马铁柱[1]2003年在《脑缺血再灌注损伤皮层微血管超微结构及内皮细胞功能变化的实验研究》文中研究表明脑缺血后的再灌注往往引起比缺血本身更为严重的损害。这是因为溶栓治疗血液循环再通后，引起微血管内皮细胞肿胀、坏死，同时内皮细胞功能失调，导致微血管结构、功能紊乱，破坏了血管结构的完整性，加重了脑血流供应障碍，进一步损害正常脑神经功能。所以研究脑缺血再灌注过程中微血管超微结构特征和微血管内皮细胞结构、功能变化与再灌注损伤的关系尤为重要。本实验采用叁血管阻断法，利用大鼠全脑缺血30min再灌注模型检测再灌注后不同时间点血管完整性标记成份、内皮细胞促凝因子的表达变化和微血管超微结构的变化，试图阐明脑缺血再灌注损伤微血管内皮细胞结构、功能变化特点及微血管结构损害变化特征，为缺血性脑血管病的治疗提供依据和方法。 本实验研究将健康雄性SD大鼠随机分为缺血再灌注组和假手术组，采用叁血管阻塞法建立大鼠全脑缺血再灌注模型，用免疫组化SABC法检测大鼠在全脑缺血30min再灌注1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h时FⅧ相关抗原的表达，以标记微血管内皮细胞在脑缺血再灌注过程中损伤变化；同时用原位杂交法测定不同再灌注时间点PAI-1mRNA的表达水平，以观察脑缺血再灌注后微血管内皮细胞纤溶活性的变化规律；同时利用多聚树脂预聚体灌注并选微血管铸型团行扫描电镜观察，探讨脑缺血再灌注后微血管变化特点。实验结果如下： 1、微血管内皮细胞损伤实验结果：FⅧ相关抗原主要在微血管内皮细胞表面表达，在缺血再灌注1h开始下降(P＜0.05，脑缺血再灌注组与假手术组相比)，到24～48h达最低(P＜0.01)，72h表达又开始恢复；脑缺血再灌注组各个时间点的差异具有显着的统计学意义(P＜0.01)；假手术组各个 第，罕’ ＾碌’＊磅伍．＾一 时间点相比差异无统计学意义（P＞0刀5）。 2、PAI－IInRNA原位杂交试验结果：PAI－lmRNA假手术组可见少量 表达，脑缺血再灌注lh表达上调（与假手术组相比P＜005），1224h达高 峰后开始下降（与假手术组相比P＜0．01人72h表达仍高于假手术组（P＜ 0．05）。 3、皮层微血管超微结构实验研究结果：脑缺血再灌注lh血管铸型扫 描电镜下观察即见毛细血管痉挛、狭窄、直径变细；3—48h见毛细血管管壁 不全或完全断裂，出现无血管区。 综上所述，结论如下八1）脑缺血再灌注早期就存在微血管内皮细胞损伤， 进而破坏了微血管的完整性，导致BBB结构受损，使得脑神经元功能受损， 并进一步加重缺血区神经元的损伤。但在脑缺血再灌注超早期组织本身并未 完全出现器质性不可逆变化，相关损伤病理状态存在恢复的可能。G）脑缺血 再灌注可致脑皮层微血管结构损害，由此引起的脑微循环异常是脑缺血再灌 注重要的病理生理变化，改善微循环将有利于脑缺血再灌注的临床治疗。（3） 缺血再灌注后内皮细胞PAI4 高表达提示内皮细胞在缺血再灌注早 期表现为促凝活性，可诱发血管内微血栓形成，加重脑微循环障碍，使得再 灌注后的低灌注进一步加重。
胡艳红[2]2017年在《基于RIP1-RIP3-MLKL信号通路探讨叁七总皂苷对拟缺血再灌注脑微血管内皮细胞Necroptosis的干预作用》文中研究指明近些年,国内外学者发现了一种新的细胞死亡形式"Necroptosis",它是由死亡受体介导的,被一系列信号传导通路所调控的caspase非依赖性的细胞死亡方式,同时具有坏死和凋亡的特征。这种细胞死亡形式最早在小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型中发现,随后多个实验证实necroptosis参与了缺血缺氧造成的脑组织损害。叁七是我国着名的传统中药材,临床广泛应用于缺血性脑卒中的治疗。叁七总皂苷(total saponins ofpanax notoginseseng,PNS)是中药叁七的主要药效组分,前期研究发现叁七总皂苷能明显降低实验性脑缺血大鼠的神经功能评分,减少脑梗死体积,减轻脑水肿,其发挥脑保护的作用与阻抑脑缺血后血管炎症损伤、促进血管修复和保护血管内皮细胞密切相关。因此,在前期实验研究的基础上,本实验利用缺氧缺糖复氧复糖法联合caspase抑制剂z-VAD-FMK干预制备了缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞necroptosis模型;观察了叁七总皂苷对缺血再灌注损伤诱导的脑微血管内皮细胞发生necroptosis及其RIP1-RIP3-MLKL信号通路相关因子表达的影响,以深入揭示叁七总皂昔在脑缺血再灌注损伤中发挥血管内皮保护作用的分子机制。目的:探讨叁七总皂苷对缺血再灌注损伤诱导的脑微血管内皮细胞necroptosis的影响,以及对RIP1-RIP3-MLKL信号转导通路和线粒体损伤的调节作用,以揭示叁七总皂苷在脑缺血再灌注损伤中发挥抗脑微血管内皮细胞necroptosis的分子机制,为叁七总皂苷治疗缺血性脑中风的药理机制提供新的科学诠释。方法:1.缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞necroptosis模型的建立:利用原代培养的大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs),首先采用缺氧缺糖复氧复糖的方法筛选了最佳损伤时间点,制备拟缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)模型。在此基础上利用caspase抑制剂z-VAD-FMK进行干预,分别采用CCK-8检测、透射电镜观察、Annexin V-FITC/PI双染色法进行流式细胞分析,观察造模后细胞的死亡特征,建立necroptosis细胞模型。2.观察叁七总皂苷对缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞necroptosis的影响:将培养传至第3代的大鼠脑微血管内皮细胞随机分成4组:正常组、IRI+z-VAD-FMK组、IRI+z-VAD-FMK+PNS组和IRI+z-VAD-FMK+Nec-1组。除正常组外,其余叁组均按照上述方法进行造模。IRI+z-VAD-FMK+PNS组,细胞在造模前3h和造模过程中给药,叁七总皂苷的给药浓度是22μg/ml。IRI+z-VAD-FMK+Nec-1组,细胞在造模前30min及造模过程中按10μmol/L浓度加入necroptosis特异性阻断剂necstatin-1(Nec-1)。造模及处理结束后,采用CCK-8检测各组细胞活性,透射电镜观察细胞超微结构和形态变化,Annexin V-FITC/PI双染色法利用流式细胞仪检测细胞死亡方式。3.叁七总皂苷对缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞RIP1-RIP3-MLKL信号通路的影响:将传至第3代的大鼠脑微血管内皮细胞和7代以后的人脑微血管内皮细胞随机分成 4 组:正常组、IRI+z-VAD-FMK 组、IRI+z-VAD-FMK+PNS 组和 IRI+z-VAD-FMK+Nec-1组。给药方法同以上。采用荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹(Western Blotting)法检测RIP1-RIP3-MLKL信号通路中RIP1、RIP3、MLKL的mRNA及蛋白磷酸化水平。4.叁七总皂苷对缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞necroptosis线粒体膜电位变化的影响:细胞的分组同上,采用RT-PCR和Western Blotting法检测各组细胞PGAM5、Drp1的mRNA及蛋白表达水平;通过JC-1染色,分别用流式细胞仪和荧光倒置相差显微镜观察各组细胞线粒体膜电位的变化。结果:1.