郭祎[1]2003年在《比率荧光光谱仪测量细胞内游离钙离子浓度的研究》文中认为钙离子作为细胞内第二信使把外源信号(激素、光、温度等环境刺激)转变成胞内信号，导致一系列胞内事件的发生。大量的研究表明，Ca~(2+)的信使功能是通过调控细胞内游离Ca~(2+)浓度来实现的。Ca~(2+)信号的产生和终止是细胞内Ca~(2+)增减、振荡的结果。因此测量细胞内的Ca~(2+)浓度是十分重要的。 新的荧光染料的开发和成像技术的发展，极大的促进了对细胞内钙信号传导途径的研究。本文前半部分简要回顾了Ca~(2+)荧光测量方法的历史与发展，介绍了Ca~(2+)作为细胞内第二信使的作用机理及对细胞内Ca~(2+)浓度进行荧光测量的原理并对我们的实验系统做了简洁的说明。本文后半部分主要围绕用比率荧光光谱仪测量细胞内游离Ca~(2+)的研究进行了以下工作： (1)建立了比率荧光光谱仪测量细胞内游离钙离子浓度的实验系统； (2)建立了乳鼠心肌细胞原代培养的模型，并对培养细胞进行了细胞内Ca~(2+)浓度的测量。在心肌细胞外液中加入NE(去钾肾上腺素)后测得的相对荧光强度明显升高，该现象符合NE的生理作用特点，因而表明我们所建立的测量细胞内Ca~(2+)浓度动态变化的心肌细胞实验系统是可行的，该系统可以用于测量加入不同药物后心肌细胞内Ca~(2+)浓度的变化状况，从生物医学的角度进行分析可以研究药物对细胞的作用机理。 (3)通过用Fura-2/AM对B16细胞内Ca~(2+)浓度的测量，确定了B16细胞的制备及荧光染料的载入方法；建立了用随机软件ImageMaster获取被测细胞的图象及进行比率分析的方法，用随机软件FeliX获取被测细胞的荧光图谱及进行比率分析的方法。
雷磊[2]2011年在《新型吲哚类钙离子荧光指示剂的合成与性质研究》文中进行了进一步梳理钙作为人体组成的重要元素之一,参与了骨骼构成和维持生物形态。并且它的离子状态在调节神经活动,凝固血液,肌肉和血管的收缩与舒张,传递各种生物信号的过程中起到重要作用。钙是人体不可缺少的元素,在生物体中有着重要的意义。自上世纪八十年代以来,科学家Tsien等人,依据EGTA的结构,合成了一种具有BAPTA螯合母体的钙荧光指示剂,并且广泛应用于细胞内钙离子浓度的测定。这就是第一代钙离子荧光指示剂,经过人们的不懈努力,指示剂已发展到第叁代了,大都是以BAPTA结构为母体。这类指示剂对钙离子响应时间短,灵敏度高,还可以通过一些科学仪器,能够准确、及时的了解到钙离子浓度在细胞内的分布和时空变化。因此,钙离子荧光指示剂一直以来备受科学家的青睐,广泛应用于生命科学和临床医学等领域中,而指示剂的设计、合成也是有机化学中的热点问题。现在广泛使用的钙离子指示剂主要有两种：一是以fluo-3为代表的属于可见光激发的荧光素类钙离子荧光指示剂；二是以indo-1为代表的属于紫外光激发的吲哚类钙离子荧光指示剂。其中indo-1可以采用双波长比率法测定细胞内钙离子浓度,具有高选择性、高荧光量子效率等优点,但是由于属于紫外光激发的指示剂,还有很多不足之处。为了改变吲哚类钙离子指示剂的激发波长,使激发波长红移尽可能的靠近可见光区,我们通过对螯合母体BAPTA结构和吲哚类钙离子荧光指示剂结构的研究,提出了在钙离子荧光指示剂的螯合基团和荧光发色基团之间引入碳碳双键的解决方法。本文依据新型吲哚类钙离子荧光指示剂的设计与合成展开研究,主要有以下几个方面：1.通过分析目前常用荧光指示剂的母体BAPTA结构,设计,合成了两种新的具有BAPTA结构的母体,并对其结构进行了表征。2.设计合成了两种未见文献报道的新型吲哚类细胞钙离子荧光指示剂甲酯形式,并对其甲酯形式的结构进行了表征。并且,对合成方法进行了探讨,优化了反应条件。3.研究了这一种新型吲哚类钙离子指示剂的光谱性质,并且与现有吲哚类指示剂相比较,发现其激发波长红移。
