张丽青[1]2001年在《釉基质蛋白对牙周膜细胞及牙周组织再生的实验研究》文中研究指明釉基质蛋白（EMPs）是一组来自上皮根鞘的蛋白质，自从1975年Slavkin发现EMPs可促进无细胞性牙骨质形成以来，该物质越来越受到学者们的关注。牙周膜细胞（Periodontal Ligament，PDL）是牙周组织的重要组成成分，对牙周组织再生起关键性作用。本研究采用体外细胞培养技术，观察了EMPs对人PDL细胞部分生物学行为的影响，对EMPs诱导牙周组织再生的可能作用机理进行了初步探讨。并通过动物实验观察EMPs在牙周组织再生中的作用，从而为EMPs应用于临床提供理论依据。 实验一：EMPs对人PDL细胞生物学作用的影响 1.PDL细胞的原代培养及鉴定 为研究EMPs对人PDL细胞的作用，采用组织块法成功地建立了人PDL细胞的模型。并经起源鉴定，培养细胞波形丝蛋白阳性，角蛋白阴性，证实为中胚层起源的细胞，倍增时间为48.24h。 2.EMPs对人PDL细胞增殖的影响 取第5代PDL细胞进行实验，采用四唑盐比色法测定细胞的增殖情况。结果显示：EMPs浓度在25～100mg/L时可明显促进PDL细胞的增殖，但浓度在50mg/L时效果最为显着，确定取50mg/L为最佳浓度。观察EMPs促增殖作用的时间效应，发现加药3天后EMPs开始出现促增殖作用，5天时效应最佳，7天时作用减弱，表明EMPs能明显促进PDL细胞增殖，且与浓度和时间有关。 3.EMPs对人PDL细胞碱性磷酸酶活性的影响 应用酶动力学方法测定了EMPs作用前后人PDL细胞碱性磷酸酶活性的变化，结果显示：EMPs浓度在25～100mg/L范围内对PDL细胞碱性磷酸酶 第四军医大学硕士学位论文活性无明显作用，而在200m叭时可明显增加 PDL细胞的碱性磷酸酶活性。且EMPS加入3d后即可显着提高PDL细胞碱性磷酸酶活性，以后随着时间的推移，碱性磷酸酶活性逐渐降低。提示EMPS可显着促进PDL细胞向成骨样细胞方向分化，且与浓度和时间有关。 实验二：釉基质蛋白促进牙周组织再生的动物实验 1将EMPs与ePTFE膜联合应用于GTR技术，观察了其对实验动物下颌前磨牙人工根分叉骨缺损的疗效，并与单用e－PTFE膜的GTR术和单纯翻瓣术进行比较．结果显示：术后 1个月，EMPs＋e－PTFE膜组、e．PTFE膜 组与对照组相比，均有较多的新生牙槽骨和新生牙骨质样组织生长。根分叉 部位的缺损处已大部分被新生的牙槽骨、牙骨质、牙周膜及结缔组织所充满；术后3个月，EMPs＋e。PTFE膜组与e－PTFE膜组根分叉部位的缺损处己基 本被上述新生组织完全充满，新生组织的数量在两实验组间无显着性差异， 但新生组织的种类却明显不同：e－PTFE膜组的冠方和根方新生牙骨质及 EMPs＋e－PTFE膜组的冠方新生牙骨质均为细胞性牙骨质，而 EMPs＋e－PTFE膜组的根方牙骨质为无细胞性牙骨质。上述结果表明：EMPs与eITFE膜 联合应用可明显促进人工根分叉部位牙周组织缺损的愈合，尤其是无细胞性 牙骨质的再生。 2．动物实验六周后对从犬牙内取出的膜表面进行SEM观察，结果显示：复合有EMPs的e－PTFE膜比普通e－PTFE膜上的PDL细胞明显增多，提示EMPs可促进牙周组织的再生。暴露于口腔的e－PTFE膜有大量细菌定植，其菌斑数量远远多于未暴露的屏障膜，主要为杆菌和丝状菌；但暴露的e－PTFE膜上的PDL细胞的数量却明显少于未暴露的e－PTFE膜，说明细菌定置于屏障膜可影响牙周组织再生。
刘兰宁, 刘宏伟, 金岩, 王浈[2]2005年在《釉基质蛋白对牙周膜成纤维细胞合成蛋白的影响》文中研究表明目的:检测釉基质蛋白作用下牙周膜成纤维细胞合成蛋白的变化,分析釉基质蛋白促进牙周组织再生的作用。方法:实验于2004-04/08在第四军医大学口腔医院组织工程实验室完成。选取11～14岁儿童因正畸需要拔除的无牙周病及龋病的健康新鲜前磨牙,锐利刀片刮除牙根颈部1/3牙龈及牙周膜,采用全牙胶原酶消化法培养获得牙周膜成纤维细胞,经免疫细胞化学检测证实为外胚间充质细胞。取第3代细胞用于实验,分为2组:对照组为含10mL/L新生牛血清的低糖DMEM培养液,实验组为100mg/L釉基质蛋白,用含10ml/L新生牛血清的低糖DMEM培养液配制。将第3代人牙周膜成纤维细胞制备成密度为1×104/mL的细胞悬液,接种入预先放置有细胞爬片的6孔板中,24h后按实验分组更换诱导液。