董关萍[1]2003年在《6种疱疹类病毒特异性酶切图谱的建立及其应用研究》文中研究说明疱疹病毒属中具有代表性的是单纯疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型(HSV Ⅰ／Ⅱ)、爱泼斯坦-马尔病毒(EBV)、人巨细胞病毒(CMV)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)和人类疱疹病毒6型(HHV6)这6种病毒，它们是免疫功能低下者临床常见的病原体，尤其儿童细胞、体液免疫系统不成熟，易导致疱疹类病毒感染。疱疹类病毒感染后其临床症状和体征没有特异性，而且临床又缺乏有效的诊断方法。在本研究中，我们在疱疹类病毒较保守的DNA多聚酶基因上自行设计两对共用引物，分别对6种病毒进行聚合酶链反应(PCR)及限制性内切酶片段长度多态性分析(RFLP)，最终建立了PCR-RFLP方法快速检测病毒DNA的方法，并对临床标本进行检测取得较好结果。 第一部分 疱疹类病毒特异性酶切图谱的建立 方法：在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中设计两对通用引物，一对扩增单纯疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型、爱泼斯坦—马尔病毒、人巨细胞病毒四种病毒，另一对扩增水痘—带状疱疹病毒和人类疱疹病毒6型两种病毒。对标准病毒株HSV Ⅰ(F株)、 2003浙江大学硕士学位论文HSVll（G株）、CMV（AD169株）、EBV（B95－8株）、VZV（EF株）和（HHV6）进行PCR扩增，并对扩增产物进行分子克隆、序列分析，选择BalnHI和BStUI两种内切酶对同一PCR产物进行酶切。 结果：6种标准病毒株 PCR扩增后产物为 510－592 hp，其最小检出量为 0．lfg，与乙型肝炎病毒、真菌、细菌和人类基因组无交叉反应。发现hC含量在CMV、EBV、HSV／11中较多，分别为 60．2O、61．5o、66．2O和 67．5O，VZV和 HHV6则较低分别为40．5％、43．2％。CMV扩增产物＊ 呐含8个BStUI酶切位点，经BStUI酶切后产生 170hp、130hp、80hp、62 hp、50hp、40 hp、30 hp、16 hp和 14bpg 个 DNA片段，但不能被＊alnHI酶切：＊＊＊52肋p长度内含1个＊amHI和1个扭悦＊1酶切位点，经＊amHI酶切成25加 和270 hp，被sstU－l酶切成25物p和266…：＊SV全长含 7个 BStUI酶切位点，经 BStUI酶切后产生 230hp、130hp、50hp、40hp、23 hp、20 hp、15hp和 10hp8 个 DNA片段，但无 BalnHI 酶切位点；HSV 11含 1个 BalnHI及 9个 BStUI酶切位点，经 BamHI酶切成 230hp和 288hp，但被 BStUI切成 168hp、90hp、80hp、60hp、40 hp、30 hp、20 hp、15 hp、10 hp、和 5hp10个 DNA片段。酶切后凝胶电泳能将 HSV／HSV 11、EBV、CMV鉴别出来。VZV无 BamHI酶切位点，而含1个＊s山1酶切位点，切成28p和230加两个片段：＊＊＊6被＊alnHI切成243hp 和 270hp，同时可被BStU’I切成 163hp 和 350hp 两个片段。这样经过BamHI和BSCh两种酶切后能区分6种不同的疮疹类病毒。 结论：在 CMV、EBV、HSV门扩增区域的序列中含有较高的 hC含量，故在PCR反应体系中加入了二甲基亚矾（DMSO人 从而提高了PCR扩增过程中双链的解链。因此，用两对引物对6种疮疹类病毒进行PCR扩增及RFLP基因分型的方法，具有敏感特异，快速准确的特点，旨在为疮疹类病毒感染的早期、快速诊断提供了有效的手段。 第二部分 6种疮疹类病毒的基因分型对儿重病毒感染病原诊断的 应用研究 2 2003浙江大学硕士学位论文 方法：儿童医院临床拟诊为病毒性脑炎、脑膜炎患者脑脊液标本（CSF）98份（其中5份新生儿CSF标本与血标本配对）及拟诊为病毒感染患儿的外周抗凝血75份，进行PCR－yLP方法峋分析，同时，75份血标本进行ELISA法检测血清特异性HSVU11、EBV、CMV的屹M。对照组为38例健康体检儿童的外周血和9份非病毒感染的脑脊液标本（5份癫痫病人，脑肿瘤和颅内出血各2份）进行PCR－RFLP方法的检测。 结果：98份拟诊为病毒性脑炎、脑膜炎患者的脑脊液（CSF）标本用 PCR扩增后 13例发现 DNA阳性区带（阳性率为 13．3O），经酶切后，4例为 EBV，3例为 HSVI，CMV和 VZV各为 2例，HSV 11为 1例，另 1例为 HSVI和 EBV混合感染。75份拟诊为病毒感染患儿的外周抗凝血标本用PCR扩增后，26例出现DNA阳性区带小性率为 34．7o），经酶切后，13例为 CMV感染，4例为 EBV感染，5例为 HSV 11感染，VZV为2例，HSVI及HHV6各1例。5份血和脑脊液配对的标本中有1例两者均为 HSV 11阳性。8份确诊为疮疹病毒感染患儿住院 14天的 CSF标本仍有 2例阳性 （HSVI和 CW各 1例人 ELISA法检测血清特异性 HSVlj 11、EBV、CW的 I咖，阳性 10例，分别为：CMVS例、EBV3例和 HSVllZ例。这 4种病毒的 PCR阳性检出率为30．7O，而ELISA法为13．3oo＜0．05＞具有显着差异。38例正常健康儿童的血和9份非病毒感染的脑脊液标本6种疮疹类病毒DNA均为阴性。取临床PCR阳性的标本7份（其中CMVZ份，其余5种病毒各1份），进行分子克隆和序列测定，其结果与标准病毒株的序列比较，其同源性分别为：CW为96．5O；EBV为96．0O；VZV为95．5％；HH
尚世强, 董关萍, 余钟声, 俞锡林[2]2004年在《应用PCR-RFLP技术检测中枢神经系统感染患儿6种疱疹类病毒DNA的实验研究》文中指出目的 建立一种能快速区分 6种疱疹类病毒DNA特异的限制性内切酶图谱。方法 2 0 0 2年 1～ 12月浙江大学儿童医院在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中设计两对通用引物 ,该引物能同时扩增单纯疱疹病毒Ⅰ型与Ⅱ型 (HSVI/HSVⅡ )、爱泼斯坦—马尔病毒 (EBV)、人巨细胞病毒 (CMV)、水痘 带状疱疹病毒 (VZV)和人类疱疹病毒 6型 (HHV6) 6种病毒。选择BstUI内切酶对PCR产物进行酶切。 98例怀疑病毒性脑炎、脑膜炎患儿的脑脊液标本用PCR RFLP和ELISA法进行检测。结果 6种标准病毒株PCR扩增后产物为 5 10～ 5 92bp ,经酶切后能区分为何种病毒 ,其最小检出量为 0 1fg ,与乙肝病毒、真菌、细菌和人类基因组无交叉反应。用该方法检测临床 98份脑脊液标本中的疱疹类病毒 ,13份阳性 ,同时用ELISA法检测该标本 ,5例阳性。PCR阳性检出率为 13 3% ,ELISA为 5 0 9% (P <0 0 5 )。 2例患儿在院外阿昔洛韦已治疗 2～ 3d ,但入院后在其脑脊液中仍能检测到病毒DNA。 10例诊断为疱疹病毒感染患儿经更昔洛韦每天 10mg/kg ,分两次静脉注射治疗 14d后 ,8例临床症状明显好转 ,2例病情未见好转。结论 建立的疱疹类病毒特异的限制性内切酶图谱具有特异敏感 ,快速准确的特点 ,且不受抗病毒药物的影响 ,为中枢神经系统疱