王海雁[3]2008年在《荧光法研究外源性小分子对淋巴细胞钙信号的影响》文中研究指明细胞内游离钙离子的浓度及其分布的变化代表着某种细胞功能的启动、加强和抑制,是形成Ca~(2+)信号的基础。破译不同型式的Ca~(2+)信号所代表的生物学意义,可以大大加深人们对淋巴细胞功能调节机制的认识,并进一步探索外源性刺激对免疫细胞钙信号系统的扰动机理。本文运用两种测定胞内游离钙的荧光探针fura-2、fluo-3,以及测定细胞膜电压的带负电荷类菁荧光染料Bis-oxonol,应用荧光光谱仪与激光共聚焦扫描显微镜分别在多细胞和单细胞两个层面研究了外源性化学小分子青霉素G、头孢哌酮和丙烯酰胺对急性提取的人外周血淋巴细胞胞内游离钙离子信号的影响。选择肌浆网钙泵抑制剂(Thapsigargin)、非特异性钙通道抑制剂La~(3+)、Ni~(2+)、电压依赖L型钙通道抑制剂尼卡地平(Nicardipine)、电压依赖N型钙通道抑制剂芋螺毒素(ω-conotoxin)和fura-2荧光猝灭剂Mn~(2+)参与外源性小分子对胞内游离钙离子信号的干扰过程,分析了这些外源小分子引发淋巴细胞胞内钙水平的升高和降低现象的作用机制。以荧光光谱学方法对抗生素的用药安全问题、丙烯酰胺的食品安全问题给出基础数据。同时建立了丙烯酰胺SPE-HPLC-UV的检测方法。第一章阐述了细胞钙离子信号转导的研究动态,简单介绍了淋巴细胞胞内钙离子水平的调控通路,综述了细胞内钙离子浓度检测方法的进展。第二章β-内酰胺抗生素中的青霉素G不仅临床应用广泛,而且体外培养细胞的各种细胞生理液中均被加入100U/mL的青霉素G以抑制杂菌污染。每公顷农业用土壤中青霉素G残留含量也超过一千克,这些青霉素G有可能进入食物链最终影响人体健康。应用fura-2荧光探针测钙技术研究了拟生理状态下低剂量的青霉素G药物小分子对淋巴细胞胞内钙信号的降低机制。青霉素G可以激活细胞膜上的钙泵,诱导淋巴细胞胞内游离钙离子外排。细胞外的钠、钙离子浓度的改变协同影响淋巴细胞内游离钙的水平,低钠和高钙的胞外环境能够加强青霉素G的排钙作用。实验证实了青霉素G能够抑制钠钙交换蛋白的促进外钙内流的能力。青霉素G能够消弱强心剂药物乌本苷提升胞内钙水平的药效。第叁章第叁代β-内酰胺抗生素头孢哌酮在拟生理状态下与低剂量的青霉素G有着相同的排钙趋势,强度弱于青霉素G。头孢哌酮也能够抑制钠钙交换蛋白促进的外钙内流,同时低钠和高钙的胞外环境也能够加强头孢哌酮的排钙作用。选择肌浆网钙泵抑制剂(Thapsigargin,Tg)和非特异性钙通道抑制剂La~(3+)、Ni~(2+)参与头孢哌酮的促进内钙外排或抑制外钙内流的降钙过程中。研究发现头孢哌酮有着和非特异性钙通道抑制剂Ni~(2+)相似的针对该类钙通道蛋白的作用位点。头孢哌酮能够抑制Tg激活的储池操纵钙通道(SOC)操纵的胞外钙离子的内流,竞争性结合SOC通道的钙结合位点,而且头孢哌酮对SOC操纵的胞外钙离子的内流的抑制作用是可逆转的。实验证实了微量青霉素G和头孢哌酮都能够对静息状态免疫系统开始免疫应答所要求的胞内游离钙水平升高产生抑制,发现血液中微量β-内酰胺抗生素的存在能促进淋巴细胞胞内钙流失,导致淋巴细胞内钙水平降低,延迟淋巴细胞对抗原的应激反应,扰动免疫系统平衡,从而降低淋巴细胞的免疫活力。第四章近年来高温烘烤煎炸淀粉类食物中所含相应剂量的丙烯酰胺的毒性研究成为全球热点。丙烯酰胺对多细胞的钙离子信号的干扰试验表明丙烯酰胺对胞内钙离子浓度变化的扰动表现为低浓度促进内钙增加,高浓度抑制内钙增加。