逐日倒置显微镜下观察细胞形态。第3,7天利用免疫组化方法和图像分析技术检测两种细胞骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、牙骨质附着蛋白的表达。结果:①细胞形态学观察:加入诱导因子初期细胞形态无明显变化,随时间延长,实验组细胞突起逐渐变短,与对照组相比有明显差异。②免疫细胞化学检测结果:对照组骨涎蛋白、骨桥蛋白呈弱阳性到阳性表达,实验组与对照组相比,骨涎蛋白、骨桥蛋白均呈现不同程度胞浆着色加深,与作用时间成正比。对照组细胞骨粘连蛋白基本为阴性表达,而实验组细胞第3天时即检测到了骨粘连蛋白的表达,且随时间的延长染色加深。未经釉基质蛋白处理的牙骨质附着蛋白抗体为阴性表达,经过釉基质蛋白作用第3,7天均检测到牙骨质附着蛋白抗体的弱阳性表达,胞浆着色呈淡棕黄色。设立的空白对照和阴性对照均未见着色。③釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞合成骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的影响:与对照组比较,实验组第3,7天骨涎蛋白和骨桥蛋白均明显上调(184.31±5.67,168.20±6.93;181.42±4.99,163.91±5.86;213.02±5.40,194.81±5.06;211.12±5.59,182.06±6.66;P均<0.01),骨粘连蛋白对照组未表达,实验组第3天时检测到表达;实验组第7天骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白上调幅度均明显高于第3天(163.91±5.86,168.20±6.93,P<0.05;182.06±6.66,194.81±5.06,P<0.01;196.73±5.47,204.67±5.12,P<0.01)。结论:釉基质蛋白对人牙周膜成纤维细胞具有上调骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白的作用,随时间延长这种促进作用愈明显;并能诱导细胞表达牙骨质附着蛋白。釉基质蛋白在一定浓度下可使人牙周膜成纤维细胞向成骨、成牙骨质样细胞分化。
杜岩[3]2006年在《EMPs作用下人牙龈上皮细胞及牙周膜细胞基因表达差异研究》文中认为牙周组织再生一直是牙周病治疗领域追求的目标，理想的牙周组织再生需达到以下要求：1)重建功能性上皮封闭；2)新的Sharpey氏纤维插入重建功能性牙周膜；3)暴露根面上形成新的无细胞性牙骨质；4)牙槽骨高度恢复到距釉牙骨质界2mm以内。但由于对牙周组织再生机理认识还不完全清楚，导致目前牙周组织再生还不能完全达到上述要求。 近年发现釉基质蛋白(Enamel Matrix Proteins，EMPs)也可以促进牙周组织再生，它可诱导出无细胞性牙骨质和生理性排列的牙周韧带，且很少伴随有长上皮结合。牙周组织再生的细胞学基础就在于如何促使牙周膜细胞优先占据缺损区、抑制牙龈上皮细胞的过度增殖。EMPs促进牙周组织再生可能遵循这一细胞学机制。但它作为一种细胞外基质蛋白，如何发挥这种作用还不清楚。对此进行深入研究，不仅有助于我们深入了解牙周组织再生的潜在机制，也能够指导临床应用，而且有希望开发出新的效果更好的牙周缺损治疗技术。 本课题以两种与牙周组织再生密切相关的细胞(牙周膜细胞和牙龈上皮细胞)为研究对象，从基因水平初步分析EMPs对它们发挥不同生物学作用的机理。通过本课题的研究，不仅可能发现介导EMPs对细胞增殖发生影响的关键信号转导通路和关键基因、为进一步研究EMPs如何促进牙周组织再生打下基础；而且可能发现参与牙周组织再生的因子。本课题分为两部分。第一部分 EMPs对人牙龈上皮细胞抑制作用的基因表达差异分析 本部分主要研究了EMPs对人牙龈上皮细胞(Human Gingival Epithelial