制备了拟缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞necroptosis模型:缺氧缺糖2h复氧复糖8h时,OD值降低明显(P<0.01),细胞损伤明显且损伤主要发生在再灌后4-8h,比较符合缺血再灌注损伤特点,因此确定该时间点作为模拟缺血再灌注损伤的最佳时间点。加入z-VAD-FMK后细胞具有明显坏死细胞特征,necroptosis特异性抑制剂Nec-1可显着降低Q2象限细胞百分比率,提高细胞活性(P<0.05),提示细胞在这一过程中发生了 necroptosis。2.叁七总皂苷可减轻缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞发生necroptosis:与IRI+z-VAD-FMK 组相比,IRI+z-VAD-FMK+PNS 组与 IRI+z-VAD-FMK+Nec-1 组细胞活性明显上升(P<0.01,P<0.01),细胞结构损伤有所改善,细胞核和细胞膜较完整,线粒体损伤改善;Q2象限细胞比率显着降低(P<0.05),Q3象限比率显着升高(P<0.01),具有统计学意义。3.叁七总皂苷对缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞RIP1-RIP3-MLKL信号通路有下调作用:造模后,RIP1-RIP3-MLKL信号转导通路被激活,RIP1、RIP3、MLKLmRNA表达和蛋白磷酸化水平明显升高,与IRI+z-VAD-FMK组相比较,叁七总皂苷能够降低叁种信号因子蛋白磷酸化及mRNA的表达,与Nec-1显示出相似作用。4.叁七总皂苷可降低缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞necroptosis线粒体损伤:造模后,大鼠脑微血管内皮细胞PGAM5、Drp1的mRNA和蛋白表达明显升高,线粒体膜电位下降;与IRI+z-VAD-FMK组相比,IRI+z-VAD-FMK+PNS组和IRI+z-VAD-FMK+Nec-1组细胞PGAM5、Drp1mRNA和蛋白表达均下降,线粒体膜电位上升。结论:1.缺氧缺糖复氧复糖法联合z-VAD-FMK干预后脑微血管内皮细胞的死亡特征符合necroptosis的特点,提示该方法可制备necroptosis模型。2.叁七总皂苷可有效降低上述方法诱导的脑微血管内皮细胞necroptosis的发生,其内在机制与抑制RIP1-RIP3-MLKL信号通路活化,继而下调下游PGAM5、Drp1的表达,减轻线粒体损伤有关,这可能是叁七总皂苷在脑缺血再灌注损伤中发挥血管内皮保护作用的分子机制之一。该结论为中药叁七的"通络"作用提供了现代生物学基础。
周友龙[3]2005年在《脑脉通过老龄大鼠脑缺血再灌注脑微血管再生作用机制研究》文中研究指明背景 脑梗塞是危及老年人生命健康的常见病,是人类致死致残的最主要原因之一,近年来对缺血性脑血管病的病理生理研究进展迅速,从系统水平及分子水平进行了广泛而深入的研究,取得了重大进展。脑缺血自身“代偿性血管再生”,为缺血性脑血管病病理机制研究提供了新的思路,但目前实验研究多根据青年对象的研究结果进行推测,其结论与脑梗塞多发于老龄人群的临床实际相距甚远。老年脑梗塞患者的发病率和死亡率高的原因与其易感性和患病后损伤的严重性密切相关,缺血性中风病理生理机制研究已取得很大的进展,中药治疗缺血性中风有明确疗效,但关于中医药对脑缺血再灌注损伤血管再生方面的研究少见报道,本课题在以前研究的基础上,从细胞、分子、基因水平探讨老龄大鼠缺血再灌注微血管再生机制及中药复方脑脉通对微血管再生的促进作用及其可能的作用机制。 目的 1 从老龄大鼠脑缺血再灌注脑微血管再生揭示老年脑缺血再灌注血管再生机制。 2 通过老龄大鼠血管再生有关方面的研究,探讨老年脑缺血再灌注损伤的病理生理特点。 3 探讨中药脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注促血管再生的作用机制。 4 通过促血管再生作用,评价脑脉通对老年脑缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 1 运用光镜、电镜、免疫组化、原位杂交等技术比较青年和老龄大鼠脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d脑组织含水量、梗死面积、细胞凋亡、脑组织超微结构、微血管数量、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达及其VEGF、VEGFR、TGF-β1mRNA表达。 2 在中医理论指导下,研究中药复方脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注血管再生作用,从VEGF、VEGFR、TGF-β1、bFGF表达及其VEGF、VEGFR、TGF-β1mRNA变化方面研究脑脉通促进血管再生的作用机制。 结果 1 老龄大鼠缺血再灌后脑微血管再生及脑脉通促脑微血管再生作用 ① 神经功能评分:老龄模型组Ⅰ3h、Ⅰ/R6d高于青年模型组相同时点(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠Ⅰ/R1d神经功能评分最高;脑脉通组Ⅰ/R3d、6d、12d低于老龄模型组同时间点(P<0.01);脑脉通组Ⅰ/R6d、12d低于尼莫地平组同时间点(P<0.05)。②脑组织含水量:脑缺血3h老龄大鼠即开始发生明显的水肿,到1d都达到高峰,直到6d以后脑水肿开始明显减轻;脑脉通组Ⅰ/R1d、3d、6d脑组织含水量均低于老龄模型组同时间点(P<0.01,P<0.05)。③梗死面积:老龄模型组Ⅰ3h、Ⅰ/R3d高于青年模型组相同时点(P<0.05,P<0.01),老龄大鼠3d达到高峰,峰值一直持续到6d,老龄大鼠峰值显着高于青年大鼠;脑脉通组各时间点均低于老龄模型组、尼莫地平组同时间点(P<0.05,P<0.01)。④细胞凋亡:老龄模型组与青年模型组相同时间点比较,老龄假手术组、老龄模型组Ⅰ/R3d、6d细胞凋亡数增多(P<0.01)。老龄大鼠细胞凋亡数在3d达到峰值;与老龄模型组相同时间点比较,尼莫地平组和脑脉通组Ⅰ/R1d、3d、6d、12d凋亡细胞数减少(P<0.01);脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注脑微血管再生作用机制研究与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组工/R3d、6d凋亡细胞数减少(P<0.01)。⑤脑细胞的超微结构:模型经脑脉通治疗后3h一3d神经元、胶质细胞、血管内皮细胞超微结构总体变化与老龄模型组无显着变化。但3d以后脑细胞的超微结构病理变化明显减轻,线粒体仅有轻度水肿,峭部分消失,膜部分消失,粗面内质网正常,其余细胞器正常,12d观察细胞质、胞核、细胞器基本正常。⑥脑微血管超微结构变化:脑脉通组大鼠3h一3d血管病理变化不明显,3d以后血管病理改善明显,可见毛细血管周围轻度水肿,吞饮泡减少,微绒毛减少,线粒体轻度水肿,基底膜仅有轻度缺损,局部水肿。到12d血管超微结构基本恢复正常。⑦脑微血管及血管腔面积:与青年模型组同时间点相比,老龄假手术组血管密度增高(P(0.01),老龄模型组I/Rld、3d、6d、12d血管密度及场面积降低(P<0.05,P<o.01),老龄模型组缺血再灌注ld微血管数量达到造模后峰值,3d后又开始下降,持续下降到12d;与老龄模型组比,脑脉通组I3h、I/Rld、3d、12d微血管密度升高(P(0.01),脑脉通组I3h、I/R3d、6d、12d血管场面积增加(P(0.01,P<0.05);与尼莫地平同时间点比较,脑脉通组工/R12d血管数增多(P<0.01),脑脉通组I3h血管场面积增多(P<0.01)。2老龄大鼠脑缺血/再灌注有关促血管再生因子表达及脑脉通的作用 ①VEGF表达变化:与青年模型组大鼠相同时间点比较,老龄模型组I/Rld表达增 强(P<0.01),其余各时间点及老龄假手术组表达均减弱(P<0.01,P<0 .05),老龄组峰 值在ld,3d一6d呈逐渐减弱趋势;脑脉通组I3h、工/R3d、6d、12d表达均高于老龄模型 组相同时间点(P<0 .01);与尼莫地平组相同时间点比较,除脑脉通工/R3d,其余各时间 点表达均增强(P(0.01)。②VEGFR表达变化:与青年组比,老龄模型组I/Rld vEGFR 表达增强(P<0 .01),其余各时间点及老龄假手术组表达均减弱(P<0 .01),老龄模型组 缺血3h开始增强,1d达到峰值,3d一12d逐步上升;脑脉通组各时间点表达均高于老龄模 型组相同时间点(P<0.01);与尼莫地平组相同时间点比较,脑脉通组I3h、I/Rld表达 增强(P<0 .01)