虽然钙超载与钙缺乏相互对立,但均由同一刺激引起,只是表现在剂量上、时间上的不同。随着丙烯酰胺的作用剂量加大,作用时间延长,淋巴细胞钙离子的跨膜转运被抑制,细胞内游离的总钙量减少,该作用与细胞内钠离子和钾离子协同相关,最终导致静息钙水平低于正常。单细胞层面重点论证了淀粉类食品中广泛存在的低于54μg/mL以下的丙烯酰胺使淋巴细胞[Ca~(2+)]_i迅速升高的作用机制。低于54μg/mL以下的丙烯酰胺使细胞[Ca~(2+)]_i迅速升高并在400秒之内形成较高水平钙浓度平台,若无其他干扰,升高的内钙可以在一小时之内回复至初始状态。胞外无钙的外环境使丙烯酰胺无法诱发内钙升高。丙烯酰胺不能刺激胞内内质网钙库和线粒体上的钙池释钙,表明受体协调的钙进入在此条件下没有作为。1.0 mM Ni~(2+)的加入将丙烯酰胺诱导的[Ca~(2+)]_i升高降低了35%,丙烯酰胺能够诱导Mn~(2+)进入淋巴细胞导致的fura-2荧光促灭,说明丙烯酰胺刺激了非选择性离子通道的钙进入。电压依赖钙通道(VGCC)L型抑制剂尼卡地平对丙烯酰胺的升钙作用没有作为,而电压依赖N型钙通道抑制剂芋螺毒素使内钙升高明显降低30%,该结果表明,丙烯酰胺通过对非选择性离子通道以及某些N型VGCC的刺激,诱发内钙升高。丙烯酰胺对淋巴细胞的[Ca~(2+)]_i的干扰与细胞内含量丰富的K~+、Na~+和Ca~(2+)的协同作用相关联。另一方面,实验证实生理水平存在的维生素C、E能显着降低丙烯酰胺导致的内钙升高,表明饮食中的抗氧化剂可以降低丙烯酰胺导致的细胞损伤。第五章建立了丙烯酰胺SPE-HPLC-UV的检测方法。样品中丙烯酰胺的提取和纯化选择在低温(0℃)高速离心(13000×g)的条件下。离心过程中通过硬化油脂层并伴随微孔滤膜过滤,简单高效的降低了脂类杂质的干扰。测试过程中选择4.0%v/v的乙腈水作为流动相,梯度洗脱程序既能改善色谱柱,又可以将丙烯酰胺从疏水杂质中分离出来。工作曲线系列标准溶液的浓度限定在50-2000μg/L之间,检测210 nm处吸收强度,校正曲线线性良好,线性系数R＞0.999。在100μg/kg浓度水平的加标回收率为78%～107%。检出限和定量限分别为6和23μg/kg。比LC-MS/MS方法的相应数值稍高,但低于国家监控食品中丙烯酰胺的标准。本方法的室内精度在2.1-10.9%之间。
宋峰[4]2010年在《β_1肾上腺素受体细胞外第二环自身抗体对大鼠心肌细胞胞内游离钙的增强作用》文中研究表明研究背景近年来的研究表明,β1肾上腺素能受体(β1-adrenoceptor,β1-AR)细胞外第二环(the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AR-ECⅡ)自身抗体及其自身免疫机制可能参与了原发型扩张性心肌病、风湿型性脏病、Chagasic病、原发性心电紊乱病等多种心脏疾病的发病过程。β1肾上腺素能受体细胞外第二环自身抗体(autoantibodies against the second extracellular loop ofβ1-adrenoceptor,β1-AA)在心脏病发生、发展中的病理生理作用日益受到研究者的关注。之前的研究均是通过采用与人β1-AR-ECⅡ表位肽段序列相一致的合成肽段免疫动物得到的结果,这种主动免疫模型有两个主要的不足：其一,由于该模型是用抗原诱导动物体内产生相应抗体,所以无法控制动物体内相应抗体(即β1-AA)的水平,结果导致动物模型血清中β1-AA的水平远远高于临床病人血清中的实际值；其二,用该模型得出的研究结果不能排除抗原肽段对机体的损伤作用。因此,完善现有的动物模型以更好地模拟临床,成为研究β1-AA在心功能不全等疾病中病理生理学意义的基础。