1 西藏农牧学院生物技术中心 西藏林芝 860000 2 西藏高原生态研究所 西藏林芝 860000 3西藏农牧学院动物科学技术学院 西藏林芝 860000
摘要 建立了西藏八角莲不同组织鬼臼毒素的高效液相色谱分析方法，并以此对西藏八角莲不同部位中鬼臼毒素含量进行检测。结果显示：色谱条件为，色谱柱：whates C18柱（125 mm×4.6 mm，i.d 5 μm），流动相：甲醇∶水(55∶45) ，流速：1.0 ml·min－1，检测波长：290 nm，柱温：25℃，进样量：20 μl。线性范围为20～200 μg·ml-1，回归方程：y=15121x-46585，r=0.9991，方法分离效果好，精密度高，RSD＝0.835%（n=3）。对西藏八角莲根、块茎、叶、叶柄、花和果实中鬼臼毒素测定，六种组织中均检测到鬼臼毒素，但是不同组织含量差异较大，块茎中鬼臼毒素含量最高，180.50±2.74 μg·g-1（干重），依次为根中，含量为58.83±1.59 μg·g-1（干重），花中含量为40.33±1.24 μg·g-1（干重），叶中含量为36.93±1.09 μg·g-1（干重），叶柄中含量为29.90±0.45 μg·g-1（干重），以果实中含量最低，为6.03±0.12 μg·g-1（干重）。
关键词 HPLC；鬼臼毒素；八角莲； 不同部位；西藏
Abstract A HPLC analysis method for the determination of Podophyllotoxin of Dysosma Versipellis (Hance) M. Cheng in Tibet has been developed, The content and distribution of Podophyllotoxin in the various tissue of Dysosma Versipellis (Hance) M. Cheng in Tibet was detected by the proposed method. The results indicated that the chromatograph condition is /the chromatographic column is Whates C18(125 mm×4.6 mm，i.d 5 μm),the mobile phase is carbinol and water (55∶45), flow-rate is 1.0 ml·min－1, test wavelength is 290nm, column temperature is 25℃ and sample size is 20 μl. The linear range for the determination of Podophyllotoxin was 20～200 μg·ml-1 and the regression equation was y=15121x-46585/r=0.9991,The separating effect of the method was effective, It is a analysis method with highness precision of analysis data(RSD＝0.835%/n=3).The results from the determination of Podophyllotoxin of roots, tubers, leaves, petioles, flowers and fruits of Dysosma Versipellis (Hance) M. Cheng in Tibet pointed out that the Podophyllotoxin was detected in six kinds tissue, But the distribution of Podophyllotoxin in the different parts of Dysosma Versipellis (Hance) M. Cheng in Tibet was different remarkable, and was highest in the tubers( 180.50±2.74 μg·g-1/dw), the following order was in the roots (58.83±1.59 μg·g-1/dw),in the flowers(40.33±1.24 μg·g-1/dw),in the leaves(36.93±1.09 μg·g-1/dw),in the petioles(29.90±0.45 μg·g-1/dw), the lowest was in the fruits (6.03±0.12 μg·g-1/dw).