沈婵娟[3]2010年在《鸭瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白应用的研究》文中进行了进一步梳理1鸭瘟病毒U151基因的序列特征分析及密码子偏爱性分析根据本实验室构建的鸭瘟病毒(DPV) DNA文库,并结合NCBI中的开放阅读框(ORF) Finder和BLAST工具进行分析,一个完整的ORF被鉴定出来。该ORF是DPV UL51基因(GenBank No.DQ072725),大小为759bp,编码一种皮层蛋白,并且含有一个在α-疱疹病毒亚科中保守的区域。进化关系分析揭示DPV UL51基因与马立克属疱疹病毒UL51基因的进化关系最近。之后,对该基因编码蛋白序列进行了一系列生物信息学分析,结果显示,该蛋白含有4个潜在的磷酸化位点、,1个潜在的酰基化位点和4个潜在的线性B细胞表位,表明它可能是一种磷酸化和酰基化的蛋白,并且能够诱导较强的免疫反应；同时,该蛋白不含任何的N-糖基化位点、跨膜区域、信号肽和核定位信号,却含有高尔基体定位信号,表明它可能定位于胞浆的高尔基体中。对DPV UL51基因密码子偏爱性分析的结果揭示,该基因对同义密码子中第叁位为A和T的密码子有强烈的偏爱性,并且原核表达系统可能更适合该基因的表达。这些结果为进一步研究DPV UL51基因的特性和功能提供了理论支持。2 DPV UL51基因的克隆、原核表达、产物纯化及其多克隆抗体的制备根据本实验室提供的DPV UL51基因序列,采用primer5.0软件设计一对特异性引物,运用PCR方法从DPV基因组DNA中扩增UL51基因,并将其克隆至pMD18-T载体中,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切、PCR和DNA测序鉴定正确后,将该基因正向插入原核表达载体pET28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建了重组表达质粒pET28a-UL51。将该表达质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导,表达出了大小约为34KD的重组UL51蛋白,并且主要以包涵体形式存在；经过对诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间的优化,确定了该重组表达质粒的最佳诱导条件为0.8mmol/L IPTG、37℃条件下诱导4h。将表达产物用镍柱梯度亲和层析纯化后,高纯度的表达蛋白与等量弗氏佐剂混合作为免疫原,四次免疫家兔,获得了抗重组UL51蛋白高免血清。将该血清经辛酸-硫酸铵粗提和High Q阴离子交换柱层析纯化后,得到了特异性强的兔抗重组UL51蛋白抗体IgG,为进一步研究DPV UL51基因的特性和功能奠定了基础。3 DPV UL51基因在感染宿主细胞中的转录和表达特征本试验应用实时荧光定量RT-PCR和Western blotting法检测DPV UL51基因在鸭胚成纤维细胞(DEF)中的转录和表达情况。结果表明：该基因在DPV感染后2h时已经开始转录,8h开始表达,48h转录和表达量都达到最高峰,之后逐渐降低；该基因在DEF细胞中的表达产物分子量为34KD；并且该基因表达产物是病毒粒子的一种组成成分。该研究为阐明DPVUL51基因的功能提供了有用的数据。4 DPV UL51蛋白在病毒感染细胞中的定位通过间接免疫荧光技术检测DPV UL51蛋白在病毒感染细胞内的定位特性,结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24-36 h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞核和胞浆中的绿色荧光均开始减弱。用胶体金免疫电镜法检测DPV UL51蛋白在DPV感染细胞中的亚细胞定位,结果显示,DPV UL51蛋白主要位于胞浆空泡中的病毒粒子和一些膜结构上；此外,在感染早期,DPV UL51蛋白大量累积于高尔基复合体膜上,其后通过某种未知机理被运送到细胞膜附近。该研究也为阐明DPVUL51蛋白的功能奠定了基础。5 DPV UL51基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时转录和表达特性根据DPV UL51基因序列设计一对特异性引物,用PCR扩增并克隆至pMD18-T载体上,经双酶切和测序鉴定后,再将该目的片段亚克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上,得到重组质粒pcDNA3.1-UL51,通过脂质体介导将其转入COS-7细胞；应用实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和间接免疫荧光法检测该基因在COS-7细胞中的转录、表达和定位情况。结果表明：该基因在转染后6h时已经开始转录,12 h开始表达,24 h转录和表达量都达到最高峰,之后逐渐降低；并且该基因在COS-7细胞中得表达产物的分子量为33 KD。间接免疫荧光法显示该基因的表达产物早期聚集于近核区域,晚期定位于胞浆和胞核中。该研究也为阐明DPV UL51基因的特性和功能提供了有用的数据。6用免疫组化方法检测DPV UL51蛋白在人工感染鸭组织中的定位和动态分布采用DPV强毒CHv株人工感染30日龄鸭,于攻毒后于不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、哈德氏腺、肝、胰、食管、腺胃、小肠(包括十二指肠、空肠和回肠)、大肠(包括盲肠和直肠)、脑、肾、肺、心、肌肉组织或器官,用建立的基于重组UL51蛋白抗体的间接免疫荧光和免疫酶组化法,分别检测DPV UL51蛋白在鸭体组织中的定位和动态分布。结果表明,DPV UL51蛋白主要分布在法氏囊、胸腺、脾脏、肝脏、食道、和肠道中,并且主要定位于淋巴细胞、网状细胞、巨噬细胞和上皮细胞的胞浆中。本研究不仅有助于理解在急性DPV感染时,DPV的致病机理,同时也为α-疱疹病毒UL51蛋白同源物的定位和分布的研究奠定了基础。7基于重组UL51蛋白的间接EL ISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测鸭瘟病毒抗体的研究和应用DPV感染给世界上养鸭国家和地区造成了重大的经济损失。DPV特异性抗体的监测是评价DPV弱毒疫苗效果和制定合理的免疫程序的关键。因此,本研究中,基于纯化的重组UL51蛋白,我们分别建立了一种间接ELISA法(UL51-ELISA)和一种免疫层析试纸条法(UL51-ICS)来检测DPV血清抗体。首先对UL51-ELISA法的反应条件进行优化,结果表明,最适重组UL51蛋白包被量为2.5μg/100μL,最佳的血清稀释倍数为1：200,最佳的酶标二抗稀释倍数为1：2000；用建立的UL51-ELISA法对鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭疫里默氏菌(RA)、鸭大肠杆菌(E.coli)的阳性血清进行检测,结果均为阴性,特异性好；对酶标板内或板间重复试验显示变异系数均小于10%,能检出经1：3200倍稀释的DPV阳性血清。UL51-ICS是基于膜层析原理,并以胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG混合物共同作为示踪剂的一种方法。该ICS法将纯化的重组UL51蛋白抗原包被于检测线(T),兔IgG包被于质控线(C)。经优化和筛选,确定了UL51-ICS法中的重组UL51蛋白、兔IgG、胶体金标记的重组UL51蛋白和胶体金标记的羊抗兔IgG的最佳工作浓度分别为2mg/mL、lmg/mL、2mg/mL和2mg/mL。用建立的UL51-ICS法分别对非DPV的鸭源病原体阳性血清进行检测,结果均为阴性,特异性好；并能检出经1：128倍稀释的DPV阳性血清。同时,该法也具有良好的批内及批间重复性和较好的稳定性,制备好的试纸条至少可在4℃或25℃保存1年；为了评价UL51-ELISA和UL51-ICS法的效果,我们同时用UL51-ELISA、UL51-ICS、包被全病毒的ELISA法(DPV-ELISA)和中和试验(NT)四种方法对110份地方鸭血清进行检测,结果显示,与DPV-ELISA和NT相比,本研究建立的UL51-ELISA法与UL51-ICS法都有较高的特异性、敏感性和很高的的符合率,并且成本低,适于在现场或实验室进行DPV感染的血清学监测。