对β1-AA的进一步研究发现,该自身抗体具有类β-AR激动剂样的作用,可以导致急性分离的正常动物心肌细胞内Ca2+的水平增加。然而,β1-AA长期存在是否会影响心肌细胞胞内Ca2+水平尚不清楚,而后者是临床上能否将Ca2+作为β1-AA导致心功能不全治疗的靶点。研究目的1.建立并完善β1-AA被动免疫大鼠模型,使动物模型血清中β1-AA水平与临床心功能不全患者血清中β1-AA水平相匹配。2.利用上述模型观察β1-AA长期存在对大鼠心肌细胞胞内游离钙水平的影响及作用途径。材料和方法1.抗人β1肾上腺素能受体自身抗体(β1-AA)的制备1.1抗人β1-AR抗原肽段的合成：按照人β1-AR-ECⅡ的功能表位肽段(197-223,H-W-W-R-A-E-S-D-E-A-R-R-C-Y-N-D-P-K-C-C-D-F-V-T-N-R-A,人鼠同源性100%,由吉尔生化上海有限公司合成,纯度大于95%)。合成的肽段储存于-20℃备用,用于后续血清抗体的定性、定量和血清抗体的功能测定。1.2β1-AA抗体制备：使用上述抗原肽段对Wistar大鼠(8周龄,体重160-180g,n=20)进行为期8周的主动免疫,制备β1-AA血清,其效价用SA-ELISA (Streptavidin-enzyme linked immunosorbent assay)方法检测。利用MAb Trap Kit试剂盒对血清中的β1-AA进行提取和纯化。纯化后的抗体蛋白液先经PAGE凝胶电泳检测其纯度,然后使用BCA试剂盒对提取液进行蛋白定量。2.被动免疫大鼠模型的建立2.1被动免疫方案：按照预实验的结果,将纯化的β1-AA以0.7μg/g的剂量通过尾静脉注入正常大鼠体内,每2周加强免疫一次,共免疫40周。对照组以0.7μg/g的剂量通过尾静脉注入阴性IgG,免疫程序和检测方法同上。2.2大鼠心功能的测定：取被动免疫40周大鼠,称重后经腹腔注射乌拉坦(1g/kg, i.p)麻醉,经右颈总动脉行左心室插管,待出现左心室标致性波形(图1)后,稳定15-20分钟,用BL-410生物信号记录分析系统记录各心功能参数,包括左心室收缩压(Left Ventricular Systolic Pressure, LVSP)、左心室舒张压(Left Ventricular Diastolic Pressure, LVDP)、室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)和室内压下降的最大速率(-dp/dtmax)。3.激光共聚焦显微镜对被动免疫末期大鼠心肌细胞胞内游离钙的测定3.1心肌细胞的分离：取被动免疫40周大鼠,用1%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉,用Langendorff灌流装置经主动脉逆行灌流酶解心脏为单个心肌细胞,放置于高钾KB(配方见溶液配制)液中,静置2-4小时后进行实验。3.2激光共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope, LSCM)测定心肌细胞胞内游离钙水平：加入有钙台式液(配方见溶液配制)将分离的单个心肌细胞悬液复钙,负载Fluo-3/AM荧光指示剂后,加入共聚焦专用皿,置于倒置荧光显微镜下观察。每只大鼠取10个视野,选择杆状、细胞膜完整、形态好的细胞进行测定,结果用LSM510图像分析软件进行分析。4.离子成像系统对正常大鼠心室肌细胞胞内游离钙的测定取健康Wistar大鼠,用上述细胞分离法获得单个心肌细胞悬液。