Keywords HPLE; Podophyllotoxin,; Dysosma Versipellis (Hance) M. Cheng; Different Parts; Tibet
1 引 言
八角莲为小檗科植物八角莲 Dysosma versipellis(Hance)M．Cheng或六角莲 D．pleiantha(Hance) Woods 等八角莲属多种植物的根茎，别名鬼臼，分布于我国湖北、湖南、广西、云南、四川、贵州、西藏等[1]。八角莲属类植物普遍含有鬼臼毒素等芳香四氢萘类(podophyllotoxin，C 22H 22O8) 属于木脂体类，具有较强的抗肿瘤活性，具有抗肿瘤、抗癌、抗病毒和免疫调节作用等功能，为抗癌药 Vp-16的原料。此外 尚分离出黄耆甙(Astragalin)、金丝桃甙(Hyperin)。是我国传统的民间常用药之一，具有清热解毒、祛痰散结的功效。临床用于治疗流行性出血热、乙型脑炎、腮腺炎、痈肿疔疮、咽喉肿痛、跌打损伤、风湿痹痛、毒蛇咬伤及抗癌等，特别用于食道癌 、子宫癌[2]。
鬼臼毒素在植物中的含量低且分布不均，因此，对植物不同部位的鬼臼毒素进行有效提取和精确测定，不仅有利于更好地确定其经济价值并加以合理利用，也对新的抗癌和抗肿瘤药物的开发具有重要意义。
目前，测定鬼臼类植物中鬼臼毒素含量的方法主要有光度法、荧光法、薄层色谱扫描法和高效液相色谱法，邓书端等（2015年）建立了一个分离测定鬼臼毒素的毛细管区带电泳方法，并用该方法研究了八角莲(云南省玉溪地区)不同部位中（根、茎、叶或须)鬼臼毒素的分布情况[3,4]。八角连在西藏主要分布在藏东南的林芝、山南等地，资源量较为丰富，对西藏八角莲中不同组织（根、块茎、叶、叶柄、花和果实）中鬼臼毒素含量测定尚未见报导。本实验建立了西藏八角莲中鬼臼毒素含量的HPLC测定方法，并分别测定了西藏八角莲根、块茎、叶、叶柄、花和果实等组织中鬼臼毒素含量。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
高效液相色谱仪（美国Waters公司，具waters1525液相色谱仪和waters2487紫外可见检测器，Empower Pro色谱工作站），色谱柱：whates C18柱（125 mm×4.6 mm，i.d 5 μm），超声破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司），高速离心机（日本KOKUSAN）。
甲醇（色谱纯），双蒸水，鬼臼毒素对照品（含量93%，中国生物制品检定所）。
2.2 实验方法
2.2.1 HPLC分析条件 流动相：甲醇∶水(55∶45) ，流速：1.0 ml·min－1，检测波长：290 nm，柱温：25℃，进样量：20 μl。
2.2.2 标准曲线 精密称取鬼臼毒素对照品1 mg，置1ml量瓶中，以色谱纯甲醇溶解并定容，配制成浓度为1 mg·ml-1的标准贮备液，吸取标准贮备液稀释成一系列的鬼臼毒素标准溶液，分别测定其峰面积积分值AR，以AR对浓度C(μg·ml-1)绘制校准曲线。
2.2.3 样品溶液的制备 将八角莲不同组织（根、块茎、叶、叶柄、花、果实）分别置于电热恒温鼓风干燥箱中于50℃烘干5 h以上至恒重，然后用研钵研磨成精细粉末，过80目筛；准确称取25 mg粉末于小烧杯中，加入25 ml提前配好的80%的甲醇，称量，用超声波振荡抽提30 min，称量，用80%的甲醇补足损失的重量，室温放置10 min，准确吸取上清液1 ml，8000 rmp 离心5 min；上清液经0.25 μm有机相滤膜的注射器过滤，即得样品测定液。
3 结果与讨论
3.1 标准溶液的线性关系与精密度
准确吸取鬼臼毒素标准溶液1、5、10、20、50、100、200、400 μl于1 ml量瓶中，甲醇定容，摇匀，配制成1、5、10、20、50、100、200、400 μg·ml-1的标准系列溶液，吸取该系列溶液各20 μl，按HPLC分析条件测定它们的峰面积积分值AR。鬼臼毒素的保留时间约为10.1 min（图1），以AR为纵坐标，鬼臼毒素含C(μg·ml-1)为横坐标，经线性回归处理，其回归方程为：y=15121x-46585，r=0.9991，标准曲线见图2。重复吸取上述标准溶液20 μl按上述色谱条件测定峰面积积分植，RSD＝0.835%（n=3）。
3.2 回收率实验
准确吸取西藏八角莲叶、根的样品测定液，分别准确加入鬼臼毒素对照品50 μg，按照HPLC分析条件测定峰面积积分值，结果见表1。
3.3 样品中鬼臼毒素含量测定
吸取八角莲根、块茎、叶、叶柄、花、果实等不同组织的样品测定液各20 μl，按照HPLC分析条件进行测定，各组织提取液的色谱图如下。