8基于抗重组UL51蛋白抗体的抗原捕获ELISA法和胶体金免疫层析试纸条法检测DPV的研究和应用本研究中,我们使用纯化的大鼠抗重组UL51蛋白多克隆抗体和兔抗重组UL51蛋白多克隆抗体,分别建立了一种抗原捕获ELISA法(AC-ELISA)和一种胶体金免疫层析试纸条(ICS)法来检测DPV。使用建立的抗原捕获AC-ELISA方法,可以检测到1：640倍稀释的阳性DPV细胞培养液中的DPV；检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E. coli菌体培养液等结果均为阴性。使用建立的ICS法,可以检测到1：80倍稀释的阳性DPV细胞培养液中的DPV；检测含DHV的鸭胚尿囊液、含RA的菌体培养液和含E. coli菌体培养液,结果均为阴性。为了评价AC-ELISA和ICS方法的效果,我们同时用AC-ELISA、ICS和常规PCR叁种方法对10份人工感染DPV强毒后的病鸭泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示,与PCR方法相比,本研究建立的AC-ELISA法和ICS具有较高的特异性、敏感性和符合率,适于在现场或实验室进行DPV感染的检测。
蒋思婧[4]2010年在《细菌介导的重组伪狂犬病毒（PRV）载体的构建及转运哺乳动物细胞的方法研究》文中研究说明伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒科的α-疱疹病毒亚科,其宿主范围很广,能有效感染多种哺乳动物和一些禽类,引起伪狂犬病,但不感染人和高级灵长类,猪是其自然宿主。伪狂犬病是危害全球养猪业的主要传染病之一,如何预防和治疗伪狂犬病是研究伪狂犬病病毒的首要目的；此外,伪狂犬病病毒还被作为研究疱疹病毒生物学的模式系统,分析病毒的入侵、病毒粒子的包装和胞外分泌以及神经入侵等机制,PRV还作为“活”的追踪剂,被用于各种神经通路的研究。PRV为双链DNA病毒,基因组约为150 kb,在非必需基因区能容纳大的外源DNA片段插入；此外,该病毒还具有高效感染神经细胞并在神经细胞中潜伏的能力,因此PRV适合作为疫苗和基因治疗载体。作为载体,PRV在疫苗生产、基因和肿瘤治疗等方面已有一些成功的尝试,但是,利用哺乳动物细胞内同源重组的方法构建重组PRV病毒是一项繁琐的工作,疱疹病毒基因组BAC克隆的出现极大地简化了重组PRV病毒的构建方法,为发展高效的重组疱疹病毒载体构建技术奠定了基础。本研究以PRV-BAC载体pBecker2为基础,建立了利用交配辅助遗传整合克隆(MAGIC)技术构建重组PRV病毒载体和不依赖转染的、利用大肠杆菌感染介导的PRV-BAC DNA转入动物细胞获得重组病毒粒子的方法,具体研究内容如下：1.表达限制性内切酶Ⅰ-SceⅠ的大肠杆菌DH10B-IS2的构建构建打靶质粒pML294C,将pML294C中约6 kb的umuC:araC-ParaBAD-Ⅰ-SceⅠ-FRT-npt-FRT片段酶切下来,电转化已诱导Red-gam重组酶表达的大肠杆菌DH10B(pML300)。经细胞内同源重组得到araC-ParaBAD-Ⅰ-SceⅠ-FRT-npt-FRT插入染色体umuC基因中的重组大肠杆菌DH10B-ISK。将pCP20质粒转化大肠杆菌DH10B-ISK,温度诱导Flp重组酶表达,筛选得到npt基因被敲除的kans大肠杆菌DH10B-IS2,并验证了该菌株表达的Ⅰ-SceⅠ内切酶的功能。2.受体载体pBecker2-KH的构建将kanr基因打靶盒式结构(H1-Ⅰ-SceⅠ-kanr-Ⅰ-SceⅠ-H2)经同源重组插入pBecker2的TK基因中,得到受体载体pBecker2-KH;进一步通过限制性图谱分析、序列分析和Southern印迹分析,证明重组质粒pBecker2-KH的结构是正确的。将pBecker2-KH转染PK-15细胞,获得了有感染能力的PRV病毒vBecker2-KH。3.通过MAGIC方法构建重组伪狂犬病病毒载体将含供体质粒pRTRA的供体菌DH10β和受体菌DH10B-IS2 (pBecker2-KH、pML300)按比例混合,进行接合实验；用添加了Amp(100μg/ml)、Cam(12.5μg/ml)和Ara(0.2% w/v)的LB固体平板培养；用引物F5和Rsv40进行菌落PCR筛选重组克隆。PCR结果表明这些随机挑选的克隆中均含重组质粒pBecker2-red。进一步通过限制性图谱分析、序列分析和Southern印迹分析,证明重组质粒pBecker2-red的结构是正确的。将pBecker2-red转染PK-15细胞,产生的细胞蚀斑呈现红色荧光；从细胞中收获了有感染能力的PRV病毒vBecker2-red。病毒一步生长曲线显示重组病毒vBecker2-red和vBecker2-KH与亲本vBecker2的体外增殖特征一致。将PRRSV的ORF5通过MAGIC方法克隆至PRV BAC载体上,得到重组病毒载体pBecker2-O5,经转染后获得相应的重组病毒vBecker2-O5。Western印迹检测表明融合了His标签的PRRSV ORF5蛋白在PK-15细胞中实现了表达。4. MAGIC方法构建重组伪狂犬病病毒载体的效率分析构建质粒pRThGA,该质粒与pRTRA供体质粒不同的是：在两个同源臂之间仅克隆了gfp表达盒式结构,没有串联Ampr基因作为筛选标记。以pRThGA作为供体质粒,进行接合实验,然后用含Cam和Ara的LB固体平板培养；用引物F5和Rsv40进行菌落PCR,48个克隆中,有43个扩增得到了-1.7 kb的DNA片段,与gfp的表达盒式结构的大小一致,表明这些克隆含有重组质粒pBecker2-gfp;阳性率为89.4±8.5%。将pBecker2-gfp转染PK-15细胞,产生的细胞蚀斑呈现绿色荧光；从细胞中收获了有感染能力的PRV病毒vBecker2-gfp。Western印迹检测表明融合了His标签的绿荧光蛋白在PK-15细胞中实现了表达。5.感染性大肠杆菌转运PRV-BAC进入哺乳动物细胞的能力质粒pGBQinv-hly克隆有Yersinia pseudotuberculosis入侵素基因(inv)和Listeria monocytogenes的李斯特溶菌素LLO基因(hly)。将质粒pGBQinv-hly分别转化大肠杆菌DH10B (pBecker2)、DH10B (pBecker2-KH)和DH10B (pBecker2-red)获得了感染性大肠杆菌DH10B-pBGih1、DH10B-pBGih2和DH10B-pBGih3,用这3株大肠杆菌分别感染PK-15细胞,从中都获得了PRV病毒粒子；病毒滴度分析表明这叁株细菌转运BAC DNA的效率相似。感染性大肠杆菌也将重组PRV-BAC载体pBecker2-O5转运至PK-15细胞内,获得了相应的重组病毒。用DH10B-pBGihl分别感染PK-15、IBRS-2、Hela和Vero细胞,前叁种细胞均会发生病变,而Vero细胞无病变出现。6.感染性大肠杆菌细胞感染条件的研究其最佳感染条件为：DH10B-pBGih1感染IBRS-2和Hela细胞的最佳时间均是60min,在60-150 min的范围内,被感染细胞中释放的病毒滴度差异不大；而细菌对IBRS-2和Hela细胞最佳的感染剂量分别为900 MOI和600 MOI；在300-3000之间,IBRS-2细胞中释放的PRV病毒量接近,而MOI在600-3000之间时,Hela细胞中释放的PRV病毒滴度也无显着差异。7.感染性大肠杆菌小鼠感染的研究将DH10B-pBGih1按1×109CFU的接种量、通过肌肉或腹腔注射BALB/c鼠,以vBecker2和pBecker2为对照,DH10B-pBGih1感染后,在小鼠的主要器官,如脾脏、肝脏和脑组织的匀浆液中均没有检测到PRV病毒的存在。DH10B-pBGih1免疫小鼠后,也不能诱发小鼠的免疫应答,小鼠不能抵御强毒的攻击,这表明感染性大肠杆菌不能有效的将PRV-BAC DNA转运至小鼠的体细胞中。综上所述,本研究建立了基于PRV-BAC的交配辅助遗传整合克隆系统,使用该系统构建了几种PRV重组病毒载体；还建立了通过大肠杆菌将PRV-BAC基因组DNA直接转运至哺乳动物细胞的技术；这两种技术结合使用,使获得重组病毒的时间缩短至7天,为PRV载体在疫苗生产、基因和肿瘤治疗以及神经通路研究等领域的广泛应用奠定了基础。该方法也适用于构建其他BAC化的疱疹病毒载体以及将BAC DNA有效转运至哺乳动物细胞内,为疱疹病毒的遗传修饰和重组工程研究也提供了技术支撑。
