康玉[1]2006年在《可控性树突状细胞活疫苗诱导抗卵巢癌免疫应答的实验研究》文中研究表明肿瘤活疫苗的抗肿瘤免疫效应远强于死疫苗，但目前尚未能应用于肿瘤的临床治疗，主要原因之一在于其进入体内后的致瘤性问题。本研究将自杀基因系统引入肿瘤活疫苗，籍此来控制活疫苗在体内的活性，以期研究开发一种高效而且安全的肿瘤疫苗。本课题分为以下叁个部分进行研究：第一部分可控性树突状细胞活疫苗的制备及其免疫生物学特性的鉴定目的：制备可控性大鼠卵巢癌／树突状细胞(Dendritic cell，DC)活疫苗并检测其免疫生物学特性。方法：1．分离大鼠Fischer344骨髓前体细胞，在rrGM-CSF和rrIL-4的联合作用下，培养、扩增大鼠骨髓来源DC：2．以逆转录病毒为载体将自杀基因——Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV_1-tk)基因转导入大鼠卵巢癌细胞株NuTu-19，并经过G418筛选获得阳性克隆NuTu-19／TK；3．以聚乙二醇法将DC与NuTu-19／TK融合制成卵巢癌／DC活疫苗，活疫苗经30 Gy~(60)Co照射后作为死疫苗。4．分别从形态学(光镜、电镜、激光扫描共聚焦显微镜)、免疫原性相关表型(流式细胞仪)、基因表达(RT-PCR、Western blot)、增殖和凋亡(MTT法、流式细胞仪)以及免疫功能(混合淋巴细胞反应、细胞毒性T淋巴细胞反应)等方面研究此活疫苗的免疫生物学特性。结果：1．每只Fischer344大鼠可收获约5×10~7个DC。培养第10天的DC呈典型的细而长的树枝状突起，高表达表面分子MHC-Ⅱ(OX6)、共刺激分子B7-2、整合素OX62和粘附分子ICAM-1，能有效地刺激T细胞增殖；2．RT-PCR和Western blot结果显示NuTu-19／TK中有HSV_1-tk基因稳定表达；3．细胞融合率为(23.4±13.8)％，融合细胞呈典型的双阳性表现；活疫苗表达HSV_1-tk基因，高表达表面分子OX6、B7-2、OX62和ICAM-1；死疫苗的表面分子表达降低(P＜0.05)，失去增殖能力，凋亡率显着升高(P＜0.01)；与死疫苗相比，活疫苗能明显刺激T细胞增殖，对亲本肿瘤细胞NuTu-19有显着的杀伤作用(P＜0.01)。结论：卵巢癌／DC活疫苗在体外实验中可诱导产生有效的抗肿瘤免疫效应，为进一步的体内实验提供了实验基础。第二部分可控性树突状细胞活疫苗诱导抗卵巢癌免疫保护和免疫治疗作用目的：研究可控性DC活疫苗诱导抗卵巢癌免疫保护和免疫治疗作用。方法：1．乳酸脱氢酶释放法检测经过活疫苗免疫的大鼠脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对NuTu-19细胞的杀伤作用。2．在体内免疫保护实验中，实验大鼠分为活疫苗组、活疫苗+羟甲基无环鸟苷(GCV)组、死疫苗组、单用GCV组和PBS对照组。各组大鼠分别经二次免疫后，给予NuTu-19细胞攻击。一周后，活疫苗+GCV组和单用GCV组再予腹腔注射GCV。NuTu-19细胞攻击后90天终止实验。观察肿瘤出现时间、肿瘤大小。分别计算实验各组抑瘤率、病理形态学检测、流式细胞仪检测各肿瘤组织的细胞凋亡情况。3．在体内的免疫治疗实验中，每只大鼠先皮下接种NuTu-19细胞，一周后将荷瘤大鼠分组，分别给予二次活疫苗、活疫苗+GCV、死疫苗、单用GCV或PBS处理。接种NuTu-19细胞后90天终止实验。观察肿瘤形成及肿瘤大小，取瘤称重并作光镜及流式细胞仪检测。结果：1．经活疫苗免疫的大鼠脾CTL对NuTu-19细胞的杀伤活性比PBS对照组显着增高(P＜0.01)，并强于经死疫苗免疫者(P＜0.05)。2．免疫保护实验结果表明，与PBS对照组相比，经活疫苗免疫后大鼠的肿瘤发生率降低；成瘤时间延迟；肿瘤体积缩小(P＜0.01)，其作用强于死疫苗组(P＜0.05)。活疫苗组抑瘤率可达83.02％，而死疫苗组仅25.47％，差异有显着性意义(P＜0.01)。活疫苗组肿瘤组织有大片坏死灶及大量淋巴细胞浸润；肿瘤组织的凋亡率明显高于对照组(P＜0.05)。3．免疫治疗实验结果表明，与PBS对照组相比，活疫苗治疗组大鼠的平均肿瘤体积明显缩小(P＜0.01)。活疫苗组抑瘤率可达86.24％，而死疫苗组仅34.39％，差异有显着性意义(P＜0.01)。活疫苗组肿瘤组织出现大片状坏死样结构及团簇样淋巴细胞浸润；肿瘤组织的凋亡率明显高于对照组(P＜0.05)。结论：与死疫苗相比，卵巢癌／DC活疫苗能显着提高大鼠CTL杀伤活性，诱导更强的抗卵巢癌免疫保护和免疫治疗作用。第叁部分可控性树突状细胞活疫苗的安全性研究目的：研究可控性DC活疫苗在体内外被灭活的可行性。方法：1．在体外实验中，以MTT法检测GCV对活疫苗的杀伤作用；以流式细胞仪和Hoechst染色法检测GCV作用7天后活疫苗的凋亡现象。2．在体内实验中，大鼠经足垫皮下接种活疫苗后分为两组：活疫苗+GCV组大鼠再予GCV腹腔注射7天；活疫苗+生理盐水组作为对照组。接种活疫苗后观察90天，记录注射部位有无肿瘤形成及各脏器的肿瘤转移情况。3．将活疫苗以荧光染料标记后进行大鼠体内示踪，一组大鼠再予腹腔注射GCV 7天，另一组腹腔注射生理盐水。采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP缺口末端标记技术，对大鼠淋巴组织的冰冻切片作原位细胞凋亡检测，以了解进入体内的活疫苗的凋亡情况。结果：1．在体外GCV对活疫苗的杀伤作用有时间依赖性和剂量依赖性；浓度为100μg／ml的GCV对活疫苗的杀伤率可达88.42％；大于80％的活疫苗发生凋亡，显现细胞核浓缩，边集等现象。2．活疫苗+生理盐水组共有3／5的大鼠注射部位出现低分化腺癌，其中一只有淋巴结和肺部肿瘤转移；而活疫苗+GCV组未见肿瘤形成及转移。3．荧光显微镜下见经红色荧光标记的活疫苗出现在大鼠脾脏，进一步原位细胞凋亡检测显示活疫苗已为凋亡细胞。结论：HSV_1-tk／GCV通过诱导肿瘤活疫苗发生凋亡而起到控制其体内外存活状态的作用。总结：携带有自杀基因的卵巢癌／DC融合活疫苗具有高效的抗肿瘤免疫保护和免疫治疗作用，并可经HSV_1-tk／GCV系统有效控制疫苗的存活状态，从而增强肿瘤疫苗的安全性。