盖聪[4]2014年在《基于PLGF探讨通心络对脑缺血后微血管内皮介导神经元保护的分子机制》文中研究说明脑血管病是导致人类死亡的叁大疾病之一,具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点。其中缺血性脑血管病(Ischemic Cerebral Vascular Disease,ICVD)在世界范围内约占脑血管病的55%～80%,其发病率约是出血性脑血管疾病的3倍。因此,有效地防治缺血性脑血管病一直是医学领域的重要研究课题之一。现代医学对于本病的治疗主要为溶栓及神经元保护两个方面。但迄今仍无公认的具有显着临床疗效的药物,这就迫使我们在缺血性脑血管病的治疗中寻找新出路。随着人们应用中医药对缺血性脑病治疗的不断探索,近年来的研究重点立足于神经血管单元的概念,通过保护血管内皮细胞来减轻脑组织损伤。基于中医络病理论研发的通心络在基础与临床研究中都具有保护缺血区微血管完整性等作用,为脑缺血治疗开辟了一个新途径。而现代研究已发现脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cells,BMEC)的旁分泌功能对神经元的存活有重要调节作用,不同脑微血管内皮细胞条件培养液中的差异蛋白可能是实现其调节作用的物质基础,如胎盘生长因子(Placenta growthfactor,PLGF)对缺氧缺糖神经元有明显的保护作用。本研究以PLGF为切入点,分别从整体和离体研究探讨脑缺血缺氧后在通心络作用下PLGF在脑微血管内皮细胞和脑组织分泌表达的规律及其保护神经元的分子生物学机制,为通心络治疗缺血性脑病提供科学依据。研究目标本研究在"营卫交会、由络以通"理论指导下,以PLGF为切入点,观察通心络对实验性大鼠局灶性脑缺血损伤的保护作用及PLGF表达的影响;探讨脑缺血状态下脑微血管内皮细胞条件液对神经元活性及PLGF含量的影响,进而揭示PLGF保护神经元的分子生物学机制及内皮细胞介导的脑损伤保护环节,围绕神经血管单元探讨通心络干预脑梗死的作用机制,揭示既往提出的"缺血区微血管保护—脑梗死治疗新靶点"的科学内涵,对于指导治疗脑血管疾病的中医药现代化研究具有重要启示。研究方法和内容1.线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞的脑缺血模型。实验动物随机分为假手术组、模型组、通心络组、丁苯酞组(阳性对照药),存活期为1d、3d。各组动物在手术清醒后、术后1d、3d及取材前分别进行神经功能评分,分数越高损伤越重,前后两者比值表示神经功能恢复情况;采用HE染色观察脑组织的病理变化;免疫荧光技术检测MAP-2的表达以观察神经元的变化,确证通心络的疗效和对神经元的保护作用。2.动物分组及存活期同上。免疫组化法检测脑组织中PLGF表达,免疫荧光双标方法(PLGF+CD31、PLGF+MAP-2)分析PLGF在脑血管内皮细胞和神经元的表达规律;酶联免疫吸附法(Elisa法)检测大鼠脑组织匀浆及血清中PLGF的含量,探索脑缺血损伤大鼠脑组织中的PLGF表达部位及细胞类型。3.原代培养脑微血管内皮细胞,采用CCK-8法观察不同浓度通心络含药血清在作用不同时间后对脑微血管内皮细胞活性的影响以确定其给药的最佳浓度和时间。建立体外脑微血管内皮细胞氧糖剥夺模型,采用CCK-8法观察通心络含药血清对体外缺血损伤内皮细胞活性的影响;利用硝酸银还原法检测其上清液中一氧化氮(nitric oxide,NO)、Elisa法检测血管性血友病因子(von Willebrand factor,vWF)、PLGF的含量,分析通心络对脑微血管内皮细胞功能及分泌PLGF的影响。4.原代培养大鼠皮层神经元,采用氧糖剥夺法建立体外神经元缺血模型。收集通心络含药血清干预下脑微血管内皮细胞不同条件液作用于培养的神经元,CCK-8法检测神经元存活率、WST法检测超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、脂质氧化检测法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化,以探索通心络可能通过调节内皮细胞的旁分泌功能保护神经元的机制。5.原代培养大鼠皮层神经元并建立体外神经元缺血模型。在MAPK信号通路阻断剂和PI-3K信号通路阻断剂作用下,CCK-8法检测PLGF干预前后神经元活性及存活率,Tunel法检测神经元凋亡,免疫蛋白印记法检测不同信号通路上相关蛋白Bax、Bcl2和p-ERK1/2的表达变化,进一步从细胞信号转导通路的角度探索PLGF在缺血状态下抑制神经元凋亡的分子生物学机制。结果1.整体实验部分(1)动物造模醒后各组神经功能评分无明显差异;给药后,各时间点通心络组与模型组相比评分降低;将取材前与造模醒后评分的比值进行分析,相对于1d模型组,通心络组的两次评分比值显着下降。相对于3d模型组,通心络组和阳性对照药组的两次评分比值显着下降。(2)HE染色结果显示假手术组脑组织结构完整,细胞排列整齐。模型组缺血侧脑组织皮层组织结构紊乱,神经元细胞核固缩、浓染,部分神经元消失。通心络组各时间点的脑组织病理变化均较模型组有不同程度的减轻,存活神经元数目有所增加,丁苯酞组皮层缺血区的损伤比通心络组严重。(3)假手术组脑组织MAP-2荧光强度高。模型组患侧皮层MAP-2的表达明显减少,尤以梗死区为甚,可见较大范围的弱荧光区;与模型组比较,通心络组大鼠患侧皮层的MAP-2荧光表达强度增加,丁苯酞荧光强度稍有增加。(4)Elisa结果显示PLGF在大鼠缺血脑损伤1d时血清中含量开始显着升高,3d含量更高,大鼠脑组织匀浆中PLGF的表达呈现相同的表达规律;通心络组PLGF在血清及匀浆中的表达均明显高于假手术组和模型组,并随时间延长而增高。(5)免疫组化结果显示PLGF主要表达在缺血半暗带和梗死中心的神经元、血管内皮细胞,脑缺血后血管内皮细胞表达显着增多。双重免疫荧光标记法显示正常状态下PLGF主要表达于神经元,而缺血状态下血管内皮细胞也大量表达PLGF。2.离体实验部分(1)通心络含药血清干预后,10%含药血清作用24h后BMEC活性明显提高即为通心络含药血清最佳浓度及作用时间。体外拟缺血模型组内皮细胞上清液中NO、vWF含量显着升高,而通心络含药血清可明显降低NO、vWF的水平。(2)正常内皮细胞条件培养液对正常神经元和拟缺血损伤神经元的活性无明显影响,但通心络含药血清干预的正常内皮细胞条件培养液对损伤的神经元有明显的保护作用;拟缺血损伤的内皮细胞条件液可使正常和损伤神经元的活性和SOD活力降低、MDA的产生增加,但通心络含药血清干预的拟缺血内皮细胞条件培养液可明显抑制这种降低,并使MDA的产生减少。拟缺血模型组的条件液中PLGF表达显着升高,经过通心络含药血清干预后PLGF较正常组有明显升高。(3)相对于正常对照组,拟缺血损伤神经元(OGD组神经元)的存活率显着下降,凋亡率显着升高,相关凋亡蛋白Bcl-2的表达明显减低而Bax显着升高;与模型组相比,PLGF干预后神经元存活率明显提高,凋亡率显着降低,Bcl-2明显升高而Bax显着降低;与OGD+PLGF组比,MAPK信号通路阻断剂PD98059组神经元存活率明显降低,凋亡率显着升高,Bcl-2明显减低而Bax显着升高,而PI-3K信号通路阻断剂LY294002组细胞存活率等均无明显差异。另一方面,OGD组可明显降低p-ERK1/2表达,PLGF干预后可提高拟缺血神经元p-ERK1/2的表达。结论1.通心络可以促进大鼠脑缺血后神经功能恢复、保护神经元及增加PLGF的表达和分泌量。正常状态下脑组织微血管内皮细胞仅释放少量PLGF,相反,受到缺血刺激而被激活的血管内皮细胞可释放大量的PLGF。故本研究证实了通心络对实验性大鼠局灶性脑缺血模型具有确切可靠的保护作用,并提出这种保护作用可能与PLGF相关。2.本研究首次观察到通心络干预下的脑微血管内皮细胞的旁分泌功能对拟缺血神经元的存活及氧化应激反应有重要的改善作用,并发现通心络干预的脑微血管内皮细胞分泌的PLGF在受到缺血缺氧刺激后会反应性升高。3.PLGF可以提高拟缺血神经元的存活率,本研究首次发现它可降低拟缺血神经元凋亡率及调节凋亡相关蛋白的表达,并发现这种作用与MAPK信号通路相关。总之,通心络治疗脑缺血的新靶点可能是以神经血管单元为核心改善微血管功能以介导脑神经保护的作用,而该作用可能与PLGF相关,PLGF可能通过MAPK信号通路发挥保护神经元的作用。