刘兰宁[4]2005年在《釉基质蛋白和骨形成蛋白影响牙周膜细胞生物学功能的研究》文中进行了进一步梳理釉基质蛋白是釉质发育过程中未矿化釉质中含有的蛋白成分,研究发现它还可以由赫特威氏上皮根鞘内层细胞合成,并参与牙骨质的形成。近几年将其引入牙周病治疗领域,丰富了牙周病的治疗手段。与牙周病治疗的其它手段相比,应用釉基质蛋白更接近牙周组织的理想愈合方式。但是,其机理还不清楚,这也是国内外牙周病治疗领域的研究热点之一。 骨形成蛋白是一种重要的诱骨分化因子,能诱导未分化间充质细胞不可逆地分化为软骨和骨组织,从而导致新骨形成。骨形成蛋白也被应用于牙周病治疗领域,能诱导牙周组织中未分化间充质细胞分化为成牙骨质细胞和成骨细胞,牙周膜组织及细胞中有骨形成蛋白分布,骨形成蛋白还可促进PDLCs增殖,升高PDLCs的碱性磷酸酶活性。与合适的载体相复合,植入牙周缺损区可明显刺激新生骨,使缺损区极快形成软骨,尔后形成新骨和牙骨质。这与牙周组织缺损的愈合基本接近。 牙周组织缺损最理想的愈合方式是达到牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生。牙周膜中的细胞是牙周组织代谢和生理改建的主要细胞成分,其中牙周膜成纤维细胞可以形成牙周膜中粗大的纤维束,成骨细胞和成牙骨质细胞则分别形成牙槽骨和牙骨质,这些细胞成分依靠牙周膜中的未分化间充质细胞进行更新和补充。一般认为,牙周膜细胞是使牙周组织获得再生的基础,是牙周组织再生的主要细胞来源。但在牙周病损部位,PDLCs的来源非常有限,以致牙周组织很难达到有效地再生和重建,而组织工程技术有望解决这一难题。组
席兰兰[5]2011年在《釉基质蛋白诱导牙周再生后对正畸牙移动影响的实验研究》文中提出近年来,随着生活水平的提高,人们对口腔健康关注程度的增强,正畸矫治技术及材料的提高和改进,越来越多的成人错(?)畸形患者要求进行正畸治疗。但是,成人口腔环境比较复杂,大多存在着不同种类的口腔疾患,如牙龈炎、牙周炎、牙槽骨吸收、牙齿松动缺失和牙齿错位等,其中牙周炎在成人中很常见。如果牙周炎患者需要进行正畸治疗,首先在正畸治疗前需要进行彻底的牙周治疗,控制牙周炎症,并在正畸期间定期进行牙周维护。对已有牙周附着丧失、牙槽骨部分吸收的错(?)畸形患者进行正畸治疗时,在正畸施力大小、弓丝更换、牙周维护等方面要更加注意避免附着龈的继续丧失和牙槽骨的吸收。另外,如何通过一些方法和技术使牙周组织获得一定程度的重建,以及重建后的牙周组织能否进行正畸牙移动是目前牙周病患者正畸治疗研究的重点和难点。目的：通过动物实验,比较重建后的牙周组织和正常牙周组织在正畸力作用下牙齿移动距离的差异性,探讨釉基质蛋白治疗在牙周病牙齿正畸中的可行性,为牙周病患者错(?)畸形临床治疗提供实验依据和参考。方法：选用46只6周龄健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠,将每只大鼠上颌左侧第一磨牙作为实验组,右侧为对照组。将大鼠用2%盐酸氯胺酮腹腔注射全麻仰卧固定后,以直径0.2mm正畸结扎丝结扎大鼠实验组上颌第一磨牙牙颈部,并置于龈下,在腭侧打结,对照组上颌第一磨牙未做处置。处置结束后大鼠苏醒。从实验当天起配合饲以高糖牙周病软食。术后6周检查大鼠上颌第一磨牙牙周情况。牙周情况评价标准为：以牙周袋探诊深度(Probing Depth, PD)和牙周探诊出血(Bleeding on Probing, BOP)作为评价标准。检查由同一名经验丰富的牙周科医生使用特殊改良的牙周探针完成。随机处死3只大鼠进行组织学观察,确认实验性大鼠重度牙周炎模型建立成功。模型建立成功后,行釉基质蛋白诱导牙周再生。将大鼠用2%盐酸氯胺酮腹腔全麻后仰卧固定。采用微创显微手术技术,行牙周改良切口翻瓣,暴露病变区,刮除炎性肉芽组织,修整袋内壁,生理盐水反复冲洗。将Emdogain (Straumn公司惠赠)覆盖暴露的根面,将龈瓣复位缝合,敷牙周塞治剂。术后应用抗生素预防感染。牙周重建术后4周,检查大鼠上颌第磨牙牙周情况,牙周情况评价由同一名医生完成。随机处死3只大鼠,制作重建牙周组织和正常牙周组织组织学切片,HE染色观察。确认牙周重建效果后在剩余40只大鼠上颌第一磨牙实验组和对照组均安装个体化矫治器。2%盐酸氯胺酮麻醉仰卧固定后,用尖头金刚砂车针在冷却状态下,于上颌两中切牙远中唇线角和远中舌线角紧贴龈缘的牙颈部磨一深约0.2mm的沟,用结扎丝嵌入沟中将两中切牙结扎为一整体支抗,通过正畸镍钛螺旋拉簧牵引佩戴个体化矫治器的上颌双侧第一磨牙,矫治力值为0.5N,整个加力过程忽略支抗丧失。安装加力装置当天起喂特殊无菌营养饲料,并且每天检查大鼠口腔卫生状况及矫治器是否完整无破坏、脱落。每周加力一次,加力周期为8周,维持力值在0.5N。牵引8周后处死全部大鼠并取下上颌骨,由同一个人用精确度为0.02 mm的游标卡尺测量大鼠上颌第一磨牙远中邻面到同侧第二磨牙近中邻面间的距离,测量3次,取平均值。