张峰琴[2]2007年在《以树突状细胞为介导的卵巢癌特异性免疫治疗的实验研究》文中研究说明目的:为对比研究各种卵巢癌抗原HS-exosomes致敏树突状细胞介导的卵巢癌特异性的免疫治疗效果,制备卵巢癌exosomes、HS-exosomes、热休克蛋白、冻融抗原。方法:采用超速、梯度离心法从卵巢癌A2780、SKOV3细胞培养上清液中分离纯化肿瘤细胞分泌的HS-exosomes、Exosomes;采用透射电镜观察其超微结构;用冻融法制备肿瘤冻融抗原(frozen tomor antigen,FTA);用经43℃热处理5小时的卵巢癌细胞,制备细胞裂解液,利用层析分离纯化出热休克蛋白,经电泳及Western-blot进行蛋白分子定量。结果:制备的exosomes与HS-exosomes经电镜鉴定为:它是一类直径大约30-90nm的双层膜性囊泡小体,对照文献可确定为exosomes与HS-exosomes。热休克的卵巢癌细胞的裂解液纯化后经鉴定含有相对分子量为70Kd的HSP70蛋白。结论:从经热休克处理或未经热休克处理的卵巢癌细胞培养上清液中均能分离纯化出直径大小为30-90nm的双层膜性囊泡样小体,经电镜鉴定从中分离的小体具有exosomes小体典型的形态特征,我们将经热休克处理后卵巢癌细胞分泌的小体归类为HS-exosomes小体,而未经热休克处理的卵巢癌细胞分泌的小体归类为exosomes小体。同时经热休克处理的卵巢癌细胞裂解液中富含HSP70。目的:对比研究卵巢癌抗原致敏树突状细胞的功能及其在体外诱导细胞毒性T淋巴细胞CTL特异性杀伤卵巢癌细胞的效果。方法:取健康志愿者外周血,密度梯度离心分离单核细胞(PMBC),用GM-CSF、IL-4等细胞因子刺激刺激,培养大量DC,在其培养体系中分别加入exosomes、HS-exosomes、热休克蛋白、冻融抗原,制备负载抗原的DC(Ag-DC),用ELISA法对Ag-DC和未被修饰DC培养上清液的IL-12、TNF-α含量进行检测;从外周血中获取T淋巴细胞,诱导增殖CTL,加入Ag-DC,用MTT法检测抗原致敏DC诱导T细胞增殖的能力;将健康人外周血单个核细胞通过PHA、IL-2、抗CDS单抗、IFN刺激,诱导分化制备大量的LAK、CDSAK、CIK细胞。将LAK、CDSAK、CIK、T淋巴细胞分别与Ag-DC混合培养,诱导的LAK、CDSAK、CIK、CTL细胞作为效应细胞,按效靶比为25:1的比例将效应细胞加入到靶细胞(A2780、SKOV3)培养体系中,利用乳酸脱氢酶(LDH)4小时释放法测定效应细胞对靶细胞的杀伤活性。结果:从健康外周血获得的PMBC,经GM-CSF、IL-4刺激培养7d后,电镜下观察细胞为不规则形,细胞表面粗糙突起明显,细胞核呈肾形和马蹄形,经FCM鉴定,可确定为DC。ELISA法对抗原修饰的DC和未被修饰DC上清液的IL-12、TNF-α含量进行检测,结果表明:所观察的四种抗原均能致敏DC,经致敏的DC所分泌的IL-12和TNF-α的量均显著增加,其中以HS-exosomes-DC分泌的细胞因子量为最高,经卵巢癌抗原冲击致敏DC刺激T细胞增殖的强度,显着高于未致敏DC(p<0.01);HS-exosomes-DC刺激T淋巴细胞增殖强度与其它叁组抗原致敏DC刺激T淋巴细胞增殖强度相比有显着性差异,(p<0.05);而抗原致敏DC、热休克蛋白-DC、Exosomes-DC叁组间相比较对刺激T淋巴细胞增殖无显着性差异(p>0.05)。四种卵巢癌细胞抗原致敏DC诱导的DC-CTL对同种卵巢癌细胞均表现出较强的杀伤活性,但以HS-exosomes-DC诱导的DC-CTL的杀伤活性最强,与冻融抗原-DC相比有差异P<0.05,而与Exosomes-DC-CTL、热休克蛋白-DC-CTL两组之间无明显的差别,未激化T淋巴细胞对卵巢癌细胞无杀伤作用。结论:本研究制备的四种卵巢癌四种抗原在体外均能致敏DC,致敏DC分泌的IL-12和TNF-α细胞因子及刺激T细胞增殖等功能均显着提高,而且致敏DC诱导的CTL杀瘤活性也显着高于未致敏DC诱导的CTL杀瘤活性,制备的4种卵巢癌抗原致敏DC的功能强度存在一定的差异。