张晨飞[5]2009年在《MDV-1 CVI988疫苗株VP22及UL13蛋白功能初步研究》文中认为血清I型马立克氏病病毒(Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1)的UL49基因和UL13基因分别和单纯疱疹病毒I型的UL49及UL13基因同源,各自编码大小约27.6kDa和57.1kDa大小的蛋白,在HSV-1中,这两种蛋白均为主要的被膜蛋白。VP22被发现在不存在其他病毒蛋白的情况下具备蛋白转导的功能,并且目前已经有很多研究表明VP22能够转运其它蛋白在细胞间扩散,使其在克服基因治疗和基因免疫的缺陷方面具有得天独厚的优势。而UL13作为病毒自身编码的丝/苏氨酸蛋白激酶,在病毒复制、组装、以及调节宿主细胞转录翻译方面发挥着重要作用。在HSV中,VP22是UL13的主要病毒蛋白底物,并且有研究发现VP22的磷酸化可能影响该蛋白的定位,而在MDV中还未有类似报道。目前关于MDV VP22及UL13的研究相对较少,究竟MDV VP22是否也能作为蛋白转运的工具?又有哪些蛋白能够被该蛋白转运?MDV VP22的转运功能是否能够增强机体针对目的蛋白的免疫应答水平?VP22的转导特性又如何?在MDV中,UL13是否能够磷酸化VP22?该磷酸化修饰对VP22又有何影响?这些都需要进一步的实验进行探索。本研究旨在通过对上述问题的探索,为VP22进一步走向应用打好基础。1. VP22转运异源蛋白的研究MDV VP22具有独立的蛋白转导功能,能够在细胞间高效转导,为进一步探索该蛋白作为蛋白转运工具的可行性,本研究构建了GFP、AIV-NP、BoIFN-γ、IBDV-VP2以及NDV-F基因与MDV-1 VP22融合表达的重组质粒,并将所获得的重组质粒在COS-1上进行瞬时表达以观察上述不同融合蛋白在COS-1细胞上的定位情况,从而评价VP22对这4种蛋白的转运能力。结果发现GFP、AIV-NP及BoIFN-γ在与VP22融合表达的状态下能够被VP22高效转运,而VP22对NDV-F的转运效率较低,对IBDV-VP2则完全不具备转运能力。此外,被VP22转运后的蛋白均定位在细胞核内。这些研究结果说明MDV VP22能够作为蛋白转运的载体,但对所转运蛋白具有选择性,并且VP22能够改变被转运蛋白原始的细胞定位。2. VP22增强机体针对目的抗原免疫应答水平的评价MDV VP22蛋白具备蛋白转运的功能,能够转运与VP22融合表达的GFP、AIV-NP、BoIFN-γ以及NDV-F等蛋白,为进一步评价VP22对这几种蛋白的免疫增强效果,本研究将pNP-VP22、pBoIFN-γ-VP22及pF-VP22的重组表达融合蛋白的质粒免疫Balb/c小鼠,4免后采取小鼠血清并分离小鼠淋巴细胞,通过ELISA、ELISPOT以及流式细胞法检测各组小鼠的免疫应答水平,结果发现,VP22能够特异性增强BoIFN-γ的细胞免疫水平,而对其体液免疫没有多大的影响。相反,NP蛋白的体液免疫水平却显着增强,但细胞免疫增强的效果不明显。而对于F蛋白,VP22几乎对其无任何的免疫增强的效果。上述结果显示,MDV-1 VP22具备增强机体针对目的抗原的免疫应答的功能,但免疫应答的类型可能会受到VP22蛋白转运方式的影响。3. VP22转导机制的研究MDV VP22蛋白具有独立的蛋白转导功能,能够作为蛋白转运的工具,但其转导及细胞定位的机制还未确定。我们早期的研究发现,在MDV感染的CEF中,VP22定位于细胞核,为进一步研究该蛋白的转导机制及细胞定位机理,分析该蛋白在表达过程中细胞定位的影响因素,本研究通过重组人腺病毒表达VP22蛋白,并对重组病毒表达的VP22的转导功能进行鉴定,结果发现将重组病毒感染的AD-293细胞裂解产物加至正常的MDBK细胞上,VP22能够进入几乎所有的细胞,说明重组病毒表达的VP22蛋白具有很强的蛋白转导功能。进一步鉴定VP22的细胞定位发现,在重组病毒感染的AD-293细胞中,VP22首先聚集于细胞核周围,随后以特殊的荧光粒子的形式散在于胞浆中,有别于AD-293细胞中瞬时表达的VP22及MDV感染的CEF中VP22的定位模式;同时我们也对Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达的VP22的蛋白转导特性以及VP22转导的细胞广谱性进行了研究,发现该系统表达的VP22也具有蛋白转导的功能,并且其定位可能受到温度的影响,而瞬时表达的VP22的转导是细胞广谱性的,能够在多种细胞上实现蛋白转导的功能,并且定位在细胞核内。4. MDV-1 UL13序列对比分析及对VP22可能的磷酸化位点预测蛋白激酶是一类庞大的蛋白家族,尽管它们的结构、催化模式以及特异性底物都存在很大的差异,但它们的功能结构域却相当保守。MDV UL13是病毒编码的蛋白激酶,本研究通过DNAStar软件的MegAlin功能对比MDV不同毒株以及不同疱疹病毒属的UL13氨基酸序列,发现MDV不同毒株的UL13序列近乎相同,而不同疱疹病毒属的UL13及相应同源物的同源性很低,但在它们的激酶结构域内保守。通过CDTree软件绘制该蛋白的遗传分类图谱,发现它与黑腹果蝇的pelle蛋白的功能结构域属于相同进化分支,利用NCBI protein Blast功能检索MDV UL13保守结构域,发现MDV UL13也具有丝/苏氨酸蛋白激酶的激酶结构域,并且催化中心主要位于152-297氨基酸残基间,利用Cn3D 4.1软件分析Blast结果,建立UL13可能的结构模型,同时对比真核生物蛋白激酶的基序,发现UL13在激酶SubdomainⅦ的保守甘氨酸残基被丝氨酸替代,SubdomainⅧ的保守非极性脯氨酸残基被极性半胱氨酸残基替换。利用NetPhos 2.0 Server对VP22进行磷酸化位点预测,发现该蛋白存在多个丝/苏氨酸磷酸化位点,且主要集中在两端,提示MDV VP22很有可能也是UL13的磷酸化底物。5. UL13的原核和真核表达以及多抗血清的制备MDV UL13蛋白是病毒自身编码的蛋白激酶,具有类似真核细胞蛋白激酶的功能,并且在整个疱疹病毒科内都具有保守性,为研究该蛋白激酶的功能,本研究通过PCR方法从CVI988疫苗株基因组中扩增UL13基因,并将UL13基因片段克隆到杆状病毒转移载体pFastTMBac1中,再将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,经过转座和蓝白菌落筛选及PCR鉴定,获得含UL13基因的重组穿梭载体。在脂质体的辅助下将重组穿梭载体转染Sf9细胞,通过PCR验证获得含UL13基因的重组杆状病毒,命名为rBac-UL13。同时,利用GENEART(www.gcua.de)分析UL13在大肠杆菌中表达时密码子的偏嗜性;通过DNAstar抗原性分析确定UL13的高抗原性片段,进行原核表达,并以切胶免疫方法免疫小鼠制备多抗血清,再以获得的多抗血清检测rBac-UL13重组毒感染的sf9细胞,证实了所获多抗血清含有特异性针对UL13的抗体,同时也证实了UL13在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的表达。