马铁柱, 涂悦, 张赛, 孙世中[5]2010年在《脑缺血再灌注后皮层微血管超微结构的实验研究》文中进行了进一步梳理目的研究急性脑缺血再灌注后皮层微血管超微结构的动态变化。方法将40只雄性大鼠随机分为假手术组(20只)和脑缺血再灌注组(20只)。采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型,脑缺血1h后再灌注1、3、12、72h取材,复合甲基丙烯酸甲酯脑微血管铸型,制作脑微血管标本,扫描电镜观察正常大鼠脑皮层微血管和急性脑损伤后脑皮层微血管形态学的改变。结果与假手术组相比,脑缺血再灌注后出现皮质的血管受损迹象,随着时间推移,铸型血管可呈"豆芽"状甚至出现完全断裂产生"烛泪"状血管铸型断端,最后,进一步形成皮层无血管区。结论急性脑缺血再灌注后脑皮层微血管结构改变是导致脑微循环障碍的重要原因。
刘希伟[6]2013年在《通心络对急性脑梗死大鼠脑微血管变化的影响》文中认为缺血性脑血管病是现代医学领域中最棘手问题之一,其发病率、致死率和致残率高,严重威胁着患者的生命及其生活质量,同时也给社会造成了巨大的损失,目前对于该疾病的治疗尚无突破性进展。缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作、脑血栓形成和脑栓塞等。现代研究认为,缺血性脑损伤涉及一系列复杂的病理生理变化,包括兴奋性中毒、离子稳态破坏、梗死周边去极化、氧自由基损伤、炎症反应、血脑屏障破坏以及细胞凋亡等机制,它呈现一个时间、空间改变的动态过程。依据供应动脉的分布,脑缺血的局部组织分为缺血中心区和缺血边缘区,在缺血中心区脑血流量急剧下降,缺血边缘区的脑血流量也会有不同程度的降低,离中心区越远脑血流量的降低越不明显。在脑梗死中心区,神经元坏死在数分钟内即可发生；而在缺血半暗带区,因侧枝血管可部分代偿脑血流量的不足,所以脑缺血的严重程度和再灌注的时间窗决定了缺血半暗带残存神经元的预后。近年来,在中医络病理论的指导下,基于王永炎院士提出的“毒损脑络”学说,本课题组取得了大量的研究成果,为了进一步细化病理状态下脑组织结构、功能与脑微环境变化的相关性及其与脑组织细胞相互作用关系,对吴以岭院士提出的“基于微血管病变性疾病的营卫由络以通、交会生化的研究”进行展开,本课题以脑微血管为切入点,采用现代科学技术手段,紧紧围绕“孙络-微血管”病变,寻找营卫“由络以通、交会生化”异常与脑微血管物质-能量-信息紊乱的相关性,对恢复受损机体功能,减低患者的临床死亡率和致残率意义重大。目的1.验证通心络对急性脑梗死大鼠脑功能及形态的影响；2.观察通心络对急性脑梗死大鼠脑微血管结构的影响；3.观察通心络对急性脑梗死大鼠脑微血管再生促进和抑制因子的影响。方法1.通过神经功能评分评价大鼠PMCAO模型复制成功与否并进行分组；通过另一种行为学方法——步态分析系统对大鼠神经功能进行评价；2.通过TTC染色并计算脑梗死体积比的方法来评价大鼠脑形态破坏的程度；3.通过常规HE染色方法在光镜下观察脑组织的一般形态结构变化；4.通过酶联免疫(ELISA)方法和免疫组织化学(IHC)方法观察血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(Ang-1)、胶质酸性纤维蛋白(GFAP)、内皮抑素(ES)四种与脑内微血管再生环境相关的蛋白含量变化,揭示大鼠急性脑梗死后脑内微血管再生的情况；5.观察通心络对以上各环节的影响。结果1.神经功能评分结果：1)将模型组、通心络组、阳性对照药丁苯酞组动物造模醒后、1d、3d神经功能评分进行组间差异比较：造模后各组神经功能无明显差异；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有显着性差异(P<0.01)。2)将模型组、通心络组、阳性对照药丁苯酞组动物按照规定的时间点比较取材前评分与造模醒后评分比值：相对于1d模型组,通心络组的两次评分比值下降,但无统计学差异。相对于3d模型组,通心络组的两次评分比值下降,具有显着差异性(P<0.01)。结果说明,通心络组的神经功能恢复情况优于模型组,且3d更显着。2.步态分析系统结果：1)步伐规律性指数：1d模型组与假手术组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)；给药1d后,通心络组与模型组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)。3d模型组与假手术组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)。2)奔跑时间：1d模型组与假手术组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)。3)右足着地面积：1d模型组与假手术组相比降低,无统计学差异；给药1d后,通心络组与模型组相比升高,无统计学差异。3d模型组与假手术组相比降低,无统计学差异；给药3d后,通心络组与模型组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)。3.脑梗死体积百分比结果：TTC染色后,假手术组大鼠脑切片未见白色梗死灶,模型组、通心络组、阳性对照药丁苯酞组叁组均有不同程度的白色梗死灶出现。与1d、3d模型组相比,通心络组的脑梗死体积百分比均降低,均具有统计学差异(P<0.05)。4.一般形态观察结果：假手术组脑组织灰白质边界基本清楚,皮层区各层细胞分布基本正常,神经细胞形态多样,海马区神经细胞排列整齐；1d、3d模型组,缺血中心区发生肿胀、软化,灰质白质分界不清。皮层顶叶和海马区神经元大量丢失,排列紊乱,神经元出现急性缺血性改变,如皱缩、深染等,胶质细胞增生,小血管闭塞,周围有组织间液积聚。给予通心络治疗后,梗死灶面积与模型组相比明显减小,神经元丢失减少,脑微血管处于开放状态,损伤程度显着降低。5.通过酶联免疫(ELISA)方法检测大鼠急性脑梗死后各组血清和患侧(左侧)脑匀浆中的含量,1)胶质纤维酸性蛋白(GFAP)结果：血清：1d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。脑匀浆：1d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。2)血管内皮生长因子(VEGF)结果：血清：1d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。脑匀浆：1d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3)血管生成素(Ang-1)结果：血清：1d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。脑匀浆：1d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。4)内皮抑素(ES)结果：血清：1d模型组与假手术组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)。