杨晓东[3]2017年在《EpCAM蛋白激活DC诱导抗原特异性CTL治疗卵巢癌的实验研究》文中研究指明目的探讨Ep CAM蛋白激活树突细胞(DC)诱导产生CD8+细胞毒T淋巴细胞(CD8+CTL)进行卵巢癌免疫治疗的效果,为卵巢癌的临床治疗提供帮助。方法利用Ep CAM蛋白诱导成熟DC同时检测DC表面分子和白介素(IL-10与IL-12)表达量的变化,随后通过Ep CAM-DC诱导Ep CAM抗原特异性CD8+CTL,继而检测Ep CAM-DC-CD8+CTL对正常卵巢上皮细胞IOSE80和卵巢癌细胞SKOV3的杀伤效果,同时检测干扰素(IFN)-γ释放量。随后进一步检测Ep CAM-DC-CD8+CTL对卵巢癌移植裸鼠的肿瘤抑制效果,并通过病理学染色比较治疗前后肿瘤组织变化情况。结果与PBS刺激相比,Ep CAM蛋白能够显着上调DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR水平,依次达到4.79、4.85、4.60和10.91倍;同时Ep CAM蛋白显着提高IL-12释放和显着抑制IL-10分泌(P<0.05)。DC-CD8+CTL与Ep CAM-DC-CD8+CTL均引起少量IOSE80细胞凋亡(P>0.05),但Ep CAM-DC-CD8+CTL对SKOV3细胞杀伤率是DC-CD8+CTL的6.82倍(P<0.05)。动物实验表明,经Ep CAM-DC-CD8+CTL治疗后,BALB/C-nu/nu卵巢癌移植肿瘤体积比明显低于PBS组以及DC-CD8+CTL组,分别达到0.27和0.28倍(P<0.05)。HE染色显示Ep CAM-DC-CD8+CTL治疗导致肿瘤组织出现明显的病理学改变。结论Ep CAM蛋白刺激促进了DC成熟继而诱导产生Ep CAM特异性CD8+CTL,Ep CAM-DC-CD8+CTL能够高效的杀伤肿瘤细胞并延迟肿瘤生长,对卵巢癌临床免疫治疗具有重要意义。
杨光[4]2001年在《卵巢癌免疫治疗的实验研究》文中研究说明卵巢癌在女性恶性肿瘤中死亡率居于第一位，其中最常见的上皮性卵巢癌5年生存率长期停留在30％左右，其原因是手术及化疗后复发率很高、易出现耐药。开展针对卵巢癌肿瘤抗原的免疫治疗对提高患者的5年生存率具有重要的意义。P185~(erbB2)在约30％的卵巢癌患者中过度表达，并与患者的预后不良，易出现复发、耐药有关。抗P185~(erbB2)抗体被证明具有下调P185~(erbB2)表达水平的作用。因此，本文首先研制了抗P185~(erbB2)嵌合抗体用于P185~(rebB2)过度表达的卵巢癌的免疫治疗。 应用P185~(erbB2)过度表达的SKBR_3细胞免疫BALB／c小鼠，采用P185~(erbB2)胞外区重组蛋白以ELISA方法筛选杂交瘤阳性克隆，获得了10株单克隆抗体。通过采用固相竞争放射免疫方法分析这10株抗人P185~(erbB2)单抗的抗原表位、亲合力，ELISA，细胞ELISA、Western Blot、免疫组化等方法鉴定抗原识别的特异性，以及体外对P185~(erbB2)过度表达的SKOV3和SKBR_3肿瘤细胞增殖的抑制，从中筛选出一株具有较高亲和力、可特异性地识别天然的P185~(erbB2)胞外区抗原并具有抑制P185~(erbB2)过度表达的肿瘤细胞增殖的生物活性的单抗C25。进一步的体外实验表明，C25单抗以剂量依赖方式特异地抑制P185~(erbB2)过度表达的卵巢癌细胞的增殖，其抑瘤效果与Herceptin的亲本鼠单抗相似，远好于商品单抗L87。并且C25单抗在体外与卵巢癌一线化疗药物联合应用对卵巢癌细胞增殖的抑制实验结果显示，C25单抗与顺铂联合具协同作用，与泰素具相加作用。通过对细胞周期的分析发现C25单抗对卵巢癌细胞增殖的抑制主要是通过G1期阻滞而实现的。应用C25单抗对人卵巢癌裸鼠移植瘤
张辉[5]2005年在《晚期卵巢癌多药耐药的免疫逃逸机制以及CIK细胞实验性治疗的基础与临床研究》文中研究指明目的:卵巢癌发生率占妇科恶性肿瘤的23~27%,10 年生存率在4.0~20.0%,是妇科肿瘤病人的第一位死亡原因,大部分患者发现时已属晚期,其转移途径主要为直接蔓延及腹腔种植,广泛的盆腹腔种植转移使手术难以切除干净。目前其治疗方法虽多,但5 年生存率尚无明显改善,其中一个重要原因就是卵巢癌化疗过程中多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的产生,引发MDR 的耐药蛋白,往往随着化疗的用药过程过度表达,造成化疗药物不能进入其作用靶点-细胞核,而导致化疗失败,顺铂(CDDP)耐药就是卵巢癌患者化学治疗中颇为棘手的问题之一。卵巢癌临床耐药的产生与多种耐药相关基因的共表达有关,共同表达是耐药相关基因受共同因子调控的证据,从一个侧面反映了多药耐药机制的复杂性,这也是卵巢癌多年来化疗未取得实质性进展的重要原因,只有通过多基因的联合检测,才能更客观全面的筛选针对不同耐药机制的高效低毒药物,指导个体化治疗,同时对前瞻性优化药物、预测药物敏感性和判断疗效具有重要的临床应用价值。目前围绕其展开的研究大都以肿瘤原发病灶为主要研究对象,而晚期卵巢癌则是以广泛腹腔内癌和大量腹水形成为特征,其术后辅助化疗主要目的是清除微小转移灶,但转移灶是否与原发灶癌组织耐药基因的表达存在差异还不清楚,了解耐药基因在原发灶和转移灶肿瘤细胞中表达的差异,对晚期卵巢癌患者治疗方案的选择和逆转措施的实施具有重要的指导意义。近年来有关多药耐药性肿瘤免疫反应特点的研究倍受关注,国内外研究显示多药耐药细胞比敏感细胞更容易逃避机体的免疫识别和攻击。人类白细胞抗原(HLA)和共刺激分子B7 表达的降低可能是卵巢癌细胞逃避机体免疫监视的主要原因,且耐药亚株的共刺激信号B7 表达高于亲本敏感株,免疫效应细胞对MDR 肿瘤细胞的杀伤活性高于对其亲代药物敏感肿瘤细胞系, 提示MDR 发生后,机体的免疫监视功能有重新被激活的可能