应用统计分析软件包SPSS10.0对获得的实验数据进行处理,分析比较两组第一磨牙近中移动距离。结果：1.牙周结扎术后6周,随机抽取3只大鼠组织学观察发现：实验组磨牙牙周袋较深,达釉牙骨质界下,袋壁表皮糜烂,炎性细胞浸润,牙周膜纤维紊乱,牙槽嵴顶呈锯齿状角形吸收。牙周情况评价实验组与对照组有明显差异,表明实验性大鼠重度牙周炎模型建立成功。2.牙周重建术后4周,随机抽取3只大鼠组织学观察示：实验组磨牙牙周附着恢复至釉牙骨质界,上皮平滑,牙周纤维规整,牙槽嵴有新骨形成,密度较正常骨组织稍低,有大量成骨细胞存在于新生骨质中。牙周情况评价实验组与对照组无明显差异,说明经釉基质蛋白诱导达到了有效的牙周重建。3.正畸加力8周后第一磨牙近中移动距离两组牙齿无显着性差异(P>0.05)。结论：1.正畸结扎丝牙颈部结扎配合高糖软食喂养建立大鼠重度牙周炎模型是可行的。2.釉基质蛋白诱导牙周组织再生是有效的。3.重建后的牙周组织和正常牙周组织对正畸力学反应一致,釉基质蛋白诱导后的再生牙周可以像正常牙周组织一样进行正畸牙移动及牙周组织改建。
马志伟[6]2002年在《釉基质蛋白的细胞生物学及初步的临床研究》文中提出牙周组织的修复再生是长期困扰牙周病学者的难题。近年来，国外学者将釉原蛋白(Amelogenin，Am)用于牙周组织缺损的再生治疗，取得了令人鼓舞的结果。但是，目前对釉原蛋白促进牙周组织再生机理的认识还不深入，而且，国内对釉原蛋白的研究仅刚刚起步。为了探讨釉原蛋白促进牙周组织再生的机理，并探索釉原蛋白临床应用的可行性，开展本项研究。 本研究通过乙酸法提取猪源性釉基质蛋白(主要成分是釉原蛋白)，并通过蛋白质聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其组成成分。在建立人牙周膜细胞(PDLC)体外培养模型后，以PDLC增佰能力为指标鉴定所提蛋白的生物学活性。在此基础上，观察了釉基质蛋白对PDLC部分生物学行为的影响，从细胞尘物学角度，对釉原蛋白促进牙周组织再生的可能机理进行了初步探讨。另外，本研究还将釉基质蛋白用于11名牙周炎志愿者，初步观察了釉基质蛋白的临床疗效。各实验的方法和结果概述如下： 1、釉基质蛋白的提取 从6月龄猪的颌骨内取出牙胚，获得釉基质，用乙酸法提取釉基质蛋白(Enamel matrix proteins，EMPs)，经SDS-PAGE，表明提取的蛋白分子量条带集中在20kDa、13kDa、5kDa，是典型的釉原蛋白所处的分子量区间。 2、釉基质蛋白的生物活性鉴定 本实验通过改良组织块法建立牙周膜细胞体外培养模型，MTT法测定不同浓度的釉基质蛋白对细胞增殖的影响，以此为指标鉴定所提蛋白的生物学活性。结果显示，50mg／L的EMPs可明显促进PDLC增殖，最大效应浓度是100mg／L。该实验表明所提EMPs具有较好的生物学活性，这为以后的实验奠定了良好的基础。 3、釉基质蛋白对人牙周膜细胞内源性TGFβ_1分泌的影响 本实验采用ELISA的方法，观察EMPs对PDLC内源性TGFβ_1分泌的影响。结果表明EMPs作用后，实验组PDLC分泌TGFβ_1明显高于对照组，且有浓度依赖性。EMPs作用的前4d，PDLC分泌TGFβ_1的能力增长迅速。 4、釉基质蛋白对人牙周膜细胞粘附、伸展的影响 本实验以固相结合分析方法观察EMPs对人PDLC粘附、伸展的影响。结果显示EMPs对人PDLC粘附无明显影响，但对已粘附PDLC的伸展有促进作用，且促伸展作用的最佳浓度是100mg／L。 第W车p；人学灿l－学位论义 5、釉基质蛋白对人牙周膜细胞总蛋白含量及超微结构的影晌 本实验采用考马斯亮蓝法测定人才周膜细胞的总蛋白含量并用透射 电镜技术观察其超微结构。结果：EMPs浓度在 50 mg／L时即可明显增加 人牙周膜细胞的总蛋白含量，100 mg／L时细胞的总蛋白含量增加到最大， 此时，细胞的超微结构显示：核仁明显，粕面内质网及高尔基复合体发达。 实验证明，EMPS能促进人牙周膜细胞核酸及蛋白质的合成活性。 6、釉基质蛋白临床应用的初步研究 本实验对 11名牙周炎志愿者的 41个患牙进行实验。细致的基础治疗 后，实验组采用翻瓣手术＋h甲脓四环素软膏为载体的EMPS；对照组采 用翻瓣手术＋二甲胺四环素软膏载体c于术前及术后3月测量各牙的牙周 袋深度、附着丧夫程度并拍摄X线片。