3d模型组与假手术组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001);给药3d后,通心络组与模型组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)。脑匀浆：1d模型组与假手术组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比升高,具有显着性差异(P<0.01)。3d模型组与假手术组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)；给药3d后,通心络组与模型组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)。6.通过免疫组织化学法分析大鼠急性脑梗死后各组大脑顶叶皮层区各因子的表达情况,1)GFAP结果：1d模型组与假手术组相比有升高趋势,具有极显着性差异(P<0.001)；给药1d后,通心络组与模型组相比降低,具有显着性差异(P<0.01)。3d模型组与假手术组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有极显着性差异(P<0.001)。2) VEGF结果：1d模型组与假手术组相比升高,具有统计学差异(P<0.05);给药1d后,通心络组与模型组相比有降低趋势,但无统计学差异。3d模型组与假手术组相比有升高趋势,但无统计学差异；给药3d后,通心络组与模型组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)。3)Ang-1结果：1d模型组与假手术组相比升高,但无统计学差异；给药1d后,通心络组与模型组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)。3d模型组与假手术组相比降低,具有统计学差异(P<0.05)；给药3d后,通心络组与模型组相比升高,具有极显着性差异(P<0.001)。4)ES结果：3d模型组与假手术组相比升高,具有统计学差异(P<0.05)；给药3d后,通心络组与模型组相比有降低趋势,但无统计学差异。结论1.急性脑梗死大鼠脑功能和形态明显受损,通心络对其恢复起到了一定的促进作用；2.通心络通过改善急性脑梗死大鼠微血管结构,发挥神经保护作用；3.大鼠急性脑梗死后,通心络可能是通过调节与微血管再生环境中促进和抑制因子的变化,改善缺血半暗带侧枝循环的建立。
魏彦珍[7]2015年在《基于调节α-SMA、CD133的脑脉通对I/R老龄大鼠脑微血管生成的实验与临床研究》文中提出背景脑梗死(cerebral infarction)又称缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke),是各种原因导致脑动脉血流中断,局部脑组织因为缺氧缺血发生坏死,而引起相应神经功能障碍。脑缺血发生后如果能及时在再灌注时间窗内恢复缺血半暗带区的血氧供应,可以为神经及突触再生提供营养,改善患者的神经功能。然而,随着缺血区血液供应的恢复,也可能加重组织损伤和功能障碍,即缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion,I/R)。研究表明,在脑缺血再灌注损伤后,可以启动内源性血管生成机制,建立侧枝循环,适应脑组织缺血缺氧损伤,甚至抵御损伤进一步加重,并促进神经元的恢复,所以,调控内源性血管生成,重建缺血区血管网络,对改善脑部供血和促进神经功能恢复至关重要。血管新生即新生的毛细血管从已存在的血管侧枝中出芽及再塑,是一个复杂的生理病理过程,包括以下几个连续的环节[1]:①EC上的生长因子受体被激活,活化的EC通透性增加,基底膜溶解;②EC增生、迁移并增殖萌芽;③官腔再塑,血管平滑肌细胞、星形胶质细胞等增殖、分化形成成熟的血管腔。EPC是可以直接分化为EC的前体细胞,EPC的数量和功能可以作为反映EC的标志物[2]。本文分为动物实验和临床观察两个部分,首先在前期研究的基础上,建立脑缺血再灌注模型,在中药脑脉通的干预下分别采用α-smooth muscle action(α-SMA)和CD133作为血管平滑肌细胞((vascular smooth muscle cells,VSMC))和血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPS)的标记,来反映大鼠脑缺血后梗死区的血管新生。同时对脑脉通治疗老年脑梗死患者的临床进行评价分析,并检测老年脑梗死患者外周血CD133的表达,探索脑脉通对脑缺血损伤的作用。本课题对深入研究老年患者缺血性脑卒中的病理生理特点,探索中医药治疗缺血性脑卒中的作用途径和在血管生成方面的影响,具有重要的社会意义及医学价值。目的1.以SD大鼠为研究对象,应用线栓法制备局灶性大脑中动脉脑缺血动物模型,观察I/R损伤后青年和老龄大鼠脑缺血(I)3h再灌注(I/R)24h、3d、6d、12d脑血管超微结构变化,并研究脑脉通对老龄大鼠I/R的保护作用;2.通过研究青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠I3h、I/R24h、I/R 3d、I/R 6d、I/R 12d大脑皮质区半暗带微血管α-SMA的表达变化,揭示老龄大鼠I/R脑微血管生成的特点及脑脉通对其影响;3.通过研究青年模型组、老龄模型组、尼莫地平组、脑脉通组大鼠i3h、i/r24h、i/r3d、i/r6d、i/r12d缺血区cd133阳性表达,探索老龄大鼠i/r微血管生成的特点,揭示血管内皮祖细胞与血管再生的关系及脑脉通对其影响;4.通过观察老年脑梗死患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天nhiss量表评分及中医症状量化表评分,研究脑脉通对老年脑缺血患者神经功能的影响;5.通过检测老年脑梗死患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天外周血cd133阳性表达百分比的变化,研究老年脑梗死患者外周血cd133的表达变化及脑脉通对其影响。方法1.采用mca线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,通过电镜观察各组大鼠在脑i/r后不同时间点脑组织超微结构变化,探讨脑脉通对老龄大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织病理改变的影响;2.采用mca线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,运用免疫组织化学方法比较各组大鼠在i3h、i/r1d、i/r3d、i/r6d、i/r12d后大脑皮质区半暗带微血管α-sma的表达变化,研究脑脉通对老龄大鼠i/r微血管α-sma表达变化的影响;3.采用mca线栓法制备大鼠局灶性脑缺血(i)3h再灌注(i/r)24h、3d、6d、12d动物模型,运用免疫组织化学方法比较各组大鼠脑缺血3h再灌注1d、3d、6d、12d后大脑皮质区半暗带cd133表达变化,研究脑脉通对老龄大鼠i/r脑组织cd133表达的影响;4.对入选的72例缺血性脑卒中患者进行临床观察,在常规治疗的基础上,分为脑脉通组和对照组,测各组患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天nhiss量表评分及中医症状量化表评分,研究脑脉通对老年脑缺血患者神经功能的影响;5.用流式细胞仪检测入选患者入院当天、治疗第14天、治疗第28天外周血cd133阳性标记,研究脑脉通对老年脑梗死患者外周血cd133表达的变化的影响。结果1.老龄大鼠脑缺血再灌注后脑组织超微结构的变化及脑脉通对其影响青年假手术组大鼠电镜观察结果示血管基底膜连续完整,内皮细胞形态结构正常,线粒体结构清晰,胞浆内见吞饮小泡;青年模型组可见基膜、线粒体及血管周围不同程度的水肿,在i/r1d、i/r3d程度最重,i/r6d、i/r12d逐渐减轻;老年假手术组微血管周围无明显水肿,线粒体结构基本完整,吞咽小泡减少;老龄模型组可见血管周围、细胞质及线粒体水肿,尤以i/r3d最重;尼莫地平组内皮细胞线粒体水肿,尤以i/r12d最重;脑脉通组可见管周围轻度水肿,内皮细胞线粒体水肿,在i/r12d明显减轻。