孙丽[6]2007年在《Rsf-1/HBXAP基因转导的树突状细胞体外抗卵巢癌效应的实验研究》文中研究说明【研究背景与目的】据美国的最新癌症统计，在女性恶性肿瘤死亡原因中，卵巢癌排名第四位，死亡率居首位。由于缺乏有效的早期筛查手段，70％的卵巢癌患者就诊时已届晚期。虽然近20年来在卵巢癌治疗方面取得了长足的进展，卵巢癌手术技巧不断提高，新型化疗药物、化疗方案亦陆续投入临床使用，但这些传统的治疗手段均未能显着改善患者长期生存率，70％的晚期卵巢癌患者最终复发并死于癌症。因此寻找特异性强、敏感性高的卵巢癌相关抗原，并探索有效的综合治疗方法具有重要的临床意义。近年来，以基因和免疫治疗为代表的生物治疗作为肿瘤治疗的第四模式日益受到重视，作为晚期卵巢癌治疗的重要辅助手段之一，生物治疗已逐渐显示出其独特的优越性。最近研究发现：位于11q13.5的RSf-1／HBXAP基因的扩增在分子遗传学、转录分析、临床预后和功能表达等方面与卵巢、乳腺、头颈部等恶性肿瘤的发生密切相关。Rsf-1／HBXAP基因在肿瘤发生发展中对基因扩增与染色质调节起一定的作用。Rsf-1／HBXAP基因过表达参与刺激细胞增殖和恶性转化过程，而基因敲除抑制卵巢癌细胞的生长和扩增。Rsf-1／HBXAP基因在卵巢癌细胞系中高表达，在卵巢癌病人腹水细胞中表达上调，并与预后相关。因此，Rsf-1／HBXAP基因有望成为卵巢癌免疫生物治疗的靶点。肿瘤的细胞免疫主要是T细胞免疫，依赖于有效的抗原递呈。树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内功能最强的唯一能够激活初始型T细胞的抗原递呈细胞，是启动、调控并维持免疫应答的中心环节，因此利用DC在患者体内建立起肿瘤特异性的、持久的免疫应答，是目前将DC肿瘤疫苗用于治疗恶性肿瘤的基础，也是一种有应用前景的肿瘤免疫治疗的新方法。人类肿瘤抗原与DC结合成为肿瘤特异性主动性免疫治疗的手段之一。基于以上报道，本研究以Rsf-1／HBXAP基因作为修饰DC疫苗的靶点进行卵巢癌基因及免疫治疗的实验研究。我们设想通过基因转导使树突状细胞表达Rsf-1／HBXAP抗原，由它诱导的CTL是否可以对表达Rsf-1／HBXAP基因的卵巢癌细胞产生特异的杀伤活性。因此本研究首先探讨Rsf-1／HBXAP基因是否确实在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中特异性表达，其次构建了Rsf-1／HBXAP基因与绿色荧光蛋白的重组真核表达载体，并将其转染到脐血来源的树突状细胞中，研究其是否能诱导特异的可识别Rsf-1／HBXAP~+卵巢癌细胞的细胞毒性T淋巴，并产生有效的杀伤效应。第一部分Rsf-1／HBXAP基因在人卵巢癌组织及细胞系中的表达及意义【目的】研究卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中Rsf-1／HBXAP基因的表达情况，以明确Rsf-1／HBXAP是否在卵巢癌组织中特异性表达，并探讨其在卵巢癌发生发展中的作用。【方法】采用Real-time PCR技术检测Rsf-l／HBXAP在40例卵巢癌组织、9例交界性卵巢肿瘤及24例良性卵巢肿瘤及12例正常卵巢组织中mRNA的表达及8个常见卵巢癌细胞系及对照细胞人胚肾细胞HEK293中进行RSf-1／HBXAP基因表达的筛查。免疫组化技术检测Rsf-1／HBXAP基因在30例卵巢癌组织、10例交界性及20例良性卵巢肿瘤及8例正常卵巢组织中Rsf-1／HBXAP蛋白表达及定位。【结果】Rsf-1／HBXAP在卵巢癌组织尤其是浆液性卵巢癌中高表达，在卵巢交界性和良性肿瘤低表达，而在正常卵巢组织不表达。Rsf-1／HBXAP基因表达定位为细胞核，为核蛋白；上皮浆液性卵巢癌的表达水平明显高于其他来源及其他类型的卵巢癌组织；随临床分期的增加或分化程度的降低及淋巴结转移，Rsf-1／HBXAP的表达有递增趋势，差别具有统计学意义。8个常见卵巢癌细胞系SKOV-3，OVCAR-3，3AO，A2780，A549，TOV-112D，HRA和Caov-3中，Rsf-1／HBXAP均呈阳性表达，人胚肾细胞HEK293中不表达。【结论】Rsf-1／HBXAP基因高度表达于上皮性卵巢癌组织中，尤其是浆液性卵巢癌，与卵巢癌的临床分期、分化程度及淋巴结转移密切相关，提示其在卵巢癌的发生发展中可能起重要作用，并有望成为卵巢癌基因及生物治疗的理想靶点。第二部分Rsf-1／HBXAP基因重组真核表达载体的构建及在人胚肾细胞293中的稳定表达【目的】构建含有Rsf-1／HBXAP基因全长cDNA的绿色荧光蛋白的重组真核表达载体，并在人胚肾细胞HEK293中稳定表达。【方法】选用合适酶切位点用限制性内切酶HindⅢ和SacⅡ从pcDNA．6／V5-B载体上切下含Rsf-1／HBXAP基因全长cDNA的片段，并与pMD18-T载体连接，挑选阳性克隆经鉴定后测序。用HindⅢ和SacⅡ酶切位点将Rsf-1／HBXAP基因亚克隆至真核表达载体pEGFP-C1中，经限制酶酶切鉴定，命名为pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP；采用脂质体法转染人胚肾细胞HEK293，G418加压筛选，并通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，应用Western blot及RT-PCR技术，分别从蛋白水平和mRNA水平鉴定稳定转染后的HEK293细胞中Rsf-1／HBXAP的表达情况。