统计各组临床指标的改善情况并 用牙槽骨吸收率测量软件评价牙槽骨手术前后的变化。结果显示，实验组 牙周庚探诊深度平均减少了 l．43土 0．99 mm，时照组平均减少了 l．39上 1．06 mm；两组附着丧夫分别减少 1．31士 l．08 mm和 122士 1刀3mm。实验 组牙槽骨的量在术后 3月平均增多了 778士 8．47（0／0）；对照组平均增多了 2．门土 5．36（％卜虽然实验组结果好于对照组，但两组指标经统计无显着 性差别。 通过本研究，可以认为：釉基质蛋白易于提耿，活性良好，对人PDLC 伸展、增殖、蛋白质合成、分泌TGF01都有促进作用。此外，在临床实验 中，釉基质蛋白具有一定促进牙槽骨再生的活性，初步认为它可用于临床 并可望获得良好的应用前景。
杜岩[7]2003年在《釉基质蛋白促进牙周组织再生机理的初步研究》文中认为釉基质蛋白是釉质发育过程中未矿化釉质中含有的蛋白成分，研究发现它还可以由赫特威氏上皮根鞘内层细胞合成，并参与牙骨质的发生。近几年将其引入牙周病治疗领域，丰富了牙周病的治疗手段。牙周组织的理想愈合方式是达到牙槽骨、牙骨质和牙周膜的生理性再生。与牙周病治疗的其它手段相比，应用釉基质蛋白更接近这种理想的愈合方式，但是，其机理还不清楚，这也是国外牙周病治疗领域的研究热点之一。 牙周膜中的细胞是牙周组织代谢和生理改建的主要细胞成分，其中牙周膜成纤维细胞可以形成牙周膜中粗大的纤维束，成骨细胞和成牙骨质细胞则分别形成牙槽骨和牙骨质，这些细胞成分依靠牙周膜中的未分化间充质细胞进行更新和补充。一般认为，牙周膜细胞是使牙周组织获得再生的基础，是牙周组织再生的主要细胞来源。因此，研究釉基质蛋白对牙周膜细胞功能的影响将有助于我们阐释釉基质蛋白促进牙周组织再生的机理。 多种生长因子、植骨材料等在体内表现出丰富的生物学活性，如骨诱导作用、骨引导作用、骨促生作用等，从而促进牙周硬组织的再生。本论文利用动物实验观察了釉基质蛋白是否具有骨诱导作用和骨促生作用。 近年来骨髓基质细胞也引起了牙周病学者的注意，这主要是因为它有望作为牙周组织工程的种子细胞用于牙周病治疗，本论文也观察了釉基质蛋白＄四旱医大学硕士学位论文 研庞生：ag 导师：X＄＃＠＠对骨髓基质细胞某些生物学功能的影响。 基于以上原因，本论文进行了以下实验： 第一部分从两个方面分析釉基质蛋白促进牙周组织再生的机理： 一、釉基质蛋白对人牙周膜细胞合成细胞外基质和细胞分化的影响 1．釉基质蛋白对人牙周膜细胞合成1型胶原、Ill型胶原的影响 本实验采用细胞培养、免疫组织化学及图像分析方法检测了釉基质蛋白对人牙周膜细胞合成1型胶原、Ill型胶原的影响。实验结果表明，一定浓度的釉基质蛋白可以促进人牙周膜细胞合成 1型胶原＊型胶原。100 t的釉基质蛋白促进牙周膜细胞合成 1型胶原的作用最明显，50 mg／L的釉基质蛋白促进牙周膜细胞合成＊型胶原的作用最明显，提示釉基质蛋白可显着影。响人牙周膜细胞的胶原合成能力。釉基质蛋白的这种作用将有利于牙周膜细胞形成细胞外基质，并参与组织矿化过程，从而促进牙周组织再生。 2．釉基质蛋白对人牙周膜细胞合成骨桥蛋白、骨涎蛋白的影响 本实验利用兔疫组织化学方法和图像分析方法直接检测了人牙周膜细胞胞浆内合成的骨桥蛋白、骨涎蛋白在釉基质蛋白影响下的变化。结果表明，正常培养的人牙周膜细胞低水平表达骨桥蛋白、骨涎蛋白，100 mg／L的釉基质蛋白可早期促进细胞合成骨桥蛋白，后期骨涎蛋白的合成量也增加。这可能提示牙周膜细胞本身即具有成骨样细胞的表型，在EMPS作用下，促进了hPDLCs向成骨方向的分化，使 OPN和 BSP表达量增高，从而在牙周硬组织再生过程中发挥作用。 二、釉基质蛋白异位成骨能力和骨促生能力的实验观察 本实验采用自体对照，运用大鼠胖肠肌肌袋内成骨模型和大鼠硬胯骨膜下成骨模型来分别观察釉基质蛋白的异位成骨能力和骨促生能力。实验结果表明，釉基质蛋白不具有异位成骨能力，即釉基质蛋白缺乏骨诱导作用，同Doprt＂’ent ofPertodontotogr a。d Oml Medee－3·亨四军医大学硕士学位论文 研死生：脱 导师：X＄撇＠时，本实验未能证实釉基质蛋白具有骨促生作用。但是，有必要对这一问题进行进一步的研究。 第二部分观察了釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学功能的影响： 本论文在实验中初步分析了釉基质蛋白对体外培养的兔骨髓基质细胞增殖能力、碱性磷酸酶活性、总蛋白合成能力、矿化结节形成等生物学功能的影响。