郭建顺[6]2005年在《鸡痘病毒分子生物学检测方法的建立及其致病机理研究》文中提出鸡痘是由鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)引起的一种急性接触性传染病。鸡痘发病的新特点以及FPV 以其独特的优越性作为重组病毒载体疫苗株之一使其越来越来受到人们的广泛关注。为了建立FPV 的分子生物学诊断方法,探讨其在鸡体内的分布、消长规律以及长期毒性,特进行了本研究。试验首先根据已发表的FPV 4b 核心蛋白基因的核苷酸序列设计合成了2 对引物,通过对影响PCR 扩增因素的优化,建立了特异、敏感的FPV 的PCR 检测法。同时试验也对环境中rFPV 的浓缩及PCR 检测方法进行了探讨。回收FPV 4b 核心蛋白基因1 361 bp 的片段,与pMD18-T 载体连接(重组质粒pMD18-T-4b)进行测序。Blast 软件分析表明,该序列与模板DNA(AF198100)的碱基序列的同源性为99.5%,只有7 个碱基差异。结果表明,FPV 4b 核心蛋白基因具有很强的保守性,是制备基因探针非常理想的材料。用EcoRⅠ酶切重组质粒pMD18-T-4b 后得到1 个约360 bp 大小的DNA 片段,以其为模板制备了地高辛标记的cDNA 探针。特异性、敏感性检测和初步应用表明,本试验所建立的检测FPV 的基因探针法具有广泛的应用前景。本试验通过两侧翅内侧皮肤无血管处刺种和气管内(滴鼻、点眼)的途径给10 日龄商品蛋公鸡接种FPV JL 弱毒疫苗株,利用PCR 的方法检测了其在鸡体内的分布、消长规律以及对其毒性进行了研究。2 种接种方法均能在刺种部位皮肤、心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、脑内检测到病毒DNA,消长规律基本相同,但也存在一定差异。毒性试验表明,FPV JL 弱毒疫苗株通过翅内侧皮肤无血管处刺种存在导致全身皮肤感染出痘的危险,滴鼻、点眼途径接种比翅内侧皮肤无血管处刺种免疫效果更确实,使用更安全。上述结果表明,FPV JL 弱毒疫苗株毒性弱,使用安全,但也存在着一定的潜在的生物安全性问题。
斯日古楞[7]2007年在《JSRV-NM株env基因和CA基因的克隆、表达及其单抗的制备》文中研究表明绵羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis ,SPA)是由β-反转录病毒属,绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)引起的一种肺肿瘤性疾病,世界动物卫生组织将其列为B类传染病。为了进一步研究JSRV的致病机制及建立快速诊断SPA的方法,本研究对内蒙古某市种羊场绵羊肺腺瘤病进行流行病理学研究的基础上,从绵羊肺腺瘤病病毒内蒙株(JSRV-NM)自然感染羊的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,根据JSRV-NM株基因组全序列,采用Primer Premier 5.0引物设计软件,在env基因的表面蛋白(SU)及跨膜蛋白(TM)基因和gag基因的衣壳蛋白(CA)基因设计引物,经体外重组技术分别进行克隆、构建重组质粒并测序分析变异情况,再分别亚克隆至原核表达载体,在大肠杆杆菌系统中表达蛋白;将CA基因C末端融入HA序列,再亚克隆至真核表达载体上,在真核细胞中进行表达。以原核表达CA蛋白的纯化产物免疫BALB/c小鼠,制备其单克隆抗体(McAb),以原核表达产物与真核表达产物筛选、鉴定制备的McAb。同时,对SPA自然病例和人工感染病例,用所建立的实时荧光定量PCR(real-time Q-PCR)方法检测其外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结及鼻液中JSRV-NM株前病毒拷贝数。实验结果表明:(1)构建的重组质粒pGEM-T-CA、pGEM-T-SU和pGEM-T-TM,分别经测序分析结果显示,CA基因与JSRV-NM株比较氨基酸序列同源性可达99.45%;SU基因所编码的氨基酸共有8处发生突变,同源性为97.36%;TM基因核苷酸序列发生很多突变和终止密码子,与JSRV-NM株序列中该段序列同源性仅为80.2%,这些缺陷型前病毒的大量存在可能与免疫保护存在一定的关系,有待进一步研究;与内源性enJSRV的TM部分序列进行比较结果显示,其氨基酸序列中具有外源性exJSRV特有的致病性“YXXM”序列。(2)重组原核表达质粒pGEX-4T-1-CA和pGEX-4T-1-SU及pGEX-4T-1-TM可以在大肠杆菌中分别以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA、SU和TM融合蛋白表观分子量分别约为37KDa、68KDa和46KDa,表达量分别占全菌蛋白的20%、25%和30%,并利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可溶性表达蛋白和从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度,是一种理想的免疫原。(3)构建的重组真核表达载体pCDNA3.1(+)-CA-HA,转染至293细胞和Hela细胞后,用Anti-HA单抗经间接免疫荧光和Westhern blotting法检测蛋白表达。结果显示该载体转染293细胞后,可在细胞内观察到特异性荧光和检测到目的基因的表达产物。说明已成功地构建了CA蛋白的真核表达载体,并可在真核细胞内表达CA目的基因。(4)用原核表达CA蛋白的纯化产物免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得3株能稳定分泌抗体的单克隆细胞。利用CA真核表达蛋白分别对此3株杂交瘤细胞经间接免疫荧光方法鉴定,结果证实所获得的3株杂交瘤细胞分泌的抗体均为针对JSRV-NM株CA蛋白的特异性McAb。(5)根据JSRV-NM株env基因序列,选取其保守序列作为检测的目的片段,设计并合成相应的引物和TaqMan探针,以SPA自然病例的肺肿瘤组织基因组DNA为模板,用PCR方法构建重组质粒pGEM-T-Env,并严格定量后,梯度稀释作为阳性标准品,优化反应条件后进行real-time Q-PCR扩增,获得相应的标准曲线为:Y=-3.308X+47.848,线性相关系数为0.991;经同一标本重复检测,Ct值变异系数小,并且灵敏度比常规PCR高10-100倍。因此初步建立了检测JSRV前病毒DNA的real-time Q-PCR技术平台。(6)应用初步建立的real-time Q-PCR方法对不同来源的绵羊外周血样品及其他组织样品进行初步地检测,测定其前病毒载量。结果显示B组和C组外周血白细胞、肺脏、肺门淋巴结以及鼻液中检测前病毒DNA均为阳性,并发现前病毒DNA的载量在肺脏中明显高于外周血白细胞,高达10～1000个拷贝;D组虽未发现有SPA临床症状,但在肺门淋巴结里可以检测到前病毒DNA;E组中一只绵羊的肺脏也检出低拷贝数的前病毒DNA,而在A组中检测结果均为阴性。本项研究是国内首次对JSRV进行相关蛋白的分子克隆与表达研究、单克隆抗体的制备以及real-time Q-PCR检测,对SPA分子发病机理进一步研究及建立更为灵敏的检测JSRV的特异性方法以及研究SPA防制措施等均有重要意义。对保障我国种羊业的战略安全以及对养羊业的健康发展,具有重要的学术意义和实用价值。