【结果】含人Rsf-1／HBXAP全长cDNA的片段用限制性内切酶HindⅢ和SacⅡ从pcDNA．6／V5-B载体上切下，经测序与已知序列完全相符。采用相同的酶切位点，将其插入pEGFP-C1真核表达质粒EGFP中的N端，使二者位于同一ORF中，最终可表达融合蛋白，经HindⅢ和SacⅡ双酶切鉴定证实连接正确；转染HEK293细胞18小时后便可在倒置荧光显微镜下看到细胞核表达的绿色荧光，并在蛋白及mRNA水平检测到Rsf-1／HBXAP的表达，而转染空载体的HEK293细胞绿色荧光位于胞浆，且无Rsf-1／HBXAP的表达；通过G418筛选建立稳定表达Rsf-1／HBXAP的HEK293-Rsf-1细胞株。【结论】pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP真核表达载体构建成功，Rsf-1／HBXAP与EGFP的融合并未影响其基因的亚细胞定位，这为进一步研究该基因的功能以及制备以Rsf-1／HBXAP为基础的卵巢癌疫苗奠定了实验基础。第叁部分Rsf-1／HBXAP基因转导的树突状细胞诱导体外抗卵巢癌免疫效应的实验研究【目的】研究Rsf-1／HBXAP基因转染人脐血来源的树突状细胞(dendritic cells，DCs)后，对DCs生物学功能的影响，同时探讨其体外是否能够诱导出可识别Rsf-1／HBXAP~+的卵巢癌细胞的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T cells，CTLs)，并对其产生特异性杀伤效应。【方法】采用淋巴细胞分离液自脐血分离获得单核细胞，体外经人重组细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-a、LPS诱导培养，获得DC，观察细胞形态，流式细胞技术(FACS)鉴定其表型；分别采用脂质体和原代细胞核转染技术将已构建好的含Rsf-1／HBXAP全长cDNA的真核表达载体pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP转染到未成熟DCs中，rhTNF-a及lipopolysaccharide(LPS)促DCs成熟。荧光显微镜下观察其蛋白定位，Western blot及RT-PCR法检测Rsf-1／HBXAP的蛋白和mRNA的表达：分别通过流式细胞技术、同种异体混合淋巴细胞反应(MLR)、OVA吞噬实验、Transwell Chemotaxis实验检测Rsf-1／HBXAP转染后对DCs表型、刺激T细胞增殖能力、对外来抗原摄取能力及迁移能力的影响；DC-Rsf-1／HBXAP与自体T细胞共培养四周后，ELISA法检测成熟DCs上清中IL-12的含量，收集效应细胞作为Rsf-1／HBXAP特异性的CTLs，通过ELISP0T和标准的~(51)Cr释放实验对CTLs进行功能鉴定，并检测其对卵巢癌细胞OVCAR3的特异性杀伤活性。【结果】成功诱导出人脐血来源的树突状细胞：采用原代细胞核转染技术转染未成熟DCs，转染效率达50％左右，其绿色荧光蛋白定位于细胞核，Western blot及RT-PCR结果示Rsf-1／HBXAP基因修饰DCs中Rsf-1／HBXAP表达阳性，而转染空载体及未转染的DCs为阴性表达；在同种异体混合淋巴细胞反应中，随成熟DC／T比例增加。T细胞增殖明显增多，当DC／T比例为1∶10时，叁组T细胞增殖活性均达到最高，其中DC-Rsf-1／HBXAP组与DC-pEGFP-C1组、未转染DCs组相比具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力(P＜0.05)，而DC-pEGFP-C1组、未转染DCs组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；促成熟及转染Rsf-1／HBXAP基因后DCs表面分子CD1a、CD86表达上调，叁组之间差异无统计学意义(P＞0.05)；与FITC标记的OVA共孵育后，流式细胞术检测叁组DCs的吞噬能力无明显差异；Transwell实验，叁组DCs的迁移能力无明显差异；Rsf-1／HBXAP基因修饰的DCs可刺激CTLs特异性地分泌IFN-γ，而未转染DCs和DC-pEGFP-C1均不能诱导CTLs分泌IFN-γ；Rsf-1／HBXAP基因修饰的DCs上清中IL-12含量高于未转染DCs和DC-pEGFP-C1。DC-Rsf-1／HBXAP体外诱导的CTLs可有效杀伤高表达Rsf-1／HBXAP的卵巢癌细胞株OVCAR3和稳定转染了Rsf-1／HBXAP基因的HEK293-Rsf-1细胞，但对转染空载体的HEK293-pEGFP及单纯的HEK293细胞无杀伤活性。【结论】采用原代细胞核转染技术可提高DCs的转染效率，转染Rsf-1／HBXAP基因后可在一定程度上提高DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力，而对其抗原递呈能力、内吞能力及迁移能力无明显影响；Rsf-1／HBXAP基因修饰的DCs可诱导抗原特异性的CTLs，并产生有效的对Rsf-1／HBXAP~+卵巢癌细胞的杀伤效应。综上所述，我们首先证实Rsf-1／HBXAP基因高表达于卵巢癌组织，尤其是浆液性卵巢癌及多数常见卵巢癌细胞系中，可以作为卵巢癌免疫生物治疗的一个候选靶点；随后成功构建了含人Rsf-1／HBXAP全长cDNA的真核表达载体pEGFP-C1／Rsf-1／HBXAP并将其导入DC，通过对转染后DC生物学功能的检测以及细胞毒杀伤实验，阐明Rsf-1／HBXAP基因可以在一定功能上提高DC刺激T细胞增殖的能力，但对抗原递呈能力、内吞功能和迁移能力均无明显影响；Rsf-1／HBXAP基因转导的CTL体外能够诱导出可特异性识别Rsf-1／HBXAP抗原的CTL，并产生针对Rsf-1／HBXAP~+卵巢癌细胞的杀伤效应。本研究将为以Rsf-1／HBXAP为基础的卵巢癌DC疫苗的体内研究和进一步的临床应用奠定必要的实验基础。