结果表明，釉基质蛋白可以促进骨髓基质细胞的增殖、提高细胞的碱性磷酸酶活性和总蛋白合成能力，以 100 mg／L釉基质蛋白的促进作用最明显。实验还观察了釉基质蛋白上述作用的时间效应，结果显示，釉基质蛋白促进细胞增殖、提高细胞碱性磷酸酶活性、促进细胞总蛋白合成的作用分别在 120 h、72 h、168 h时最明显。对于骨髓基质细胞的矿化结节形成能力，结果表明实验组细胞形成矿化结节比对照组要早，这不仅与釉基质蛋白本身所具有的提高细胞碱性磷酸酶活性的能力有关，还可能与釉基质蛋白的促增殖作用有关。 本实验结果表明，釉基质蛋白可对骨髓基质细胞的一般生物学功能产生明显的促进作用，这为以后将釉基质蛋白和骨髓基质细胞用于牙周组织工程提供基本的实验依据。
钟永荣[8]2010年在《釉基质蛋白衍生物诱导人牙周膜细胞群向类成牙骨质细胞分化的机制初探》文中进行了进一步梳理近年来,研究者发现人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cell population, HPDLP)是一组具有多向分化潜能的异质性细胞群,含有成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞及未分化的前体干细胞等多种细胞成分,具有合成新生牙骨质、牙周纤维、牙槽骨等的牙周组织功能。这些细胞亚型可处于不同的分化阶段或具有不定向的分化趋势,牙周组织再生修复与牙周膜细胞的异质性有密切关系。牙根发育早期,牙囊细胞、上皮根鞘和牙乳头细胞相互作用,形成了牙根牙周组织。经典理论认为,牙周前体细胞—牙囊细胞穿透断裂的上皮根鞘与牙根接触并相互作用,分化成为成牙骨质细胞并形成牙骨质。在临床实际操作中,牙周炎患牙的牙周洁治与根面平整,以及局部的抗炎处理是促进牙周再生的前提。通过物理或化学的方法进行牙根表面处理,其目的是为了去除牙根表层的玷污层,改善根面周围的局部微环境,暴露新鲜的牙骨质或牙本质,增加局部的趋化刺激因子,以此来诱导牙周细胞的牙根表面贴附性,促进牙周再生。研究证明釉基质蛋白衍生物(Enamel Matrix Derivatives, EMD,商品名为Emdogain)在体外可以促进牙周韧带细胞(Periodontal ligament cells, PDLC)的黏附、伸展,并且促进其分泌生长因子和细胞因子,其生物学行为类似一种多功能的生长因子。EMD还能诱导多能干细胞系细胞向成骨细胞转化,并能促进成骨细胞系的增殖和分化。将EMD与牙周组织再生(Guided tissue regeneration,GTR)技术结合应用,发现在牙周缺损部位的牙根表面有新的无细胞牙骨质生成,并有成束的胶原纤维埋入其中,恢复了原有牙周膜的解剖结构,提示EMD可促进牙周的完全再生。由于牙周再生的关键环节是牙骨质的再生,而牙骨质形成细胞的存在和功能性活动则是牙周修复再生的细胞学基础。牙齿发育期的Hertwig's上皮根鞘的内层细胞分泌的釉基质蛋白,具有促进牙周膜再生和参与无细胞牙骨质形成的过程。基于这种理论,EMD很可能是一种在牙周再生过程中,通过刺激PDLC增生、并可能诱导PDLC向成牙骨质细胞或成骨细胞分化的基质蛋白。因此认为EMD对人牙周膜细胞群向成牙骨质细胞方向分化有重要作用。在牙周组织再生中最困难的是牙骨质的再生,目前也是对其了解最少的牙周组织。虽然众多的体内外研究表明,通过物理、化学因素的处理,可以促进牙周组织的再生,包括牙骨质的再生。但对于形成牙骨质的前体细胞即成牙骨质细胞如何从HPDLP分化而来及其机制是什么?仍然还不清楚。因此,本实验拟探讨HPDLP经EMD诱导后能否向成牙骨质细胞方向分化及其可能的诱导机制,为进一步了解HPDLP的定向分化潜能及牙周组织再生奠定基础。第一章HPDLP的分离培养和鉴定目的：体外分离培养HPDLP,并进行鉴定。方法：1.分离培养HPDLP收集临床因正畸需要拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙,刮下根中1／3牙周膜组织,采用组织块法培养。2.HPDLP的初步鉴定通过免疫细胞化学方法检测培养细胞的波形丝蛋白和角蛋白的表达,对细胞来源进行初步鉴定。结果：1.形态学特征：3—6天见多个组织块边缘有细胞开始游出,细胞形态无明显差别,大多数为长梭形。