负载Fura-2/AM荧光指示剂后,加入离子成像系统的灌流槽内中,置于倒置荧光显微镜下,分组进行测定：(1)正常对照组：(Tyrode, n=6),正常台氏液；(2)阴性IgG组：(Negative IgG,n=6),给予阴性IgG；(3) Isoprenaline组：(Isoprenaline, n=6),给予1μmol/L的β-AR激动剂异丙肾上腺素(Isoprenaline);(4)β1-AA组：(β1-AA,n=6),给予0. 1μmol/L的β1-AR自身抗体；(5)β1-AA加β1-AR拮抗剂比索洛尔(Bisoprolol)组：(β1-AA+Bisoprolol, n=6),同时给予0.1μmol/L的β1-AA和1μmol/L的Bisoprolol; (6)拮抗剂Bisoprolol组:(Bisoprolol,n=6),给予1μmol/L的Bisoprolol；(7)β-AA加β1-AR-ECⅡ肽段组：(β-AA+β1-AR-ECⅡ,n=6),同时给予0.1μmol/L的β1-AA和1μmol/L的β1-AR-ECⅡ肽段；(8)β1-AR-ECⅡ肽段组：(β1-AR-ECⅡ,n=6),给予1μmol/L的β1-AR-ECⅡ肽段。观察各组心肌细胞胞内游离钙的变化,并与Isoprenaline的作用进行比较。结果1.利用β1-AR-ECⅡ功能表位肽段主动免疫大鼠获得β1-AA1.1主动免疫过程中大鼠体内β1-AA水平升高免疫组大鼠从初次免疫2周后,血清中已有β1-AA的出现,并且滴度迅速升高,在8周时达高峰,且明显高于同期对照组(OD值为2.99±0.14vs.0.43±0.12,P<0.05,图2),表明主动免疫成功。1.2β1-AA蛋白定性及定量测定结果PAGE凝胶电泳检测结果显示,纯化后的抗体在电泳时,仅有一条带出现,分子量为160KDa左右,与IgG标准品相一致(图3),表明纯化结果理想。同时,经BCA试剂盒测定提取液中蛋白浓度(表1)。2.利用纯化后β1-AA成功建立被动免疫大鼠模型2.1被动免疫过程中大鼠体内β1-AA水平维持与临床匹配范围将β1-AA被动转运入正常大鼠体内后,动物血清中β1-AA水平逐渐升高,在被动免疫第16周时达到高峰,此后抗体水平开始缓慢下降。各组内8、16、32、36、40周比较无统计学差异,但和同一时间对照组相比有显着差异(P<0.001,P<0.05,图5)。在整个被动免疫过程中,免疫大鼠血清中β1-AA水平维持在0.19±0.01-0.22±0.02之间,与临床心脏疾病患者血清中抗体水平接近。2.2被动免疫末期出现大鼠在体心功能下降β1-AA被动免疫第40周时,免疫组出现了在体心功能下降(图6)。其中,被动免疫组大鼠左心室室内压上升的最大速率(+dp/dtmax)、室内压下降的最大速率(-dp/dtmax)显着低于对照组(P<0.001,P<0.01)；左室舒张压(LVDP)显着高于对照组(P<0.001)；左室收缩压(LVSP)变化不明显,组间及组内比较均无统计学差异(P>0.05)。提示β1-AA的长期存在导致了大鼠心功能下降。3.β1-AA长期存在可使大鼠心肌细胞胞内游离钙水平升高3.1被动免疫末期大鼠心肌细胞胞内游离钙水平升高β1-AA被动免疫大鼠第40周时,采用高分辨率的成像清晰的能对细胞内探针的荧光进行准确的定量分析的LSCM进行测定。结果显示,免疫组单个心肌细胞胞内游离钙水平高于对照组约10倍(P<0.001,图7A,B),提示β1-AA长期存在可以导致单个心肌细胞胞内游离钙水平升高。3.2β1-AA可以通过激活β1-AR途径升高心肌细胞胞内游离钙水平由于该研究课题需要长时间监测心肌细胞胞内游离钙水平,为保证实验过程中心肌细胞保持良好的状态,实验利用离子成像系统进行测定,借助灌流装置用不同处理组氧饱和液体进行持续灌流,来保证测定结果的可靠性。