2.老龄大鼠脑i/rα-sma蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响由实验结果发现:青、老年假手术组均可见α-sma少量阳性表达;青年模型组i/r1d时阳性表达开始上升,i/r6d、i/r12d维持在较高水平;与青年模型组相比较,老龄模型组i3h、i/r1d、i/r3d、i/r12d表达均低于青年模型组(p<0.05,p<0.01);与老龄模型组相同时间点比较,脑脉通组和尼莫地平组α-sma阳性表达都高于老龄模型组(p<0.05)。3.老龄大鼠脑i/rcd133蛋白表达时程变化及脑脉通对其表达的影响由实验结果发现:青、老年假手术组均可见cd133少量阳性表达,在i/r1d时阳性表达开始上升,i/r6d最高,i/r12d开始下降;与青年模型组比较,老龄模型组相同时间点cd133的表达较低,在i/r3d、i/r6d时具有统计学意义(p<0.05,p<0.01);与老龄模型组同时间点相比,尼莫地平及脑脉通组大鼠脑组织cd133阳性表达水平均增高(p<0.05,p<0.01);与尼莫地平组同时间相比,脑脉通组i3h、i/r1d、i/r3d、i/r6d、i/r12d大鼠脑组织cd133阳性表达水平增高,但无统计学意义。4.脑脉通对脑梗死患者nhiss量表评分及中医症状分级量表变化的影响经临床观察发现:与对照组相同时间点比较,治疗14天、治疗28天脑脉通组nhiss量表评分低于对照组(p<0.05.);与对照组相同时间点比较,治疗14天、治疗28天脑脉通组中医症状分级量表评分低于对照组(p<0.05.)。5.脑脉通对老年脑梗死患者外周血cd133的表达时程变化的影响经流失细胞仪检测发现:老年脑梗死患者14d外周血cd133表达最多,并且脑脉通组高于对照组(p<0.01),28dcd133表达较14天降低(p<0.01),仍高于入院当天(p<0.01)。结论1.在遭受相同条件的i/r损伤时,与青年模型组相比,老龄模型组相应时间的大鼠损伤出现较早,损伤较重,恢复慢;与老龄模型组相比,脑脉通组和尼莫地平组脑组织病理损伤程度较轻,尤以脑脉通组大鼠脑组织损伤程度最轻,修复最快,提示脑脉通可明显改善老龄大鼠脑i/r后组织的损伤,并促进神经功能修复;2.老龄大鼠脑i/r损伤后,脑组织内可见微血管生成标记物α-sma蛋白的表达,且随脑i/r时间的延长,表达逐渐增多;与老龄模型组相比,脑脉通组和尼莫地平组相对应时间点α-sma蛋白的表达水平增高,尤以脑脉通组显着,提示脑脉通促进老龄大鼠脑i/r后微血管生成;3.老龄大鼠脑i/r损伤后,脑组织内可见微血管生成标记物cd133蛋白的表达,且随脑i/r时间的延长,表达逐渐增多,i/r12d时开始下降;与老龄模型组相比,脑脉通组和尼莫地平组相对应时间点cd133蛋白的表达水平增高,尤以脑脉通组显着,提示脑脉通促进老龄大鼠脑i/r后微血管生成;4.老年脑缺血患者在发病急性期nhiss量表评分及中医症状分级量化表评分最高,随着脑缺血时间的延长,评分逐渐降低,脑脉通组比较明显,提示脑脉通可以改善老年脑缺血患者神经功能;5.老年脑缺血患者在发病急性期外周血可见CD133表达,在治疗14天阳性表达最高,治疗28天有所下降,脑脉通组比较明显,提示脑脉通可以促进老年患者脑缺血后血管生成。
夏鑫华[8]2007年在《麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠影响的实验研究》文中研究说明脑卒中是当今世界上最重要的致死性疾病之一，中国人群脑卒中发病率、死亡率在总死亡中所占比例，城市为20％，农村为19％。而在脑卒中中，缺血性中风占80％以上。临床上处理脑缺血性损伤的原则是尽早恢复血液再灌注，然而近年来发现，恢复缺血区的血供后，在一定程度上反而更加重了缺血性脑损伤，使脑细胞死亡数量进一步增加，加重病情，这种血流再通后引起的继发性损伤称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury CIRI)，脑缺血再灌注损伤的存在使脑组织的功能障碍和结构损伤更严重，死亡率更高，大大降低了治疗效果，引起世人的广泛关注，成为近年来脑缺血研究的一个热点。脑缺血再灌注损伤是一复杂的病理生理过程，其具体机制目前尚不完全清楚。近年来的研究发现，脑血流中断和再灌注使脑的细胞产生损伤是一个快速的级联反应，这个级联反应包括许多环节，如能量障碍、氧自由基的大量释放、细胞酸中毒、兴奋性氨基酸释放增加、细胞内钙失稳态、自由基生成、凋亡基因激活等。这些环节互为因果，彼此重迭，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。血循环重建后的再灌注性脑损伤日益增多，但目前还没有理想的治疗脑缺血再灌注损伤的药物。导师彭胜权教授根据长期的临床实践，认为脑为元神之府，清窍之所在，脑主神明，临床脑卒中的患者的病机主要是清窍闭阻，气血逆乱，故提出脑卒中的早期治疗应以芳香开窍为主，用药时可以麝香、冰片为主，再结合患者个体差异，辨证论治。麝香可“通诸窍之不利，开经络之壅遏”，是治疗脑病和其它危重疾病的常用药物。冰片亦是开窍醒神的常用药，多用于中风，痰热，神昏窍闭等症，常作辅药或引经药用，与麝香同用，可加强其疗效。基于以往临床与实验研究的成果，本课题从实验研究角度从整体和分子水平全面去探讨麝香配伍冰片抗脑缺血再灌注损伤的机制。拓宽中药防治脑缺血再灌注损伤的思路，为提高中药的临床疗效提供科学依据。1麝冰合剂抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的疗效观察1．1局灶性脑缺血再灌注大鼠模型的复制与评价目的：复制SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并评价效果。方法：通进改良线栓法建立中动脉脑缺血再灌注模型，并对模型进行早期行为学及组织学观察评价。结果：大鼠表现为不同程度的局灶性神经功能障碍，肉眼观察缺血侧大脑组织肿胀明显，光镜下观察脑神经细胞多数神经细胞核固缩，细胞外空隙明显增宽，间质疏松，显示细胞周围及间质水肿。结论：成功复制了MCAO模型。1．2麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学及脑梗死体积影响的实验研究目的：研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学及脑梗死体积的影响。方法：TTC染色法检测脑梗死体积，并比较其神经功能行为积分。结果：脑缺血2h再灌注24h，模型组脑梗死体积显着增大，与假手术组比较有统计学意义(P＜0.01)，神经功能行为积分显着升高(P＜0.01)；麝香配伍冰片组脑梗死体积较模型组缩小(P＜0.01)，同时，麝香冰片组、麝香组大鼠神经功能行为积分下降(P＜0.05)。其中以麝香配伍冰片组作用最明显。结论麝香配伍冰片可减少局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积，改善脑缺血后神经行为症状。1．3麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障通透性的影响目的：研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑含水量及血脑屏障(Blood-brain barrier，BBB)通透性的影响。方法：干湿重法观察脑含水量的变化，通过收集透出脑血管外的伊文思蓝(Evans Blue，EB)来示踪BBB的变化。结果：脑缺血2h再灌注24h，模型组较假手术组脑含水量及EB含量明显增加(P＜0.01)，血脑屏障遭到破坏；麝香配伍冰片组脑含水量较模型组明显降低(P＜0.05)，麝香配伍冰片组及冰片组EB含量较模型组明显降低(P＜0.01)。结论：麝香配伍冰片可有效降低脑缺血再灌注后脑含水量及血脑屏障的通透性，对血脑屏障结构有一定的保护作用。1．4麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元超微结构影响的实验研究目的：研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠神经元及突触超微结构的影响。方法：运用透射电镜观察大脑顶叶皮质神经元超微结构及突触的变化。结果：脑缺血2h再灌注24h，大脑皮层神经元的超微结构形态损坏明显，可见神经细胞缩小，线粒体肿胀，粗面内质网扩张等病变。麝香配伍冰片对大脑皮层神经元有不同程度的保护或修复作用。模型组较假手术组神经毡内突触明显减少(P＜0.01)，典型的突触结构遭到破坏；麝香配伍冰片组突触数量较模型组明显增多(P＜0.05)，突触形态大部分接近正常。结论：麝香配伍冰片可有效防止脑缺血再灌注导致的皮质内突触数量的减少，对神经元及神经元突触超微结构有一定的保护作用。2麝冰合剂抗大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的分子机制研究2．1麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠AQP-4 mRNA表达影响的研究目的：研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织AQP-4 mRNA表达的影响。方法：应用实时荧光定量PCR技术，通过制备TaqMan探针进行测定。结果：与假手术组比较，模型组缺血侧脑组织AQP-4 mRNA表达明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，麝香配伍冰片组、冰片组、缺血侧脑组织AQP-4 mRNA表达明显降低(P＜0.05)。结论：麝香配伍冰片组和冰片组可明显抑制AQP-4 mRNA的表达。2．2麝冰合剂对局灶性脑缺血再灌注大鼠ICAM-1 mRNA表达影响的实验研究目的：研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织ICAM-1 mRNA表达的影响。方法：应用实时荧光定量PCR技术，通过制备TaqMan探针进行测定。结果：与假手术组比较，模型组缺血侧脑组织ICAM-1 mRNA表达量明显增加(P＜0.01)。与模型组比较，各组缺血侧脑组织ICAM-1 mRNA表达均明显降低(P＜0.05～0.01)，其中麝香冰片组下降最明显(P＜0.01)。结论：麝香配伍冰片可抑制脑缺血再灌注后ICAM-1的表达，从而抑制脑缺血再灌注时白细胞与内皮细胞间的粘附，减轻缺血性脑损伤。3本课题的特色和创新性麝香及冰片单味药的基础和临床研究国内外都有着较丰富的资料，但是使用动物实验从整体和分子水平全面系统评价这一药对抗脑缺血再灌注损伤的作用尚属首次。在模型方面我们采用了与临床病人发病情况相类似的SD大鼠MCAO局灶性脑缺血再灌注模型，运用早期行为学及组织学观察评价，通过改良线栓法成功复制了此模型，稳定性、重复性较好。在国内外之前的有关脑缺血再灌注损伤研究中，AQP-4与ICAM-1的传统的检测方法均为RT-PCR方法或免疫组化法，我们首次运用了实时荧光定量PCR检测方法，通过制备AQP-4与ICAM-1基因的TaqMan探针，以重组质粒为模板绘制标准曲线研究麝香配伍冰片对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织脑水肿相关基因AQP-4 mRNA与炎症反应相关基因ICAM-1 mRNA表达的影响，提高了实验的准确度及可信性。
赵光峰[9]2009年在《麝香配伍冰片对缺血再灌注后血脑屏障损伤的影响及机制研究》文中提出缺血性脑水肿是脑血管病伴发的最常见的死亡原因,是脑梗死必然且重要的病理过程,对其机制的研究及防治对策,一直是神经科的研究热点之一。其发病机制的主要环节为血脑屏障(BBB)受损。目前对脑水肿的治疗主要有高渗性脱水剂,利尿剂,糖皮质激素以及外科手术减压等,这些治疗虽然能一定程度减轻脑水肿,但都没有解决其发病机制的主要环节即BBB受损的问题。中药及复方对缺血性脑损伤的治疗具有一定的优势,其药理作用的多靶点、多途径性引起了医学界的广泛重视。而醒脑开窍法作为治疗中风的一种重要方法,虽然近年来广泛应用于临床,但一直未能引起足够的重视。本课题通过文献研究,总结并阐述了缺血性中风急性期使用芳香开窍法的必要性,中医药尤其是麝香和冰片对BBB的作用,脑缺血再灌注后BBB损伤的分子机制。根据导师刘亚敏教授等的工作基础,按线栓法造成大鼠大脑中动脉闭塞,建立局灶性脑缺血再灌注模型,造成缺血性脑水肿,采用电镜、免疫组化、RT-PCR等方法,围绕缺血性脑水肿中血脑屏障(BBB)损伤的主要环节,探讨麝香配伍冰片对脑微血管内皮细胞、基质及胶质细胞足突叁个环节的作用,系统地分析麝香配伍冰片对缺血后BBB损伤的影响,阐明其作用的分子机制。为临床合理应用开窍醒脑法治疗急性缺血性中风提供科学的依据,对临床应用也具有重要的指导意义和应用前景。1文献研究1.1缺血性中风的病机为脑窍痹阻、神机失用,醒脑开窍是缺血性中风的基本治则。醒脑开窍法是中风急性期的重要方法,应及早使用。使用开窍药不仅可醒脑开窍、恢复神机,且可兼顾化痰、活血、息风止痉、清热等,一举多得。开窍法在治疗偏瘫、失语、痴呆等后遗症方面也有一定的优势。1.2中医药对BBB的影响目前研究较广泛,芳香开窍药麝香、冰片广泛应用于神经系统疾病,二者透过BBB迅速,麝香可抑制脑缺血后炎症、抗自由基损伤、减轻脑水肿、增加血流量等,对缺血性神经元有保护作用。冰片可改善BBB的通透性,使其他药物能更快更多地进入中枢神经系统发挥作用。1.3脑缺血再灌注后BBB的超微结构损伤,包括内皮细胞肿胀、吞饮小泡增多、紧密连接开放、基底膜破坏及胶质细胞水肿等。BBB损伤分子机制涉及炎性细胞因子、粘附分子、基质金属蛋白酶、水通道蛋白、自由基、花生四烯酸代谢产物、血管内皮生长因子、纤溶酶、凝血酶等,这些因素相互作用,互为因果。2实验研究2.1麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠病理及BBB超微结构影响的研究目的:通过观察缺血再灌注后大鼠神经元病理及BBB超微结构变化的影响探讨麝香配伍冰片对BBB的保护作用。方法:建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,光镜下观察各组动物神经元病理变化,电镜下观察BBB超微结构。结果:麝香配伍冰片可以有效减轻缺血再灌注后神经元坏死、水肿,BBB内皮细胞肿胀、紧密连接疏松、基底膜结构模糊及胶质细胞水肿等。结论:麝香配伍冰片通过上述作用减轻BBB损害、脑水肿,减轻缺血再灌注损伤。2.2麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠ICAM-1、LFA-1表达的影响目的:研究缺血再灌注后BBB内皮细胞ICAM-1、LFA-1表达情况,探讨麝香配伍冰片对BBB内皮细胞的保护作用。方法:RT-PCR方法研究ICAM-1mRNA、LFA-1 mRNA表达,免疫组化方法研究ICAM-1蛋白表达变化。结果:麝香配伍冰片、安宫牛黄丸可显着降低缺血再灌注后脑组织中ICAM-1 mRNA及其配基LFA-1 mRNA的表达(P＜0.01),冰片组各时间段ICAM-1 mRNA和缺血2h再灌注48h时间段的LFA-1mRNA也有明显降低(P＜0.05)。蛋白表达方面,麝香配伍冰片组、安宫牛黄丸组、冰片组ICAM-1蛋白表达量较模型组明显下降(P＜0.05),其中麝香配伍冰片组下降最多。结论:麝香配伍冰片可以降低缺血再灌注后粘附分子ICAM-1及其配基LFA-1的表达,从而减轻炎性反应对BBB的损伤而起脑保护作用。2.3麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠MMP-9、TIMP-1表达的影响目的:研究缺血再灌注后BBB基底膜MMP-9、TIMP-1表达情况,探讨麝香配伍冰片对BBB基底膜的保护作用。方法:RT-PCR方法研究MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA表达,免疫组化方法研究MMP-9蛋白表达变化。