蔡铭升[8]2009年在《鸭瘟病毒UL35基因的原核表达、蛋白纯化、转录时相、表达时相及亚细胞定位》文中研究说明论文对本研究小组鉴定的DPV UL35基因(GenBank登录号EF643558)开展了以下系列研究:DPV UL35基因序列的分子特性分析,DPV UL35基因的克隆、原核表达和抗体制备,在病毒感染宿主鸭胚成纤维细胞中DPV UL35基因表达产物的亚细胞定位检测以及其转录时相和表达时相分析,结果如下:1.鸭瘟病毒UL35基因序列的分子特性分析DPV UL35大小为354bp,编码117aa,包含1个保守结构域,为Herpes_UL35,与小衣壳蛋白家族相关并在Herpes_UL35基因编码蛋白之间高度保守,而且DPV UL35蛋白(VP26)与Genbank上多种α疱疹病毒同源蛋白的核酸和氨基酸序列具有较高的同源性。系统进化树分析表明,DPV在分类地位上归属于Alphaherpesvirus亚科,而且有可能属于新的属。另外,亚细胞定位分析表明VP26主要定位于细胞核中,为核靶向蛋白质。密码子偏爱性分析结果显示,编码VP26相同氨基酸的不同密码子使用频率有较大的差异,并且VP26与大肠杆菌、酵母和人的密码子使用偏爱性差异分别有18、19和25个,因此,DPV VP26的密码子偏爱性与原核生物较为接近,与真核生物及人相差较大,其基因表达选择在大肠杆菌等原核系统较为合适。2.鸭瘟病毒UL35基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备对经PCR扩增的UL35基因进行pMD18-T载体克隆,然后通过对pMD18-T-UL35及pEY-32a(+)进行BamHI、HindⅢ双酶切、连接,将UL35基因定向插入pET-32a(+),经BamHI和HindⅢ双酶切以及PCR鉴定表明,成功构建了重组表达质粒pET-32a(+)-UL35,并将其转化入表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达,得到大小约为33kDa的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的32.3%,主要以包涵体的形式存在,最佳表达优化条件为1.0 mmol/L的IPTG在34℃下诱导5h。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。将过柱纯化的重组蛋白对家兔进行免疫,制备了兔高免血清,Western-blot检测显示,其能够识别重组表达蛋白,并且琼脂扩散试验效价高达1:32。3.鸭瘟病毒体外感染鸭胚成纤维细胞UL35基因的转录和表达时相分析通过荧光定量PCR对DPV UL35基因在鸭胚成纤维细胞(DEF)的转录时相检测结果表明,随着接毒时间的延长,DPV UL35基因的转录产物呈现先急剧上升,再缓慢下降的趋势。最早在0.5h就已经检测到UL35基因开始转录,随后转录产物量迅速放大,并于感染后12h达到高峰,24h后其相对含量下降到一定水平,但在72h仍保持较高的水平。这种转录谱具有疱疹病毒早期基因的典型特征。以制备的兔抗DPV VP26 IgG为一抗,对感染鸭瘟强毒的DEF进行Western-blot分析,在感染12～72h之间的细胞蛋白提取物中可观察到与DPV VP26蛋白预测大小约13kDa相一致的条带。在感染后12h隐约可见,随着感染时间的延长,从24h起目的条带逐渐变大变清晰,72h达到最大值。综合分析DPV UL35基因的转录表达时相模式,推测该基因为病毒的晚期基因,其在感染晚期得到大量表达,这说明其与病毒的组装与成熟密切相关,但其精确的定义有赖于进一步的研究。4.鸭瘟病毒UL35基因产物在鸭胚成纤维细胞中的亚细胞定位检测通过细胞免疫荧光进行病毒感染DEF的亚细胞定位检测,结果表明:DPV感染DEF后2～8h细胞核内荧光的量相对较少,12～36h逐渐增加,48～72h达到最多,并且在细胞核内的斑点区域聚集呈颗粒状分布;而在细胞质内12h才开始出现少量荧光,24～48h随病毒感染时间的延长而增加,72h的量达到最多。这种分布特征变化可初步推测为DPV基因组编码的VP26在细胞质中完成蛋白质的合成,然后转移至细胞核内并参与衣壳前体的组装,以发挥其基本生物学功能。
杜锐[9]2009年在《microRNA在乙肝病毒复制中的作用及机制研究》文中指出【背景】乙肝病毒相关性疾病包括由乙肝病毒(HBV)引起的急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝细胞肝癌等,严重威胁着人类的健康。我国是肝病大国,乙型肝炎病毒携带者有1.2亿之众,约占我国全部人口的9%。慢性乙肝和肝硬化患者有3000万之多。乙型肝炎一旦慢性化,10-20%可发展为肝硬化,1%-5%可演变为肝癌。我国每年因肝硬化和肝癌死亡人数超过30万,其中肝癌死亡人数达18万,目前这一数目还呈上升趋势。肝病已经成为当今威胁中国人口健康的主要疾病之一,数量巨大的慢性肝病患者的存在,以及每年新发现肝炎病例的出现,给国家经济带来了沉重的负担。尽管干扰素和核酸类似物的应用可以抑制乙肝病毒在体内的复制,但不能有效清除体内的乙肝病毒,同时长期用药的各种副作用以及病毒突变和停药后的复发等严重影响治疗效果,因此寻找新的抗病毒治疗方法和新的抗病毒治疗靶点是当务之急。microRNA (miRNA)是近年来发现的一类广泛存在于动植物体内的非编码小RNA,在转录后水平负性调控基因的表达。据预测,每个miRNA可以调控超过200个基因的表达,人类基因组序列可以编码超过1000个以上的miRNAs,这些miRNAs可调控超过1/3的蛋白编码基因的表达,影响着几乎所有的信号通路。miRNA已被证实不仅广泛参与个体发育,器官形成,物质代谢等生理过程,且和肿瘤发生、病毒复制等病理过程密切相关。病毒复制和宿主细胞的多种因素有关,因此病毒生命周期也极有可能利用miRNA这种调控方式。事实上,已有确切的证据证明病毒基因组本身能编码大量的miRNA,通过和病毒或宿主细胞编码的靶基因结合,而达到免疫逃逸或对抗宿主细胞的抗病毒效应。同时宿主miRNA能调节病毒基因的表达而调控病毒的复制,病毒利用这些宿主细胞的miRNA通路而促进病毒在体内的复制。在宿主细胞和病毒的对抗网络中,miRNA发挥极其重要的调节作用。因此,我们推测存在着这么一类miRNA分子,能通过调节HBVmRNA、HBV编码的蛋白质,或者是宿主细胞内病毒复制相关的蛋白质的表达,而调控HBV在体内的复制。到目前为止,miRNA在乙肝病毒复制中的作用及机制尚未见报道。【目的】探讨内源性的miRNA在乙肝病毒复制中的调节作用及其分子机制,以期从新的角度阐明乙肝病毒体内复制的机制,并为寻找新的抗病毒治疗靶点提供理论依据。【方法】1.通过miRNA芯片检测乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15及其亲本细胞HepG2的miRNA表达谱,寻找差异表达的miRNA;2.利用real-time RT-PCR法对miRNA芯片结果进行验证;3.通过细胞转染,利用miRNA特异的前体寡核苷酸分别上调HepG2.2.15细胞中miRNA的表达,miRNA特异的反义寡核苷酸抑制物分别下调HepG2.2.15细胞中miRNA的表达;4.通过MTT试验检测miRNA对肝癌细胞体外增殖能力的影响;5.通过实时荧光PCR检测miRNA对乙肝病毒DNA水平的影响,实时荧光PCR检测miRNA对乙肝病毒mRNA水平的影响,ELISA检测miRNA对乙肝病毒蛋白水平的影响;6.利用生物信息学网站或软件预测miR-501/let-7a可能调控的靶基因;7.利用Western blot、RT-PCR以及荧光素酶报告基因实验验证miR-501/let-7a调控的靶基因;8.通过流式细胞术分析let-7a对肝癌细胞细胞周期的影响,Western blot检测let-7a转染的肝癌细胞系周期相关蛋白的表达;9.克隆HBV核心启动子以及增强子的不同截短体,荧光素酶报告基因实验检测let-7a对其调控作用;10.构建miR-501靶基因HBXIP的siRNA载体,和miR-501抑制剂共转染肝癌细胞系,分别检测HBVDNA、mRNA和蛋白水平的变化,探讨miR-501-HBXIP通路在HBV复制中的作用;11.构建Ras的负显性突变体,和let-7a抑制剂共转染肝癌细胞系,分别检测HBVDNA、mRNA和蛋白水平的变化,探讨let-7a-Ras通路在HBV复制中的作用。