李贞霞[1]2002年在《AGP小亚基反义基因导入魔芋研究》文中研究说明魔芋是单子叶植物纲(Monocotyledoeae)天南星科(Araceae)魔芋属(Amorphophallus Blume)的多年生草本植物，原产于印度和斯里兰卡，在我国有2000多年的栽培历史，是传统的食品和草药，目前在现代食品、医药和化工等方面也得到广泛的开发和利用。魔芋以其高产出、高利润的优势，成为我国中西部山区的重要经济作物，发挥了很好的扶贫致富和富民强县的作用，并形成集科、农、工、商、贸于一体的产业。然而，魔芋种植业现在却成为魔芋产业发展的瓶颈，主要存在品种退化、良种缺乏和更新缓慢等问题。选育高品位的新品种是生产上急需的和一个长期的课题。品质改良的主要目标在于增加葡甘露聚糖含量和减少淀粉的积累。葡甘露聚糖含量越高和淀粉含量越低的品种，品位越高，加工出来的精粉产量越高和质量越好。 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGP)是植物淀粉生物合成的关键酶。它催化1-P-G和ATP生成的ADP—葡萄糖(ADPG)。后者将作为淀粉合成酶的底物直接参与直链淀粉和支链淀粉的合成。在植物中，该酶是由二个大亚基(AGPL)和二个小亚基(AGPS)组成的异源四聚体。目前，该酶及其基因已经从玉米、小麦、菠菜等多种植物中得到分离纯化和研究。在不同物种间，小亚基高度保守，而大亚基相对变幅较大；小亚基是酶的活性中心，而大亚基则主要起调节作用。1993年美国Mosounto公司将来自大肠杆菌的AGP基因导入马铃薯，其块茎的淀粉和干物质含量平均提高24％；相反，若导入该酶的反义基因，则淀粉含量下降到只有对照的2％。因此通过对该酶的遗传操作，可以达到显着增加或减少植物体内淀粉含量的目的。 本论文属国家自然科学基金项目“魔芋淀粉合成的反义抑制研究”的部分内容。主要是将通过RT-PCR方法钓取的白魔芋AGP小亚基基因(AGPS1)构建成反义基因表达载体，以白魔芋愈伤组织为试材，分别探讨农杆菌转化和基因枪法转化的条件，获得整合有AGPS1反义基因的转基因植株，并对获得的转基因植株进行PCR和PCR-Southern检测，为今后采用转基因手段进行魔芋育种和品质改良奠定基础。现将主要研究内容和结果总结如下： 1、AGPS1反义基因表达载体的构建 将位于质粒pCR—AGPS1上的AGPS1片段经SacI／XbaI酶切后，替代质粒p35S-GUS载体中的GUS基因，即构建成带有AGPS1反义基因表达盒的载体p35S—AGPS1，其中AGPS1基因的3’端位于CaMV 35S启动的下游，5’端位于Nos终止子的上游。EcoRI／HindIII酶切后回收该反义基因表达盒，插入到pBINPLUS双元载体的对应位点，获得了大小为13.93kb的AGPS1反义基因双元表达载体pBIN—AGPS1。该质粒含Kan抗性筛选基因，导入农杆菌后可用于农杆菌介导的魔芋遗传转化。 将质粒PGS 和 PBluescript 11 KS＋（pBSKS－）经EcoRI／Sacl酶切后分另回收小片段和大片段，并对回收的片段进行连接，获得含有除草剂抗性基因Pat的质粒P35S干AT。对质粒P35S－PAT和含有AGPSI反义基因表达盒的P35S－AGPSI进行ECORI／HIOdlll酶切，分别回收大片段、小片段后连接，获得大小为5．slkb的AGPSI反义基因表达载体pPAT｛。该质粒DNA直接用于基因枪法微弹介导的转化。 2、农杆菌介导的魔芋遗传转化体的建立 取正在生长的魔芋愈伤组织，切成0．5见方大小，分接接种于含0、25、SO、75、100、125、150、175、200mg几卡那霉素“an）的MS培养基，观察Kan对魔芋愈伤组织分化的影响。将魔芋愈伤组织块接种于含0、100、200、300、400、500、600。g／L竣芋青霉素（Carb）的MS培养基中，观察不同的抑制剂浓度对魔芋愈伤组织生长和分化的影响，并探讨预培养时间对转化的影响等。结果表明，适于魔芋愈伤组织遗传转化的筛选压浓度为75mg几的卡那霉素；当筛选压Kan浓度大于100mg／L时，魔芋愈伤组织生长缓慢，逐渐死亡。Carb对魔芋芽分化的影响不显着，随着浓度的增大，Carb对厦芋芽分化的抑制作用也增强，但这种抑制效果在实验浓度范围内与对照的差异不显着．较为适宜的抑菌浓度为Carb30UL。魔芋的预培养时间与甘蓝、油菜的相似，均以 2天为宜。因此，较适宜魔芋的农杆菌转化条件为：魔芋愈伤组织预培养2天，直接接种农杆菌菌液，共培养2天，延迟筛选6－7天和在含有75mg／二的 Kan和300mg／L Carb的芽分化培养基上筛选等。 3、基因枪法微弹介导的魔芋遗传转化体系的建立 将魔芋愈伤组织接种于含有不同浓度除草剂Basta（0、0．25、0．5、0．75、1．00、1．25、1．50、1．75、2．00mg／L）的MS培养基上，观察除草剂对魔芋愈伤组织芽分化的影响。结果表明，ZmyL的B肪t。就足以使魔芋愈伤组织致死，B％t刊。吧儿就足以抑制正常的芽再生。实际操作中，为了得到较多的转化子，早期选用M／L Basta作为选择压，而后期的筛选使用Zing几较高浓度的Basta，以确保获得真正的转化子。 同时，对基因枪的轰击参数氦气压力和轰击距离等进行了探讨。魔芋具有分化潜能的细胞位于愈伤表面，较低的轰击压力和适当的轰击距离，将有助于子弹击中该细胞层，提高转化的频率。实验表明，氦气压力／轰击距离以1100Psi伯 最适。在轰击前4h和轰击
李贞霞, 张兴国[2]2006年在《魔芋的遗传转化研究》文中提出通过农杆菌介导和基因枪法,首次将AGPS1反义基因导入魔芋基因组,并对获得的转基因植株进行了PCR和PCR-Southern检测。
参考文献：
[1]. AGP小亚基反义基因导入魔芋研究[D]. 李贞霞. 西南农业大学. 2002
[2]. 魔芋的遗传转化研究[J]. 李贞霞, 张兴国. 园艺学报. 2006