浙江大学医学院附属儿童医院 310000
摘要：目的：噬血细胞综合征（hemophagocytic syndrome，HPS），是一组组织细胞增生活化伴有吞噬血细胞现象的一类综合征，该病进展迅速，死亡率高，早期诊断、早期治疗对患者的治疗效果有很大的影响。本研究为了解噬血细胞淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）患者外周血淋巴细胞的状态，明确在HPS发生过程中，外周血淋巴细胞增生及活化情况。方法：采用免疫荧光标记和流式细胞仪技术，对29例HPS患者外周血淋巴细胞亚群的表面标记和T细胞活化后表面分子的表达进行分析，并以健康儿童外周血作为对照。结果：与对照组比较HPS患者CD4+细胞活化不明显，CD8+细胞明显活化。存活患者CD4+HLA-DR+表达较死亡患者明显偏低，CD8+CD25+细胞比例高。结论：HPS患者CD8+T细胞异常升高、活化，CD4+T细胞增生程度减低免疫反应失控在HPS发生中起重要作用。患者外周血淋巴细胞状态有助于了解HPS的发病机制、早期诊断和预后判断。
关键词：噬血细胞综合征；淋巴细胞亚群；T淋巴细胞；活化
噬血细胞淋巴组织细胞增生症（hemophagocytic lymphohistiocytosis，HLH）又称噬血细胞综合征（hemophagocytic syndrome，HPS），是一组组织细胞增生活化伴有吞噬血细胞现象的一类综合征，以发热、肝脾肿大、全血细胞减少和组织细胞吞噬血细胞等为主要临床特征。无论是原发性或继发性HPS，其发生都是在相关诱发因素（主要为感染等）下，组织细胞（巨噬细胞及树突状细胞等）、NK细胞及细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）过度活化所导致的。目前认为其发病与免疫机制紊乱有关[1]。已有研究证明细胞因子在噬血细胞淋巴组织增生症的早期诊断、病情评估以及预后估计方面有重要作用，但外周血淋巴细胞状态改变及其意义目前尚无明确结论。本研究旨在了解在HPS发生过程中，外周血淋巴细胞增生及活化情况及其在诊断及预后方面的意义。
1.资料及方法
1.1一般资料
噬血细胞综合征患者29例为浙江大学医学院附属儿童医院2005年10月～2009年6月住院患儿。男14例，女15例；年龄0～10岁。诊断均符合HPS的诊断标准[2]，表现为①发热，②脾大，③血细胞减少（影响2或3系外周血细胞）（血红蛋白<90g/L，血小板<100×109/L，中性粒细胞<1.0×109/L），④高三酰甘油血症和（或）低纤维蛋白原血症（禁食后三酰甘油≥3.0mmoL／L，纤维蛋白原≤1.5g／L），⑤骨髓、脾或淋巴结中发现噬血细胞现象而无恶变证据，⑥NK细胞活性减低或缺乏，⑦铁蛋白>1500g／L，⑧可溶性CD25（slL-2r）≥2400U／mL。符合上述8条中5条即可诊断。入选条件：1.完成临床评估诊断为HPS，并采集外周血标本行T细胞状态检查；2.采集标本前2周未使用过激素、化疗药物、免疫调节剂等影响外周血T细胞状态的药物；3. HPS初诊病人，包括开始搜集资料时仍在我院治疗的患者。对照组为非噬血细胞综合征儿童，近期无明显感染表现。T细胞亚群对照组为7例。男3例，女4例；年龄0～8岁。活化T细胞对照组患者15例，男性4例，女性11例，年龄为0～13岁。
1.2方法
T淋巴细胞表型检测：确诊患者采取两组空腹外周静脉血2 mL，肝素抗凝，采用免疫荧光双标记单克隆抗体和流式细胞仪技术，检验两组外周血单个核细胞中T细胞亚群表面标志及活化后T淋巴细胞表面分子的表达。于各测试管中加入100μl肝素抗凝，再分别标记单克隆抗体CD4／CD8、CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR、CD8/CD25、CD8/CD69、CD8/HLA-DR室温孵育20min后Q-Prep系统溶解红细胞，2000r/min离心5min，除去上清液后以标准微球调整流式细胞仪，使变异系数在2％以内，上机检测5000个细胞，荧光强度以对数放大，采用FACScaliburTM型流式细胞仪（Becton Dickinson，San Jose，CA，USA）。
1.3统计学处理
数据残缺患者监测结果弃去，符合标准数据共28组。统计患者性别、年龄、临床表现等一般情况。分别比较患病组及对照组外周血T淋巴细胞亚群及T淋巴细胞活化状态。按照治疗后患者死亡或存活分为2组，比较2组患者预后差异。分析患者外周血活化T淋巴细胞与细胞因子之间相互关系。采用SPSS17.0软件进行分析，数据以±S表示，组间比较用t检验，P<0.05为有显著性差异。
2.结果
2.1患者情况
共有29名患者加入本研究，其中男性14名（48.3%），女性15名（51.7%）。年龄为0～10岁，其中<1岁患者5名（17.2%），1～3岁患者7名（24.1%），3～7岁患者11名（38.0%），>7岁6名（20.7%），中位年龄3.6岁。患者以发热、贫血、肝脾肿大、淋巴结肿大、皮肤粘膜出血点等为首发表现。根据HPS初诊时合并疾病不同，EB病毒感染者6名，其它病毒感染者3名，细菌感染者5名，支原体感染者1名，淋巴瘤患者1名，未发现合并症者12名。
2.2患者外周血淋巴细胞活化状态：统计患者组与对照组T细胞活化状态，HPS患者淋巴CD4+细胞活化不明显，CD8+细胞明显活化。CD69+表明细胞早期活化，而HLA-DR+则表明细胞晚期活化（见表1.1）。HPS患者CD8+细胞早期活化及晚期活化均明显高于对照组，说明患者CD8+细胞持续活化状态，免疫反应活跃，CD4+淋巴细胞仅为晚期活化，说明免疫调节受损。患者组全部29例病例均有CD8+淋巴细胞活化现象（早期活化或晚期活化）。