结果显示,β1-AA可以使正常大鼠心肌细胞胞内游离钙水平显着升高(图9A,B),这一效应与β-AR激动剂Isoprenaline作用一致(图8A,B)。但是,与Isoprenaline不同的是β1-AA增加胞内游离钙的作用是持续的,可能具有不脱敏性(图8A,9A)。给予1μmol/Lβ1-AR选择性拮抗剂Bisoprolol后,可以几乎完全拮抗β1-AA对胞内游离钙升高的作用(图10A)；给予β1-AR-ECⅡ功能表位肽段后,可以逆转β1-AA升高胞内游离钙的作用(图10B)。结论1.用纯化的β1-AA长期被动免疫可建立与临床病人抗体水平匹配的心功能不全模型。2.β1-AA可通过激活β1-AR途径升高心肌细胞胞内游离钙的水平,这一作用与β-AR激动剂Isoprenaline一致。但与Isoprenaline不同的是,β1-AA升高胞内游离钙水平的作用可能具有不脱敏性。
王晓礽, 刘淼, 齐浩[5]2004年在《荧光分析技术在细胞内Ca~(2+)研究中的应用及钙离子比率荧光测量方法》文中研究表明Ca2+作为重要的细胞信号,在细胞信息传递中发挥着广泛而重要的作用,对活细胞内Ca2+ 进行准确、实时、原位的测量,是对其定量分析的关键.由于胞内Ca2+的浓度很低,并呈现复杂的时 空特异性等特点,因此,灵敏度较高的荧光分析技术在活细胞内Ca2+研究中的应用越来越广泛.综 述了这一方法的原理、应用价值、研究意义,并重点介绍了其中一种先进的技术方法--Ca2+比率 荧光测量方法.
张小玲[6]2002年在《新型细胞Ca～(2+)荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用》文中指出细胞内游离Ca~(2+)作为细胞重要的生理应答反应信使，具有重要的生物学功能。因此，细胞游离钙含量及其动态分布变化的测定已成为化学、生物学和基础及临床医学研究中的一个非常重要的研究领域，亦是现代分析化学重要的前沿研究热点。目前胞内游离钙的测定方法主要是应用Tsien等人合成的Quin-2、Indo-1、Fura-2及Fluo-3等钙荧光探针而建立的钙荧光指示剂法。然而，该类荧光探针或需要在紫外区激发，导致细胞自身荧光干扰及光损伤；或与Ca~(2+)结合后无荧光峰的位移，难以采用双波长比率法进行测定；或对于细胞内胞浆、胞核钙无特异性。迄今为止，尚未见既可长波激发、又与Ca~(2+)结合后荧光峰位移、且对胞内Ca~(2+)测定具特异性、可在亚细胞水平进行Ca~(2+)测定的整体性能优良的钙荧光探针及其在生命科学中的应用研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1．首次研究设计并成功合成了国内外文献迄今未见报道的两种新型钙荧光探针(简称STDIn和STDBT，已申请国家发明专利)，系统研究了所合成钙荧光探针的结构、光谱特性及细胞荧光标记特性。2．以所合成STDIn—AM为细胞钙荧光探针，采用共聚焦技术，研究了5—羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞胞内游离钙动员的机制，并与Fluo-3进行比较。表明所合成试剂STDIn—AM是目前国内外唯一的可以AM酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性Ca~(2+)荧光探针。3．首次发现了5—羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞产生的钙火花现象，探讨了其形成机制。4．采用了四种不同的活性氧产生体系，对自行合成Ca~(2+)荧光探针STDIn的耐氧化能力进行了考察。