徐梅[7]2014年在《化疗联合CIK细胞治疗恶性肿瘤的相关研究及在卵巢癌临床治疗中的观察》文中认为卵巢癌发病隐匿，大部分患者就诊时已经是晚期，位居妇科肿瘤患者致死首位。结肠癌的发病率和死亡率也位居消化系统肿瘤首位。因此，它们都迫切需要寻找更有效的治疗手段。随着肿瘤免疫学和分子生物学的不断发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤的第四大治疗模式。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）兼具有强大的抗瘤活性和增殖活性，又具有非MHC限制性杀瘤的优点，近些年已经得到广泛关注并应用于多种实体瘤的临床治疗，但对卵巢癌治疗报道少见。本文首先通过体外实验研究顺铂（cis-Dichloro diamine in platinum，CDDP或DDP）、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应，接着通过体内实验研究氟尿嘧啶（5-FU）、CIK细胞及其联合对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用，初步探讨其作用机制。最后，回顾分析本中心6例CIK细胞治疗的卵巢癌患者临床资料，初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性及有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。第一部分DDP联合CIK细胞对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应目的：探讨DDP、CIK细胞及其联合对卵巢癌细胞株SKOV-3的杀伤效应并初步探讨其机制。方法：利用人外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）在体外用多种细胞因子诱导生成CIK细胞，于培养第0、7、14、21、28及35天进行细胞计数及流式细胞术分析CD3+CD56+双阳性细胞百分比；于培养14天收获CIK细胞作为效应细胞，用含有CIK细胞培养液上清的培养液培养对数生长期的SKOV-3细胞，于培养24及48小时用流式细胞仪检测SKOV-3细胞的凋亡情况，同时设正常培养的SKOV-3细胞作对照组；杀伤实验分为Ａ1~4CIK细胞作用组（效靶比分别为5:1、10:1、20:1、40:1）、B1~7DDP作用组（DDP浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml）及C1~2CIK联合DDP作用组（DDP浓度均为2.5μg/ml，效靶比分别为5:1和10:1）。同时设效应细胞和靶细胞作对照孔。于24h和48h采用MTT法检测各组对SKOV-3的生长抑制效应。结果：CIK细胞体外培养第0、7、14、21、28及35天细胞计数依次为（1.8±0.2）×107、（14.67±1.53）×107、（230.0±20.0）×107、（225.0±22.91）×107及（220.0±17.32）×107，细胞数于培养第2l天时约增加127.78倍，达到增殖高峰；CD3+CD56+双阳性细胞的百分含量依次为（0.47±0.17）%、（11.30±1.96）%、（35.50±2.30）%、（38.23±1.92）%、（31.40±3.91）%和（28.61±3.45）%，到21天也达到增殖高峰；SKOV-3与CIK细胞培养液上清共培养24h及48h后凋亡率分别为（12.30±1.47）%和（27.13±2.03）%，差异有统计学意义（P <0.05）。对照组24h及48h凋亡率分别为（0.62±0.35）%和（0.65±0.38）%，差异无统计学意义（P>0.05）；Ａ1~4CIK作用组24h抑制率分别为（16.52±2.52）%、（24.18±4.05）%、（35.98±5.19）%及（53.98±5.02）%，48h抑制率分别为（24.20±5.59）%、（41.23±3.64）%、（57.27±6.68）%及（74.74±6.87）%。在相同时间各组间细胞抑制率差异有统计学意义（P <0.05），相同效靶比24h和48h抑制率差异有统计学意义（P <0.05）；CIK细胞对SKOV-3细胞的抑制率随着效靶比的提高及作用时间的延长而提高；B1~7DDP作用组24h抑制率分别为（15.09±4.03）%、（25.95±3.36）%、（37.11±3.05）%、（50.07±5.21）%、（62.93±5.85）%、（77.93±3.28）%及（92.55±1.39）%，48h抑制率分别增为（23.42±5.63）%、（32.39±1.47）%、（46.04±2.76）%、（60.46±3.26）%、（72.77±2.38）%、（86.42±1.46）%及（96.24±0.59）%。