12.收集肝癌手术患者新鲜癌旁肝硬化组织,实时荧光定量PCR检测miR-501/let-7a在组织中的表达,分析miR-501/let-7a的表达和HBV复制状态之间的关系。【结果】1. 10个miRNAs在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系HepG2.2.15和其亲本细胞HepG2中差异表达(>2倍),其中5个分子在HBV感染的HepG2.2.15细胞系上调,分别为hsa-miR-18a*,hsa-miR-431,hsa-miR-302b*,hsa-let-7a,hsa-miR-501;5个分子表达下调,分别为hsa-miR-148a,hsa-miR-320,hsa-miR-503,hsa-miR-519e*,hsa-miR-448;2. Real-Time RT-PCR结果显示:hsa-miR-18a*,hsa-miR-431,hsa-let-7a,hsa-miR-501在HepG2.2.15细胞系表达上调,hsa-miR-148a,hsa-miR-320,hsa-miR-503,hsa-miR-519e*,hsa-miR-448在HepG2.2.15细胞系表达下调,与芯片结果一致;3.适时荧光定量PCR实验结果显示,miR-501,let-7a的抑制剂显着抑制HBV DNA的水平,而miR-503,miR-519e*,miR-448以及miR-320的前体分子对乙肝病毒DNA水平没有影响,进一步适时荧光定量PCR和ELISA的结果表明miR-501,let-7a的抑制剂能显着抑制乙肝病毒mRNA和蛋白水平,并且具有时间依赖性;4.生长曲线实验表明,let-7a的抑制剂能促进肝癌细胞体外增殖能力,而miR-501的抑制剂则对肝癌细胞的增殖能力没有影响,因为,我们认为miR-501,let-7a能促进乙肝病毒的体外复制;5.生物信息学预测的众多miR-501的靶基因中包括已明确的乙肝病毒复制抑制分子HBXIP,而let-7a的预测靶基因中包括乙肝病毒mRNA序列和已明确的乙肝病毒复制相关分子Ras;6.与对照细胞相比,转染miR-501特异性抑制剂的HepG2.2.15细胞的HBXIP蛋白水平明显降低,而mRNA水平则无显着差异。miR-501通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的HBXIP 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达;7. HBXIP siRNA能有效抑制HBXIP蛋白的表达,并能逆转miR-501的抑制剂对乙肝病毒复制的抑制效果; 8.根据计算机预测,let-7a可能直接作用于乙肝病毒mRNA序列,将let-7a的潜在作用靶点克隆入报告基因载体,双荧光素报告基因结果表明,let-7a不能直接作用于乙肝病毒mRNA序列。与对照细胞相比,转染let-7a反义抑制物的HepG2细胞的K-Ras蛋白水平明显升高,而mRNA水平则无显着差异。let-7a通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的K-Ras 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达;9.流式细胞术检测周期发现,let-7a抑制剂促进肝癌细胞G1-S期进展,Western blot结果发现,CDK6, CCNJ等周期相关蛋白受let-7a负性调控;10. let-7a的抑制剂有效抑制乙肝病毒核心启动子和增强子的活性,发挥类似Ras通路的功能,负显性突变的Ras能逆转let-7a的抑制剂对乙肝病毒复制的抑制作用。11新鲜临床标本检测let-7a和miR-501的结果表明:let-7a和miR-501在乙肝病毒高复制的临床标本肝硬化组织明显高于乙肝病毒低复制的临床标本。【结论】1. miRNA在乙肝病毒稳定复制的肝癌细胞系和其亲本细胞中差异表达,可能参与乙肝病毒的复制;2. miR-501能促进乙肝病毒的体外复制,miR-501在临床标本中的表达和HBV复制状态呈正相关,其可能的分子机制是:miR-501负性调控靶基因HBXIP的表达而促进HBV的复制;3. let-7a能促进乙肝病毒的体外复制,let-7a在临床标本中的表达和HBV复制状态呈正相关,let-7a并不能通过直接作用于HBVmRNA而影响病毒复制,可能通过两条通路促进病毒复制:一是负性调控周期相关蛋白,使肝癌细胞处于静止期,病毒复制增强;二是抑制Ras蛋白及其下游通路,间接通过HBVmRNA的核心启动子和增强子而促进病毒复制。
朱峰[10]2009年在《人巨细胞病毒UL49 ORF表达及产物功能的初步研究》文中指出背景与目的人巨细胞病毒UL49开放阅读框(ORF)为疱疹病毒保守基因。目前,除Walter Dunn等利用细菌人工重组染色质(BAC)技术发现UL49缺失突变病毒不能再包装,间接证实UL49为人巨细胞病毒生长的必须基因外,对UL49相应功能研究均局限于生物信息学分析与推测。为了进一步证实UL49在病毒生物学方面的功能,有必要首先阐明以下问题：UL49的mRNA表达及全长cDNA精确序列；能否检测到UL49编码的蛋白(pUL49)、确定pUL49表达时相及蛋白特性(病毒结构蛋白、还是非病毒结构蛋白?)等；在此基础上,对以下问题进行实验论证：pUL49在病毒感染宿主细胞中的定位以及在病毒感染、复制中的生物学功能；pUL49可能与宿主细胞哪些蛋白分子相互作用等。方法将HCMVA接种生长良好的人胚肺成纤维细胞(HELF),抽提病变细胞中的病毒RNA;以SMART RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)技术扩增UL49的5’和3’末端,TA克隆两类RACE产物,测序；用RT—PCR扩增UL49全长cDNA序列。获取Genebank公布的UL49编码氨基酸序列,用在线软件对其Hopp&Woods亲水性、可及性、极性及柔韧性、Welling抗原性和二级结构等参数法进行分析,用吴玉章等建立的B细胞表位预测法综合评价；以化学方法对预测片断进行多肽合成、纯化、与载体血兰蛋白(KLH)联接；将多肽-血兰蛋白化合物(免疫原)免疫新西兰大白兔,获得兔免疫血清后,用ELISA测定效价；构建HCMV UL49大片断(aa3-246)原核表达载体pGEX-4T-3-UL49A,诱导表达pUL49A-GST融合蛋白；构建HCMV UL49全基因真核表达载体pCDNA3.1-UL49-myc,瞬时表达pUL49-myc融合蛋白；以包装成功的HCMV-Towne病毒株感染HFF细胞,收集7天后的培养上清液,以anti-HCMV pUL49为一抗进行上述叁种样本Western blotting实验。以RV-Towne感染HFF,收集3、6、12、24、48、72、96、120hr后细胞裂解液,以anti-HCMV pUL49、anti-IE (CMVpp72/86)、anti-E (CMVgB/CH28)、anti-LA (CMVpp28/CH19)分别对细胞裂解上清液进行WB；收集接近100%细胞病变的HFF[RV-Towne]培养上清液(病毒颗粒),于58750×g、4℃离心纯化病毒,分别用Triton X-100、Trypsin预处理并4℃、100000g离心,以可溶混合上清液、不溶蛋白部分分别进行Western blotting。