并进而以H_2O_2为外源性活性氧，STDIn-AM为探针标记HL—60细胞，激光共聚焦技术探讨了不同浓度H_2O_2对胞内Ca~(2+)的影响，从膜结构和生物信号转导的角度研究了氧自由基对培养细胞的生物学效应。5．采用量子化学方法对新荧光试剂及其Ca~(2+)络合物进行了研究，首次从理论上确定了新荧光试剂及其络合物的几何构型、金属离子在试剂分子中的络合位置，并研究了试剂结构参数与性能之间的关系。 本文靶向性细胞Ca~(2+)荧光探针的设计合成及其在生命科学研究中的应用研究，使细胞钙的测定由单细胞水平拓展到了亚细胞水平，为更深入的细胞信号转导研究提供了可行、有效的手段。这一研究结果，对于新型细胞探针试剂的设计合成，揭示生命科学中的重要生理应答反应信使—胞内游离Ca~(2+)的作用机制具有十分重要的理论意1穿北大学准味d匕学位创含文2002义和应用参考价值。 本研究论文包括以下四个部分:一细胞c扩+测定方法研究进展(综述) 对目前常用的几种细胞C扩+测定方法，特别是钙荧光指示剂法中细胞钙荧光探针的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述，引用截至2002年的文献103篇。在此基础上提出了自己拟进行的研究方向。二.新型细胞c扩+荧光探针的合成及性能研究 1.新型钙荧光探针的合成 设计合成了两种新型钙荧光探针一STDhi和STDBT(其中STDIn已制成相应AM酉旨型可导入细胞)。 2.新型钙荧光探针的性能研究 研究了试剂的结构、吸收及荧光光谱特性和细胞荧光标记特性。结果表明，所合成试剂既具备双波长钙荧光探针F盯a一2与c扩+结合前后吸收和荧光峰位移，又保持了长波长钙荧光探针Fluo一3荧光激发波长位于可见光区的特性。同时细胞荧光图像分析显示，sTDhi一AM进入细胞后只标记胞浆c扩+而不标记胞核c扩+，是目前唯一的可以 AM酉旨型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性C扩+荧光探针。并且其水溶性好，在胞浆内较Fhi小3等更易于负载。试剂整体性能优于目前国内外广泛采用的C扩+荧光探针。叁.新型c扩+荧光探针在生命科学研究中的应用 1.胞浆特异性c扩+荧光探针sTDhi用于5一轻色胺诱导培养胃底平滑肌细胞内游离钙动员机制的共聚焦研究 首次采用激光共聚焦技术分别进行了新型Ca=+荧光探针STDIn与Flu。一3对胃底平滑肌细胞的标记，及其对胞内游离CaZ+浓度变化的响应等特性的比较研究。结果表明，与Fluo一3不同，新型Ca2+荧光探针STDIn对胞浆Caz+具有靶向性，只标记胞浆而不进入胞核，是一种真正的胞浆Ca2+荧光探针，对5一轻色胺(5一HT)诱导的胞内游离Caz+浓度变化的响应更灵敏迅速。应用于5一HT诱导胃底平滑肌细胞胞内游离Ca2+动员的机制研究，发现5一HT通过促进外钙内流和内钙释放使[Caz+〕j升高;在胃底平滑肌5一HT升高〔Ca，‘〕，系通过5一HTZ受体介导的1 P3/Ca，‘和DG/PKC双信使途径;5一HT通过L型钙通道促进外钙内流。 2.5一HT诱导胃底平滑肌细胞钙火花的研究 以合成的胞浆特异性Caz+荧光探针STDhi一AM标记细胞，采用激光共聚焦线扫描技术，首次观察到5一HT诱导胃底平滑肌细胞胞内钙释放的最基本单位一一J塑必尝华盆翔望尝‘一盈些沁(elementary events)，“钙火花(ealeium sparks)”现象。提出其成因于肌质网上的单个和若干钙释放通道(亦称ryanodine受体)的开启的机理。 3.钙荧光探针STDIn对活性氧的耐受性和在HZO:对HL一60细?