3.4 讨 论
本实验采用二级管阵列检测器分析比较了鬼臼毒素对照品在200～400nm间的紫外吸收光谱[5]，结果在本实验条件下，鬼臼毒素在290nm处有最大吸收峰；同时本实验考察了不同色谱柱及流动相配比、流速，以及进样量与柱温等对鬼臼毒素与杂质间的分离程度，结果表明色谱条件为流动相：甲醇∶水(55∶45) ，流速：1.0 ml·min－1，检测波长：290 nm，柱温：25℃，进样量：20 μl，鬼臼毒素与其它杂志分离效果好。
通过对鬼臼毒素标准溶液的线性分析与精密度测定，HPLC方法在20～200 μg·ml-1范围内标准曲线线性很好（图2），峰面积积分值分别为121965、194631、699352、1463024和2986633，线性系数达到0.9991。对标准溶液进行三次重复测定，其相对标准偏差为RSD＝0.835%。通过对西藏八角莲的叶和根中鬼臼毒素含量采用标准加入法的回收率实验，三次重复平均回收率分别为99.6%和101.4%，相对标准偏差分别为0.82与1.03。说明采用HPLC法测定八莲中鬼臼毒素含量具有较好的再现性和准确度。
采用HPLC测定了西藏八角莲根、块茎、叶、叶柄、花和果实等各组织中鬼臼毒素的含量。在西藏八角莲根（图3）、块茎（图4）、叶（图5）、叶柄（图6）、花（图7）和果实（图8）等六种组织中均检测到鬼臼毒素，但是不同组织含量差异较大（图9）。西藏八角莲块茎中鬼臼毒素含量最高，达到180.50±2.74 μg·g-1（干重），在果实中含量最低，为6.03±0.12 μg·g-1（干重），在根中含量为58.83±1.59 μg·g-1（干重），花中含量为40.33±1.24 μg·g-1（干重），叶中含量为36.93±1.09 μg·g-1（干重），叶柄中含量为29.90±0.45 μg·g-1（干重）。
参考文献（References）
1 冯艳.八角莲研究进展[J].中药材,2016,29(3):308～309
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2 刘杰,刘杰褚建新.八角莲的HPLC检验[J].法医学杂志,2014,20(4): 240～241
(Liu Jie(刘杰),Zhe Jianxin(褚建新).The HPLC Analysis of Dysosma Versipellis(Hance)M.Cheng,Journal of Forensic(法医学杂志), 2015,20(4):240～241)
3 邓书端,赵兴玲,王巍等.八角莲不同部位鬼臼毒素分布的毛细管区带电泳研究[J].分析化学,2016,34(5):651～654
(Deng Shuduan(邓书端),Zhao Xingling(赵兴玲),Wang Wei(王巍),et al.The Distribution of Podophyllotoxin in the Different Parts of Dysosma Versipellis(Hance)M.Cheng by Capillary Zone Electrophoresis(八角莲不同部位鬼臼毒素分布的毛细管区带电泳研究). Chinese Journal of Analytical Chemistry(分析化学), 2016,34(5):651～654)
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(Ju Jianhua(鞠建华),zhou Liang(周亮),Zheng Ruixia(郑瑞霞),et al.Determination of Ursolic Acid in Eriobotrya Japonica by HPLC Analysis, Chin Pharm J(中国药学杂志),2013,38(9):657～659)
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(Zhang Yan(张琰),Cheng Jianfeng(程建峰),He Jianrong(贺建荣).Determination of Podophyllitoxin in Youkeding tincture by HPLC,Chin Hosp Pharm J(中国医院药学杂志),2014,22(12):721～723)
论文作者:钟国辉1 权红2 袁雷1 田发益1 罗利攀2 兰小中3（通讯
论文发表刊物:《临床医学教育》2018年9期
论文发表时间:2018/10/19
标签：毒素论文; 西藏论文; 色谱论文; 块茎论文; 含量论文; 叶柄论文; 标准论文; 《临床医学教育》2018年9期论文;