3.讨论
3.1噬血细胞综合征（HPS）发病机制
HPS是一组组织细胞增生活化伴有吞噬血细胞现象的一类综合征。1979年首次报道，该病随后拓展为与感染及恶性肿瘤，（特别是EB病毒相关的外周T细胞淋巴瘤及NK／T淋巴瘤）相关的一组疾病[3]。
在正常情况下，病原体侵入机体后，首先通过非特异性免疫功能中单核巨噬细胞系统／网状内皮细胞系统、DC系统的吞噬、杀灭、消化、抗原处理和递呈，将微生物特异性抗原决定簇递呈给T细胞，使之激活变成病原体特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTLs），以识别被微生物感染并留下抗原成分于细胞表面的宿主细胞，从而破坏这些受感染的宿主细胞，并释放出侵入细胞内增殖的病原体颗粒，以便彻底清除病原体在体内的寄生。其细胞毒杀伤作用主要通过两条途径：一是溶细胞颗粒介导，这些颗粒包括穿孔素、粒酶和其他蛋白酶。溶细胞颗粒转运到接触部位，通过对接与细胞质膜融合释放至效应细胞和靶细胞的突触间隙中，进入靶细胞使其渗透性死亡或诱导凋亡；二是通过Fas和FasL诱导靶细胞凋亡[4]。
本文中HPS患者CD8+细胞早期活化及晚期活化均明显高于对照组，说明患者CD8+细胞大量增殖，且处于持续活化状态，免疫反应活跃。CD4+淋巴细胞仅为晚期活化，说明免疫调节受损，免疫应答负调节功能差。HPS患者免疫功能受损，影响NK细胞、细胞毒性T细胞增殖、活化及凋亡作用[5]，使病原体不能清除，抗原在患者体内持续表达，激活巨噬细胞、NK细胞与CD8+淋巴细胞。同时，患者CD4+淋巴细胞增殖活化均受到抑制，异常活跃的免疫反应不能停止，细胞机体细胞免疫调节系统失控。有研究表明，在严重病毒感染时（如H5N1流感病毒感染），NK细胞减低可以导致病毒大量复制以及细胞因子异常升高。[6]HPS患者细胞毒T细胞和巨噬细胞大量聚集、激活，并分泌炎性细胞因子及炎症介质，形成细胞因子风暴。细胞因子在HPS的发生发展过程中起重要作用，特别是IFN-γ[7][8]。大量细胞因子、巨噬细胞和CD8+淋巴细胞异常活化以及NK细胞减低导致HPS发生。有研究表明，CD8+细胞水平升高会增加HPS患儿死亡率[9]。
3.2 HPS外周血T淋巴细胞状态及其意义
T淋巴细胞是机体识别抗原产生细胞因子参与细胞免疫应答的主要细胞，若 T细胞总数或CD4+／CD8+比值发生改变，表示可能存在免疫功能异常。淋巴细胞活化状态的改变与噬血细胞综合征发生发展有一定关系。
本文结果显示，与对照组相比较HPS患者CD4+T细胞活化不明显，CD8+T细胞明显活化，且CD8+细胞早期活化及晚期活化均明显高于对照组。说明淋巴细胞亚群及T淋巴细胞活化状态的改变是HPS患者的主要临床表现。且T淋巴细胞早期活化标志物出现早，在T细胞激活后数小时内就能检出，可以协助HPS的早期诊断。在外周血淋巴细胞亚群及活化T淋巴细胞与患者预后关系的分析中，存活患者CD4+HLA-DR+表达较死亡患者明显偏低，CD8+CD25+细胞比例高。曾有动物实验表明，穿孔素缺陷的大鼠感染后若CD8+淋巴细胞比例高预后较差[9]。
4.结论
1. HPS患儿存在细胞免疫状态紊乱表现，表现为CD4+淋巴细胞活化抑制，CD8+淋巴细胞活化增强。
2. HPS患者疾病预后与细胞免疫紊乱程度有一定相关性，CD8+T细胞持续活化提示预后较差。
3. 外周血淋巴细胞成分及功能状态检查有助于HPS的诊断及预后评估。
参考文献：
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[3]Risdall RJ，McKenna RW，Nesbit ME，et a1.Virus-associated hemophagocytic syndrome：a benign histiocytic proliferation distinct from maligmant histiocytosis．Cancer，1979，44：993-1002.
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[8]Huai-Chia Chuang，Jong-Ding Lay，Wen-Chuan Hsieh1，Ih-Jen Su. Pathogenesis and mechanism of disease progression from hemophagocytic lymphohistiocytosis to Epstein–Barr virus-associated T-cell lymphoma：Nuclear factor-κB pathway as a potential therapeutic target. Japanese Cancer Association，2007，9：1281-1287
[9]Badovinac VP，Hamilton SE，Harry JT，et al．Viral infection results in massive CD8+ T cell expansion and mortality in vaccinated perforin-deficient mice．Immunity，2003，18（4）：463-444
论文作者:夏静
论文发表刊物:《健康世界》2016年第16期
论文发表时间:2016/9/28
标签：细胞论文; 淋巴细胞论文; 患者论文; 血细胞论文; 免疫论文; 外周血论文; 细胞因子论文; 《健康世界》2016年第16期论文;