吴琼[7]2013年在《基于荧光共振能量转移技术构建的锌离子荧光蛋白探针》文中进行了进一步梳理锌离子是细胞生命活动中不可缺少的重要金属离子,也是细胞内的一种信号离子,参与了细胞的多项生理生化功能,对人体健康有着极其重要的作用。荧光探针在研究生命体内离子浓度引起的生理效应变化中有着广阔的前景。现在开发出来的锌离子探针多为化学小分子类荧光探针,虽然它们现在已经被用于锌离子的检测和成像中,但是它们有很大缺陷,如不易导入活细胞、不具靶向性、对正常细胞生理功能有影响等。而荧光蛋白小分子探针却能很好地解决这些问题,它可以很容易通过基因转染在活细胞中表达、用基因工程的方法靶定到细胞的特定部位活体成像、对细胞的生理功能影响很小。采用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)技术的荧光蛋白探针可以对活细胞中的实时信号转导过程及小分子进行检测和成像,典型代表是钙离子成像探针Cameleon,而锌离子探针还处于初步的研发及完善阶段。为了能特异性检测锌离子,我们就设计了一种基于荧光共振能量转移技术利用金属硫蛋白来检测锌离子的荧光蛋白探针。本文主要是通过基因工程的方法构建体外原核表达荧光蛋白探针质粒载体pET28a(+)-ECFP-GGS-MT2A-a-GGSGG-cpCitrine174和真核体内荧光蛋白探针表达载体pCDNA3.1 (+)-ECFP-GGS-MT2A-a--GGSGG-cpCitrine 174:其基本设计是在MT2Aa蛋白亚基两端加入一对能产生FRET的荧光蛋白ECFP和cpCitrine174(重组环化突变的YFP),中间分别加入连接肽GGS和GGSGG,利用质粒pET28a(+)和pCDNA3.1(+)作为原核与真核表达载体,将以pET28a(+)为载体的质粒转化表达菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导表达,过Ni+柱纯化得到探针融合蛋白,并进行体外ITC和荧光光谱仪检测实验；将以pCDNA3.1(+)为载体的质粒瞬时转染HeLa细胞培养,并用荧光倒置显微镜进行成像分析并进行活细胞锌离子测定实验。实验表明,我们成功构建并在大肠杆菌中高效表达了锌离子荧光蛋白探针,有25mg·L-1的得率,纯度为74.8%,可以很方面进行体外测定实验。通过ITC实验测定探针对Zn2+和Cu2+体外结合实验,表明该探针在体外对Zn2+更具有亲和性。探针体外与各种金属离子反应荧光光谱检测表明,探针可对锌离子相对特异地作出高效反应,当加入过量锌离子后,探针释放的光谱在475nm处有明显的下降,而在527nm处有明显的升高,其动态范围Rmax/Rmin为3.0,我们设计的这个探针动态范围很大,灵敏度很高；虽然其他金属离子仍能引起探针一定程度的FRET荧光强度变化,但一般在活细胞中这些重金属离子浓度非常低,不会明显影响活细胞内探针对锌离子的检测。通过竞争性实验,我们发现加入其他金属离子后,该探针对锌离子的反应的荧光强度比值没有多大变化,说明其他金属离子不会明显影响该探针和锌离子的反应。而活细胞内锌离子荧光蛋白探针用于锌离子的成像实验让我们看到,整个HeLa细胞在这个实验过程中荧光强度比率发生了明显的变化,说明活细胞内锌离子荧光蛋白探针对Zn2+有很好地反应。最后,我们依据钙离子探针设计经验,推算出细胞内锌离子荧光蛋白探针测定游离锌离子浓度的公式,据此,可以利用该探针计算出活细胞内游离锌离子的浓度。
张小玲, 鲍霞, 贾宏瑛, 李春迎[8]2002年在《细胞Ca~(2+)测定研究进展》文中研究指明对细胞游离Ca~2的研究进行了综述。分析了细胞游离Ca~(2+)的信使作用以及常用分析研究方法,对其优、缺点进行了比较和评述。
参考文献：
[1]. 比率荧光光谱仪测量细胞内游离钙离子浓度的研究[D]. 郭祎. 西北大学. 2003
[2]. 新型吲哚类钙离子荧光指示剂的合成与性质研究[D]. 雷磊. 西北大学. 2011
[3]. 荧光法研究外源性小分子对淋巴细胞钙信号的影响[D]. 王海雁. 山西大学. 2008
[4]. β_1肾上腺素受体细胞外第二环自身抗体对大鼠心肌细胞胞内游离钙的增强作用[D]. 宋峰. 山西医科大学. 2010
[5]. 荧光分析技术在细胞内Ca~(2+)研究中的应用及钙离子比率荧光测量方法[J]. 王晓礽, 刘淼, 齐浩. 陕西师范大学学报(自然科学版). 2004
[6]. 新型细胞Ca～(2+)荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用[D]. 张小玲. 西北大学. 2002
[7]. 基于荧光共振能量转移技术构建的锌离子荧光蛋白探针[D]. 吴琼. 南京大学. 2013
[8]. 细胞Ca~(2+)测定研究进展[J]. 张小玲, 鲍霞, 贾宏瑛, 李春迎. 咸阳师范学院学报. 2002
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