用试剂盒抽提、纯化重组人巨细胞病毒Towne基因组(Towne-BAC)、delUL49 Towne基因组(delUL49 Towne-BAC),构建pcDNA3.1(+)-UL82表达质粒；将Towne-BAC、delUL49 Towne分别与pcDNA3.1 (+)-UL82共转HFF,将Towne-BAC、delUL49 Towne分别与pcDNA3.1 (+)-UL82、pcDNA3.1 (+)-UL49共转HFF,培养病毒、观察细胞病变；以RV-Towne感染HFF,收集3、6、12、24、48、72、96、120hr后细胞,分别用Hochest33258、anti-HCMVpUL49、anti-E、anti-LA进行细胞免疫影像实验,荧光显微镜下观察、影像合成定位分析；将纯化的重组病毒与anti-pUL49抗体经37℃预处理0.5hr后,以1 PFU／cell量感染HFF细胞,收集1-7天的病毒细胞上清夜,再观察其生长状况；将上述预处理RV-Towne以1 PFU／cell量感染HFF细胞,收集1、3、6hr的病毒感染细胞,抽提总染色质DNA,以连续稀释后的总染色质DNA为模板,PCR扩增RV-Towne特异基因IE1序列,半定量分析RV侵入细胞的量。扩增UL49全序列,克隆入pGBKT7,将pGBKT7-UL49转化到酵母细胞AH109,用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应；将人胚肾细胞cDNA文库与pGBKT7-UL49共转AH109,于营养缺陷型培养基中筛选阳性克隆,按文献将阳性克隆酵母作β-半乳糖苷酶活性测定；将酵母质粒电转DH5α,抽提质粒,设计文库插入片段上游引物,对双杂交阳性且β-半乳糖苷酶阳性细菌质粒的AD插入片段进行PCR；将非重复克隆细菌质粒的AD插入片段PCR扩增产物进行HaeⅢ酶切,将非重复克隆质粒进行测序,通过Genebank同源性搜索和序列比对分析；选取同源性搜索和序列比对分析后的基因重复酵母双杂交及其β-半乳糖苷酶活性实验；扩增CYB5D2、C11ORF17、COL3A1、UCHL3因片断,构建其pGEX4T-3的表达质粒,构建pCDNA3.1(+)-UL49真核表达质粒；用IPTG诱导细菌表达CYB5D2、C11ORF17、COL3A1、UCHL3的GST融合蛋白,瞬时表达pUL49蛋白,按文献将pUL49分别与CYB5D2、C11ORF17、COL3A1、UCHL3的GST融合蛋白进行GST-pull down；构建pCDNA3.1(+)-COL3A1、pCDNA3.1(+)-C11ORF17真核表达质粒,分别瞬时转染HFF细胞,以1.0PFU/cell量感染上述两组细胞,收集感染1-7后的细胞培养上清夜进行病毒生长实验。结果HCMVA在体外成功感染HELF,感染的HELF中有HCMV的IE1和LA标志性基因；用SMART RACE技术从病毒RNA中获得UL49基因的5’和3'UTR,分别克隆后测序,UL49基因5'UTR长90bp、3'UTR长315bp；RT-PCR扩增获得2118bp的UL49基因全长cDNA序列,其开放读码框编码570个氨基酸。多种预测法重复了人巨细胞病毒pUL49蛋白的N端第228～243位氨基酸区域内或附近,该区域含有β转角和无规卷曲结构；化学方法合成得到了该区域氨基酸序列KRFDARADLAVY-KLH的免疫原；获得免疫兔血清,ELISA测定效价达1：8000以上；以此anti-HCMV pUL49为一抗得WB实验显示pUL49A-GST融合蛋白、pUL49A-myc融合蛋白、HFF[RV-Towne]细胞蛋白裂解液均显示蛋白条带,其分子量与理论值吻合。RV-Towne感染HFF在12hr后,pUL49开始出现表达,至RV-Towne感染96hr达峰值,与典型的HCMV时相基因pp72／86、gB、pp28的表达对照,类似gB蛋白时相；用细胞表面活性剂TX-100以及蛋白胰酶对纯化病毒进行不同处理后,pUL49与pp28的WB实验结果一致,而与gB存在明显差异。成功构建pcDNA3.1(+)一UL82.pcDNA3.1(+)-UL49；Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转15天后可见绿色荧光,delUL49 Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转30天后仍未见绿色荧光；Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82、pcDNA3.1(+)-UL49共转15天后也可见绿色荧光,delUL49 Towne-BAC与pcDNA3.1(+)-UL82共转20天后方见绿色荧光,至30天后荧光强度仍较Towne-BAC的结果相距甚远；病毒感染HFF细胞过程中,pUL49出现时间与蛋白表达出现时间一致,均出现于12hr,影像显示pUL49定位于细胞质而非细胞核,且在细胞感染24hr内显现均匀散布状,而后渐成聚集状,定位于核外边界某一点状区域、且量逐渐增多；以早期表达蛋白gB、晚期表达蛋白pp28为对照,pUL49与pp28在72、96hr存在共定位,而与gB虽然在24、72、96hr均出现表达影像,但未发现两者之间的共定位；经anti-pUL49预处理的重组病毒在感染前2天与未经处理的病毒出现近1个数量级的生长差异,两者在其后的差异均在1个数量级内,差异并不明显；anti-pUL49预处理的病毒在感染侵入阶段(1-6hr),RV-Towne特异基因IE1序列PCR扩增产物与未经anti-pUL49预处理的病毒差异不显着。克隆成功pGBKT7-UL49并成功转化到AH109,AH109[pGBKT7-UL49]表达诱饵蛋白pUL49,pUL49对转化细胞无细胞毒性、无自激活；酵母双杂交筛选得到30个SD／-Trp-Leu-His-Ade阳性且β-半乳糖苷酶阳性克隆,PCR、HaeⅢ酶切鉴定结果显示11个非重复克隆质粒；其中4个基因重复酵母双杂交及其β-半乳糖苷酶活性,显示C11ORF17、COL3A1表达蛋白与pUL49间的相互作用相对较强；诱导细菌表达pGEX4T-3-CYB5D2、pGEX4T-3-C110RF17、pGEX4T-3-COL3A1、pGEX4T-3-UCHL3的GST融合蛋白与pUL49瞬时表达蛋白相互对应的GST-pull down,结果显示C11ORF17、COL3A1出现条带呈现阳性结果,而CYB5D2、UCHL3未出现条带；pC11ORF17表达的宿主细胞实验组重组病毒生长受到一定抑制,而pCOL3A1表达的宿主细胞实验组重组病毒生长与未处理组无显着差异。结论在体外HCMVA感染过程中,UL49的mRNA存在表达,其cDNA序列全长共2118bp,其中5'UTR长90bp,3'UTR长315bp,UL49开放阅读框编码570个氨基酸。多种预测法重复了pUL49蛋白的N端第228-243位氨基酸区域内或附近为B细胞识别区；用化学合成得到KRFDARADLAVY-KLH免疫原,获得效价高、特异性强的兔anti-HCMV pUL49抗血清。人巨细胞病毒UL49开放阅读框编码蛋白在病毒感染过程中存在表达,且pUL49为早期表达蛋白；pUL49与pp28对TX-100、蛋白胰酶的耐受相近,暗示两者定位于病毒颗粒同一区域(皮层)pUL49为Towne的生长必需基因；在表达pUL49的HFF细胞中,缺失UL49的Towne能部分得到回复生长；病毒感染过程pUL49定位于细胞质而非细胞核,随感染时间的持续有被招募于宿主细胞特定区域的趋势；pUL49与pp28在72、96hr存在共定位,暗示pUL49在感染晚期定位于细胞内质网；在病毒增殖过程中,anti-pUL49影响了病毒生长速度,但在感染过程中,未影响病毒的侵入环节。成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7-UL49,经双杂交系统筛选,成功获得11个非重复克隆质粒；其中C110RF17、COL3A1表达蛋白与pUL49间的相互作用相对较强；GST-Pull down验证了该两个蛋白与pUL49的体外相互作用；pUL49与pC110RF17的相互作用可能影响病毒的增殖与生长,而pUL49与pCOL3A1的相互作用对病毒的增殖与生长基本无影响。
参考文献：
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