结果:麝香配伍冰片组、安宫牛黄丸组、冰片组各缺血再灌注时间段脑组织MMP-9 mRNA表达均受到明显抑制;与假手术组比较,叁组TIMP-1 mRNA表达明显升高,在缺血2h再灌注24h时间段,麝香组也有相同变化趋势。MMP-9蛋白表达方面,麝香配伍冰片组、冰片组、安宫牛黄丸组较模型组表达下降明显(P＜0.05)。结论:麝香配伍冰片可通过抑制MMP-9表达、提升TIMP-1表达而减轻基底膜细胞外基质的降解和BBB通透性。2.4麝香配伍冰片对缺血再灌注后大鼠AQP4表达的影响目的:研究麝香配伍冰片对缺血再灌注后BBB胶质细胞AQP-4表达情况,探讨麝香配伍冰片对BBB胶质细胞的保护作用。方法:分别用RT-PCR方法、免疫组化方法研究AQP-4 mRNA、AQP-4蛋白表达的变化。结果:在缺血再灌注各时间段,麝香配伍冰片、安宫牛黄丸、冰片均可明显抑制缺血脑组织中AQP-4 mRNA的表达,其中麝香配伍冰片、安宫牛黄丸组降低幅度最大。蛋白表达方面,麝香配伍冰片组、冰片组、安宫牛黄丸组下降明显(P＜0.05)。结论:麝香配伍冰片通过抑制缺血再灌注后脑组织AQP-4 mRNA和蛋白的表达而降低BBB通透性、减轻脑水肿而起到脑保护作用。3本研究的创新性从古至今,绝大多数医家均认为中风急性期出现意识不清才使用“开窍法”,我们以大鼠局灶性脑缺血再灌注模型为基础,研究“芳香开窍”代表药物麝香、冰片药对缺血再灌注后BBB损伤的影响机制,深入研究其作用机理,为临床治疗缺血性中风即使未出现意识不清也可应用芳香开窍法提供依据。过去对麝香、冰片多进行单味药的药理研究,我们以成分比较清楚的、且能通过BBB的两个单味中药麝香、冰片配伍组合进行系统的研究,有别于传统的大复方研究,不仅有利于药物作用的分析及其应用时增效减毒作用的研究,而且便于新药的开发,具有潜在的应用价值。探讨麝香配伍冰片抗缺血性脑损伤的作用机理,对揭示该药对配伍规律及其“芳香开窍”作用机理具有理论意义。现有的研究未能系统阐明该药对抗缺血性脑损伤的机制,因而未能较清晰地认识其作用环节,限制了该药对临床的合理使用。本研究从多角度探讨该药对配伍抗脑缺血损伤的作用及机理。这对于深入认识该药对的配伍原理和临床合理应用均具有指导作用。围绕缺血性脑水肿中BBB损伤的主要环节,从内皮细胞损伤、基质破坏和胶质细胞损伤叁个环节动态研究麝香配伍冰片抗缺血性脑水肿的作用和分子机制,从而系统地研究其作用环节。
杨敏[10]2015年在《头针对脑缺血再灌注大鼠脑组织血管新生影响的相关机制研究》文中研究说明脑卒中是目前严重危害我国中老年人生命与健康的疾病,本病突出表现为高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率,每年我国有200万人新发脑卒中,150万人死于脑卒中,其中脑梗死占了全部脑卒中的60~80%,因其居高不下的致死率及致残率给国家和众多家庭造成沉重的经济和生活负担,故其已成为现代医学研究的热点课题。大量研究证明,缺血性脑损伤是一系列复杂的多环节的病理生理变化过程,早期主要以自由基产生、脑水肿、兴奋性氨基酸毒性为主;中期以炎症、神经元凋亡为主;后期以神经再生、血管新生和胶质细胞增殖等脑重构表现为主。脑缺血后,血管新生是脑微循环修复重建的一个重要病理生理过程。血管新生的程度与卒中后神经功能恢复的程度成正相关。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最强有力的血管形成因子。研究表明,脑缺血、缺氧可诱导血管内皮生长因子及其受体的表达,应用外源性VEGF可促进脑缺血半暗带新生血管的形成,并减少脑梗死体积;环氧化酶-2(COX-2)是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的重要限速酶。近年来大量研究表明,COX-2是参与血管新生的重要因子之一;血管生成素(angiopoietins,Ang)是一族特异性作用于血管内皮细胞的生长因子,它们与血管内皮凋亡、血管形成后期的成熟、稳定性及重建方面均具有极大的相关性。近年来诸多研究均证实,叁者对血管新生有重要作用,是近年来国际上兴起的新的研究领域,但其中有关中医药、针灸的促血管生成作用的研究相对较少,尤其是关于头针的促血管新生的研究鲜有报道。目的:根据上述分析,本研究在大鼠局灶性脑缺血模型的基础上,采用改良线栓法制备MCAO模型,拟“醒脑开窍,祛瘀生新”为治则,取顶颞后斜线、顶颞前斜线,通过观察头针对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织微血管超微结果的影响,以及对VEGF、COX-2、Ang-1叁者表达的影响,从而探讨头针疗法对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑内血管新生影响的可能作用机制。方法:将清洁级sd雄性大鼠100只随机分为模型组(按缺血再灌注6h、24h、48h、96h分4组)、头针组(缺血再灌注6h、24h、48h、96h分别加电针刺激,分4组)、假手术组(大鼠麻醉切开颈部皮肤后,仅分离cca及ipa至ppa,不插线栓)、正常对照组(大鼠不予处理,正常给水给食),每组10只。各组大鼠采用zea-longa评分方法,随相应时相评定动物神经功能缺损。分别采用免疫组化sabc法检测脑缺血再灌注后各时间点因子Ⅷ相关抗原(fⅧr:ag)的表达,采用rt-pcr技术检测各组大鼠脑组织缺血半影区内ang-1mrna的表达水平,采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织缺血半影区内vegf、es的表达水平,采用酶联免疫吸附(elisa)法、荧光定量pcr检测检测各组大鼠脑组织缺血半影区内cox-2的表达水平。结果:(1)大鼠局灶性脑缺血再灌注后,头针组和对照组大鼠均出现神经功能障碍,主要表现有:脑梗死灶对侧前肢内收、肩内旋,提尾悬空时左前肢不能伸直或紧贴胸壁,行走时向右侧转圈、倾倒,肌张力降低等。采用zea-longa评分方法,24h后头针组和对照组大鼠ci/rp后神经功能均逐渐恢复,但头针组较对照组大鼠恢复得更好,在96h时差异最为显着。(2)采用免疫组化sabc法检测fⅧr:ag,头针组与模型组比较,fⅧr:ag在脑微血管的表达在缺血后24h开始增加(p<0.05)并持续上升,脑缺血后96h的差异具有极显着的统计学意义(p<0.01),头针治疗随时间的延长可使其表达持续升高。由此可见头针治疗能够有效促进脑组织缺血半影区内微血管的新生,并且具有明显的累加蓄积效应。(3)采用免疫组化法检测ang-1mrna,正常对照组、假手术组ang-1mrna中等量表达,与模型组比较,头皮针组各时间点大鼠脑组织ang-1mrna含量均相对增多,其中脑缺血再灌注48hang-1mrna含量达高峰,与模型组比较,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.05);(4)采用免疫组化法检测vegf及es,正常对照组、假手术组vegf中等量表达,与模型组比较,头皮针组各时间点大鼠脑组织vegf含量增多,es含量减少,其中脑缺血再灌注48hvegf含量达高峰,24hes含量达最低峰,与模型组比较,差异有统计学意义(p<0.01,p<0.05);(5)采用酶联免疫吸附(elisa)法、荧光定量pcr检测COX-2,正常对照组、假手术组COX-2少量表达,于模型组比较,头皮针组各时间点大鼠脑组织COX-2 mRNA及蛋白含量均减少,差异均有统计学意义(P<0.05),其中脑缺血再灌注24h COX-2 mRNA含量、96h COX-2蛋白含量与模型组比较,差异最为显着(P<0.01)。结论:取顶颞后斜线、顶颞前斜线,使用头针治疗局灶性脑缺血再灌注大鼠,可增加FⅧR:Ag、VEGF、Ang-1的表达,减少ES、COX-2的表达,从而促进脑组织缺血区血管新生,减少脑缺血区损伤,对缺血脑组织有保护作用。
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