除外DDP0.625μg/ml组24h和48h抑制率差异无统计学意义（P=0.102），其余各组差异均有统计学意义。DDP对SKOV-3细胞的抑制率也随着药物浓度的提高及作用时间的延长而提高；C1~2CIK联合DDP作用组24h抑制率分别为（50.50±3.69）%和（68.19±2.07）%，48h抑制率分别为（69.87±2.67）%和（80.11±6.87）%。CIK细胞联合DDP与单一处理因素相比，对SKOV-3的生长抑制率差异有统计学意义。但析因分析结果显示，低剂量组（效靶比为5:1）24h和48h抑制率未见到协同效应（P值分别为0.171和0.895），而高剂量组（效靶比为10:1）24h和48h抑制率见到协同效应（P <0.05）。结论：PBMC在体外经多种细胞因子刺激诱导下可大量扩增获得CIK细胞，其主要效应细胞（CD3+CD56+CIK）在第14~21天为高表达平台期，在此期间可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可明显增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用。第二部分氟尿嘧啶联合CIK细胞在小鼠结肠癌模型体内抗肿瘤效应的实验研究目的：探讨氟尿嘧啶（fluorouracil，5-FU）、CIK细胞以及5-FU联合CIK细胞对小鼠结肠癌移植瘤生长的作用。方法：建立BALB/C小鼠结肠癌模型，在体外诱导培养小鼠CIK细胞，于第0和7天进行流式细胞术CIK主要效应细胞表型分析。10只荷瘤鼠随机分两组，一组给5-FU（12.5mg/kg）当天腹腔注射，另一组给予NS（0.2ml/只）腹腔注射作对照，第十天采用流式细胞仪分析荷瘤鼠肿瘤组织中淋巴细胞细胞毒性T细胞活化抗原-4（cytotoxic T lymphocyte-activation antigen4，CTLA-4）和非淋巴细胞CD80、CD86表达。另取40只荷瘤鼠随机分成四组，A组（正常对照组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；B组（5-FU组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+NS（0.2ml尾静脉注射，d3）；C组（CIK组）：NS（0.2ml腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）；D组（5-FU+CIK组）：5-FU（12.5mg/kg腹腔灌注，d0）+CIK（1×107尾静脉注射，d3）。观察肿瘤生长并绘制肿瘤生长曲线，生存分析采用Kaplan-Meier法及log-rank检验。用药第10天各组处死5只小鼠，采用RT-PCR法检测四组肿瘤组织中IFN-γ和TNF-表达量。结果：小鼠CIK主要效应细胞在体外扩增第7天达到（18.4±6.8）%。与对照组相比，5-FU处理后小鼠移植瘤组织中CD45+细胞表面CTLA-4表达量提高，且CD45-细胞CD80和CD86表达量增加；5-FU联合CIK细胞治疗组小鼠肿瘤生长速度明显慢于单因素治疗组，差异有统计学意义（P <0.05）；5-FU联合CIK细胞治疗可提高肿瘤组织IFN-γ与TNF-表达量，且联合治疗组与单治疗组中IFN-γ的表达量之间的差异有统计学意义（P <0.05）。结论：5-FU联合CIK细胞治疗对结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用，且可提高BALB/C小鼠结肠癌模型的免疫功能。第叁部分化疗联合CIK细胞治疗卵巢癌的临床观察目的：初步探讨CIK细胞治疗卵巢癌的安全性和有效性，为卵巢癌探寻生物治疗策略。方法：利用接受常规手术和化疗结束后卵巢癌患者外周血分离出单个核细胞，在体外经多种细胞因子诱导培养出CIK细胞，流式细胞术分析其表型特征。将体外培养第14~21天的CIK细胞通过静脉回输给患者，流式细胞仪检测患者外周血淋巴细胞表型变化，回顾性观察6例接受CIK细胞治疗的卵巢癌患者资料，观察患者治疗前后卡式评分（Karnofsky performance score，KPS）差异、肿瘤指标差异、外周血T细胞亚群分布及治疗后相关毒副反应。结果：有5例治疗后KPS较治疗前明显提升，另外1例治疗后KPS保持不变。所有接受CIK细胞治疗的患者均未出现明显毒副作用。1例III期EOC患者手术联合化疗治疗后CA199升高，在接受CIK细胞治疗3个疗程后，CA199逐渐下降至正常。目前状况良好，肿瘤标记物和影像学随访没有肿瘤复发迹象，无瘤生存期（progression free survival，PFS）已达到3年。1例II期透明细胞癌合并浆液性癌患者，接受CIK细胞治疗2个疗程，PFS已接近4年，随访瘤标和影像学检查无肿瘤复发迹象。另外1例II期EOC患者接受8个疗程CIK细胞治疗后，PFS已达5年，目前状况良好，也没有肿瘤复发迹象。结论：CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生存质量，是一种有希望的治疗方法。综上所述，本文通过对化疗联合CIK细胞治疗肿瘤的基础研究和治疗卵巢癌病例的回顾分析，我们认为，CIK细胞可在体外经多种细胞因子刺激下诱导扩增，第14~21天可获得较为理想的效应细胞；CIK细胞可通过分泌细胞因子并诱导卵巢癌SKOV-3细胞凋亡发挥较强的杀伤作用；联合CIK细胞治疗可增强DDP对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用；5-FU联合CIK细胞治疗对BALB/C小鼠结肠癌移植瘤生长的抑制作用大于单独应用5-FU或CIK细胞，且可提高小鼠结肠癌模型的细胞免疫功能。CIK细胞治疗卵巢癌可改善患者的生活质量，是一种有希望的治疗方法。