少数为多角形、纺锤状或椭圆形,体积较小,胞体丰满,生长较快,约7—14天开始汇合,以组织块为中心成放射状、漩涡状生长。2.免疫组织化学特征：免疫组化显示波形丝蛋白染色细胞胞浆可见黄色颗粒,角蛋白染色细胞胞浆未见黄色颗粒。表明细胞较为单一,属于中胚层来源细胞,且无上皮细胞的污染,证实所分离培养的是HPDLP,可用于进一步的研究。第二章EMD诱导后HPDLP形态观察及在牙骨质片上的贴附、增殖情况目的：观察HPDLP在EMD诱导下向成牙骨质细胞分化的潜能,为HPDLP在牙周组织再生中的作用提供实验基础。方法：1.将HPDLP体外EMD诱导7天,制成细胞爬片,HE染色观察细胞形态.以未加EMD为对照组。2.制备牙骨质片,分为实验组和对照组,实验组牙骨质片经EMD包被24小时,接种经EMD诱导的细胞,对照组与实验组平行处理,只是细胞及牙骨质片不经EMD处理。诱导7天后,常规生物样本制备,扫描电镜观察牙骨质片上的细胞数量及形态。3.用MTT法分别检查HPDLP在牙骨质片上的附着(16小时)和增殖(72小时)情况,分为实验组和对照组。结果1.HPDLP经EMD体外诱导后,细胞形态发生了明显改变,由梭形的成纤维样细胞变为多角形的类成牙骨质样细胞。2.扫描电镜观察细胞在牙骨质片上的形态：对照组细胞细长、纺锤形或梭形外形,呈典型的成纤维细胞形状,细胞表面有许多微绒毛。实验组细胞呈多角形或立方形的类成牙骨质样细胞,表面微绒毛明显减少,并可见细胞突起与邻近细胞相连,细胞表面可见大量的细胞外分泌基质。诱导组贴附细胞数比非诱导组明显增多。3.MTT法检测显示：HPDLP经EMD作用后细胞在牙骨质片上的附着、增殖能力明显增强,与对照组相比,具有显着性差异(贴附：t=-3.318,p=0.008；增值：t=-6.499,p=0.000)。第叁章EMD诱导后HPDLP内成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达目的：旨在了解体外培养环境中HPDLP在EMD诱导下,成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达,探索人牙周膜细胞群向成牙骨质细胞分化诱导的机制。方法：EMD作用HPDLP,分为对照组和实验组。采用免疫细胞化学染色在蛋白水平进行半定量检测成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达,包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠcollagen,COLⅠ)表达；通过实时定量PCR(RT-PCR)在转录水平检测两组HPDLP中成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达。结果：1.免疫细胞化学染色显示：EMD诱导7天：ALP、BSP、COLⅠ、OCN实验组、对照组均有表达；光密度值测量显示：EMD诱导7天ALP、BSP、COLⅠ实验组与对照组之间具有显着性差异(ALP:t=12.731,p=0.000; BSP:t=5.123,p=0.000;COLⅠ:t=-2.859,p=0.010), OCN实验组与对照组之间无显着性差异(t=0.757,p=0.459)。2.实时定量PCR (RT-PCR)检测结果：EMD诱导7天,实验组ALP、COLⅠ的表达量较对照组明显升高,分别是6.01倍、4.35倍；而OCN表达量无明显升高,实验组是对照组的1.25倍。全文结论：1.HPDLP经EMD诱导后在牙骨质片上的贴附、增殖能力增强并向类成牙骨质样细胞方向分化。2.EMD诱导后HPDLP细胞内的成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达增强,可能是HPDLP向成牙骨质细胞分化诱导的机制之一。3.HPDLP在EMD诱导下向成牙骨质细胞分化的潜能明显增强。
