌株致病力的影响。第四部分:分别通过不同的荧光染料试剂盒检测ADH1基因缺失后白念珠菌细胞内线粒体膜电位水平、ATP含量和内源性活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)水平的变化,初步考察ADH1基因对线粒体有氧呼吸的影响。结果第一部分:采用SAT1-Flipper基因敲除策略首先成功构建了白念珠菌ADH1基因缺失菌ADH1M2B(adh1Δ/Δ)和回复菌ADH1ReB(adh1Δ/ADH1)。生长动力学实验结果示,与SC5314和ADH1ReB相比,ADH1M2B在对数生长期的的倍增时间差异不大,且SC5314和ADH1ReB的生长无明显差异,说明ADH1基因敲除后并没有显著限制菌株的生长。第二部分:微量液基稀释法和Spot assay实验结果发现,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1M2B对多种唑类抗真菌药物FLC、ITR、KCZ和VRC,多烯类抗真菌药物AmB和丙烯胺类抗真菌药物卡泊芬净的MIC80表现为无变化或仅降低一个浓度梯度,差异无统计学意义,且菌落生长状态基本无差异,说明ADH1基因缺失后,菌株对上述多种抗真菌药物的敏感性基本无影响。第三部分:菌丝形成实验结果发现,与SC5314比较,ADH1M2B在四种液体或固体菌丝诱导培养基中的菌丝形成能力均显著减弱,在液体培养基中只能形成芽孢或很短的假菌丝且在固体培养基中形成的菌落边缘光滑无放射性菌丝,而当ADH1基因回复时,菌丝的形成能力也得以回复,说明ADH1基因可能是影响白念珠菌菌丝形成的关键基因;生物膜形成实验结果显示,与SC5314比较,ADH1M2B在RPMI-1640液体培养基中生物膜形成能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.05),而ADH1ReB与SC5314的生物膜形成能力相似,差异无统计学意义,由此说明,ADH1基因对白念珠菌生物膜形成起重要作用;体外粘附实验和细胞表面疏水性实验结果示,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1M2B在体外的粘附能力和细胞表面相对疏水性菌显著减弱,说明ADH1基因可显著影响白念珠菌细胞的粘附能力和细胞表面相对疏水性;Real-Time RT PCR实验结果示,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1基因敲除后菌株内重要致病力相关基因ALS1,ALS3,HWP1和CSH1的mRNA表达水平均显著下调,进一步证实ADH1基因与菌丝形成和粘附相关;体内感染实验结果证实,与SC5314和ADH1ReB比较,ADH1基因缺失后,小鼠、秀丽隐杆线虫和蜡螟的生存时间均明显延长,且小鼠的脏器组织负荷菌量显著减少,肾脏病理损伤明显减弱,说明ADH1基因可显著降低白念珠菌体内模型的致病力。第四部分:线粒体能量代谢相关实验结果初步证实,作为白念珠菌无氧酵解关键酶乙醇脱氢酶Ⅰ的编码基因,ADH1缺失对细胞内线粒体有氧氧化有显著影响,具体表现为线粒体膜电位水平和ATP含量均显著降低,内源性活性氧(ROS)水平显著升高。结论本课题通过直接敲除白念珠菌ADH1的双等位基因,并进行一系列表型研究,发现该基因缺失后对多种常见抗真菌药物的敏感性无明显影响,但可显著减弱白念珠菌在体内和体外的致病力,并证实致病力变化与菌株生长动力无关,同时,本实验初步发现作为无氧酵解关键酶的编码基因,ADH1缺失对菌株线粒体有氧呼吸有明显影响,为下一步深入研究其对致病力影响的作用机制是否与线粒体有氧呼吸相关提供新的思路和线索。
参考文献：
[1]. 药物和化学试剂对致病酵母细胞表面疏水性和粘附性的影响[D]. 侯幼红. 中国协和医科大学. 1994
[2]. 酸马奶源酵母菌代谢物对致病性大肠杆菌的抑菌作用机理研究[D]. 陈玉洁. 内蒙古农业大学. 2015
[3]. 厩螫蝇抗菌蛋白提取液对致病性大肠杆菌的抑菌作用机制研究[D]. 阿琪玛. 内蒙古农业大学. 2017
[4]. ADH1基因与白念珠菌耐药性和致病力的相关性研究[D]. 宋延君. 暨南大学. 2017
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