邹文燕[8]2003年在《树突状细胞与卵巢癌的免疫治疗》文中研究指明卵巢癌是死亡率最高的妇科肿瘤。目前临床治疗主要采用手术结合化疗、放疗,但疗效仍不尽如人意。免疫治疗作为一种辅助性治疗手段,在卵巢癌的实验研究和临床应用中取得一定的效果。肿瘤免疫治疗第一步是抗原呈递细胞(APC)将肿瘤抗原呈递给T淋巴细胞,树突状细胞(DC)是专职的且功能最强的APC,因此,DC成为目前肿瘤免疫治疗研究的热点之一。对DC在卵巢癌免疫治疗方面的研究进展作一综述。
李奇灵[9]2006年在《腹水来源的外来体用于卵巢癌免疫治疗的实验研究》文中研究说明外来体(exosomes)是一种膜性脂类囊泡，直径30nm～90nm，可由多种细胞分泌，如B淋巴细胞、肥大细胞、不成熟DC、血小板、CTL、纤维原细胞、上皮细胞和肿瘤细胞。这些小囊泡来源于具有细胞膜的晚期多囊性的内涵体或溶酶体，这些细胞以胞吞的方式摄取外来抗原在细胞内形成多囊体(MVBs)，MVBs是一种复杂的胞内细胞器，由胞吞作用产生。细胞膜先内陷形成吞饮泡，吞饮泡的界膜再向内出芽，形成许多小泡，这种胞吞腔室即为MVB。胞吞的主要功能是对内化的大分子和膜蛋白进行分类，一部分经过MVB被转运到溶酶体降解。另一部分移向质膜，MVB的泡膜与质膜融合后释放小泡到胞外空间，这种小泡便是外来体。目前，从囊泡的形态、生化特点(蛋白、磷脂)和纯化过程来定义外来体。 最近发现，肿瘤细胞也可释放外来体，同时在肿瘤患者的腹水中也能分离出外来体，推测其来源于肿瘤细胞。肿瘤细胞释放的外来体能够包含和转移抗原给树突状细胞，提呈给T淋巴细胞，引起CTL效应。研究发现，外来体含有的成分如下：①抗原呈递相关分子：MHC-Ⅰ和Ⅱ类分子、HSC73、HSP70等；②免疫粘附及信号转导相关分子：ICAM-Ⅰ、CD58、CD9、CD86／B7．2、Mac-l、MFG-E8等：③其它功能蛋白：AnnexinⅡ、TfR、CD55、CD59、Gi2等。因此，外来体可能具有细胞毒性效应、免疫调节、诱导凋亡和免疫耐受诱导等作用。将其用于肿瘤免疫治疗的优点是：非细胞成分、体积小易清除、稳定性高、可按照GMP标准制备、可冷冻储藏等。 目前国内外关于卵巢癌患者的腹水中分离出外来体作为特异性抗原用于免疫治疗的研究较为少见，而运用脐血来源树突状细胞(DC)作为抗原
侯萍[10]2004年在《纽卡斯尔病毒疫苗、白细胞介素-12、15对人卵巢癌免疫治疗作用的实验研究》文中提出目的:研究纽卡斯尔病毒疫苗(Autologous tumor cell vaccines-Newcastle disease virus-infected, ATV-NDV)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)和白细胞介素—15(interleukin-15, IL-15)对人卵巢癌细胞株体外生长的作用。 方法:将正常人卵巢上皮细胞(normal ovarian epithelial cell)和人卵巢癌细胞株(human ovarian carcinoma strain)3AO、SKOV_3、OVCAR_3体外培养;分离正常人外周血淋巴细胞;制备人卵巢癌细胞株3AO ATV-NDV,1～2×10~7细胞/(0.5ml);将ATV-NDV、IL-12、IL-15、ATV-NDV+IL-12、ATV-NDV+IL-15分别与正常人外周血淋巴细胞共培养24h、48h、72h、96h;用正常人外周血淋巴细胞作对照,用四甲基偶氮唑蓝(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y1)-2,5-diphenyltetr azolium bromide, MTT)比色法,测定不同浓度ATV-NDV、IL-12、IL-15作用不同时间对淋巴细胞增殖程度(lymphocyte proliferation degree)的影响,将ATV-NDV(50μl)、rhIL-12(50ng/ml)、rhIL-15(50ng*ml)、ATV-NDV(50μl)+IL-12(50ng/ml)及ATV-NDV(50μl)+TL-15(50ng/ml)与人外周血淋巴细胞共培养48h,按效靶比(effector-to-target cell ratio, E:T)分别为50:1、25:1、10:1加入正常人卵巢上皮细胞和人卵巢癌细胞株3AO、SKOV_3、OVCAR_3,继续培养
参考文献：
[1]. 可控性树突状细胞活疫苗诱导抗卵巢癌免疫应答的实验研究[D]. 康玉. 复旦大学. 2006
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