侯小丽[9]2004年在《釉基质蛋白对体外培养的骨髓基质细胞生物学功能的影响》文中进行了进一步梳理牙周病治疗的最终目标是牙周组织的再生和形成牙周新附着，因牙周病而丧失的牙周组织，其修复和重建的难度较大，而牙周组织工程有望解决这一难题。骨髓基质细胞(MSCs)具有来源广泛、取材方便、生长稳定、增殖快、定向分化能力强、易于接种成活等优点，因此有望成为牙周组织工程的种子细胞。 研究认为，釉基质蛋白(EMPs)在牙周组织再生中的作用是无疑的，不仅可以诱导与根部牙本质紧密附着的无细胞性牙骨质的形成，还可以诱导牙周膜和牙槽骨的再生，而且这种再生类似这些组织的正常发育过程。 关于EMPs对MSCs生物学作用的报道较少，因此，我们做了一些这方面的研究，希望为以后将EMPs和MSCs用于牙周组织再生提供实验依据。 本研究体外培养大鼠骨髓基质细胞(rMSCs)，提取猪EMPs并检测其生物学活性，在此基础上进一步观察了EMPs对rMSCs合成细胞外基质(EMC)、分化以及分泌生长因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)的影响。实验分以下几个部分： 1．SD大鼠骨髓基质细胞的体外培养及釉基质蛋白的提取与检测 本实验以SD大鼠骨髓为材料体外培养rMSCs；取4～6月龄猪恒牙胚，采用乙酸法提取猪EMPs，并做SDS-PAGE；通过MTT法测定EMPs对rMSCs增殖的浓度效应和时间效应，并以此为指标检 第四军医大学硕士学位论文测所提蛋白的生物学活性。结果表明，提取的蛋白分子量条带集中在20kDa、13 kDa、5 kDa，是典型的釉原蛋白所处的分子量区间;从浓度上看，EMps在50一Zoom创L表现出促rMSCs增殖的作用，50m留L起效，100 mg几促增殖作用最强;从时间上看，以100m创L浓度的EMPs作用于rMSCs，第1d即可促进细胞的增殖，第5d作用最强，之后轻微下降。该实验表明所提EMPs具有较好的生物学活性，这为以后的实验奠定了良好的基础。2.釉基质蛋白对大鼠骨健基质细胞合成I型、111型胶原的影响 本实验通过免疫细胞化学和图像分析方法观察了EMPs对rMSCs合成I型胶原、m型胶原的影响。结果表明EMPs明显促进rMSCs合成I型胶原、m型胶原。对于I型胶原，1 oomg/L的EMps作用7d时的染色最深;对于m型胶原，loomg/L的EMpS作用5d时的染色最深。3.釉基质蛋白对大鼠骨翻基质细胞合成非胶原蛋白的影响 本实验通过免疫细胞化学和图像分析方法观察了EMPs对rMSCs合成非胶原蛋白(矿化相关蛋白)的影响。结果表明，对于骨桥蛋白(OPN)，第3 d EMPs即可促进rMSCs合成OPN，与其作为成骨细胞分化的早期标志的特性相符;对于骨涎蛋白(BSP)，从时间上看，合成较晚，第sd与对照组相比有差异，符合BSP是骨分化的晚期标志这一研究结果;对于骨粘连素(ON)，随时间延长，合成ON明显增加，但各浓度组间无明显差异。在EMPs作用下，rMSCs表达OPN、BSP和ON的量增加，表明EMPs可以促进rMSCs向成骨方向分化，而且BSP、OPN、ON作为矿化组织的重要细胞外基质，它们的表达量增加也有利于发挥它们在生物矿化过程中的独特作用，从而在牙周硬组织再生过程中发挥作用。，.釉基质蛋白对大鼠骨滋基质细胞分泌TGF一pl的影响 本实验通过体外细胞培养技术及酶联免疫测定方法，观察了E侧于s对rMSCs分泌内源性TGF一pl的影响。结果表明，EMPs明显促进rMSCs分泌TGF一pl。从浓度上看，EMPs促进rMSCs分泌TGF一pl的最小浓度为50mg/L，随EMps浓度的进一步增高，第四军医大学硕士学位论文rMSCs分泌TGF一pl的能力也相应提高，Zoomg几‘的EMps促进rMSCs分泌TGF一pl的效应最为明显;从时间上看，实验组促进TGF一pl分泌的效应在第3d即明显高于对照组，前sd rMsCs分泌TGF一pl的效应增长很快，之后增长缓慢。 通过以上研究可以初步认为，EMPs可能通过促进rMSCs合成胶原、促进rMSCs分化、促进rMSCs分泌内源性TGF pl，从而可以在牙周组织再生中发挥重要的作用。
参考文献：
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[6]. 釉基质蛋白的细胞生物学及初步的临床研究[D]. 马志伟. 第四军医大学. 2002
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[8]. 釉基质蛋白衍生物诱导人牙周膜细胞群向类成牙骨质细胞分化的机制初探[D]. 钟永荣. 南方医科大学. 2010
[9]. 釉基质蛋白对体外培养的骨髓基质细胞生物学功能的影响[D]. 侯小丽. 第四军医大学. 2004