(广西北海市中医医院检验科；广西北海536000）
摘要：目的 通过普通培养法与富集芽孢培养法的比较，看哪种方法检出率更高更适用于基层医疗单位。方法 收集本院2016年1月到12月全年住院腹泻病人100例，先用艰难梭菌GDH抗原快速检测，初筛阳性的样本再分别用普通培养法与富集芽孢培养法培养，分纯后分别上恒星HX-21鉴定仪。结果 100例病人标本，20例艰难梭菌GDH抗原快速检测为阳性，20例阳性标本再分别用普通培养法培养出6例，检出率为30%；富集芽孢培养法培养出12例，检出率为60% 结论 富集芽孢培养法有更高的检出率。
关键词：艰难梭菌 富集芽孢培养法 检出率
艰难梭菌是梭菌属的一个成员，对氧十分敏感，一般的厌氧环境不易生长，在CCFA平板上菌落呈白色或黄色、灰白色、不透明、边缘不规则、表面粗糙，用紫外线照射可见黄老绿色荧光。在厌氧培养血平板培养48小时，形成直径3~5mm、圆形白色、表面粗糙、不溶血的菌落[1]。革兰染色为革兰阳性,芽胞位于菌体次极端。
住院病人往往因为自身免疫力和生理年龄因素而感染艰难梭菌引起细菌性腹泻，但国外研究发现，多数患者入院时检测不到艰难梭菌，21%在住院期间发生了艰难梭菌腹泻。所有的抗生素及一些化疗药物与艰难梭菌引起的腹泻或假膜状结肠炎有关，最常见的是氨苄青霉素、克林达霉素和头孢菌素,基层医疗单位针对抗生素及一些化疗药物引起的腹泻往往未能找到相应的致病菌，给临床诊断带来了难度，可见艰难梭菌的实验室检测方法就变得尤为重要，市面上检测艰难梭菌的方法不少，比如酶联免疫吸附法（EIA）、细胞毒性测定（CTA）、乳酸脱氢酶（GDH）、聚合酶链反应（PCR）、粪便细菌培养等，在大多数的基层医院人员设备有限，开展的项目以传统粪便普通培养法为主，所以本次重点介绍富集芽孢培养法，以比较它们艰难梭菌的检出率。
1.材料与方法
1.1标本来源
本院2016年1月到12月全年住院腹泻成年病人100份粘液样或胶冻状粪便，所选择的成年病患者均为使用氨苄青霉素、克林达霉素和头孢菌素一周以后出现腹泻并且日拉便3次以上。
1.2材料
广州健仑艰难梭菌GDH抗原快速检测试剂盒；厌氧培养用Mart Anoxomat Mark厌氧微需氧培养箱；细菌鉴定仪为恒星HX-21；细菌鉴定板条为恒星HX-21革兰阳性芽孢菌属。
1.3方法
1.3.1CDMN培养基配制
量取35gCDMN琼脂加入500ml蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟，冷却至45℃左右加入35ml脱纤维羊血，无菌操作倒9CM平板待用。
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1.3.2CDMN营养肉汤配制
量取10g脑心浸液肉汤加入500ml蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟，冷却至45℃左右加入CDMN琼脂，并按1%比例加入牛磺胆酸钠，无菌试管每支分装5ml备用。
1.3.3GDH抗原快速检测（初筛）
将新鲜粪便标本按GDH抗原快速检测说明操作，同时出现质控带与检测带为阳性，阳性标本保留，待用。
1.3.4传统粪便细菌培养
将GDH抗原快速检测阳性的新鲜粪便标本接种于新配的CDMN培养基中，放Mart Anoxomat Mark厌氧微需氧培养箱中培养48~72小时，其间设定恒温35℃.
1.3.5富集芽孢培养法
将GDH抗原快速检测阳性的新鲜粪便标本接种于配好的CDMN营养肉汤试管，普通培养箱35℃孵育培养7天，之后取培养物加等体积的无水乙醇，室温静置1小时以后，3000r离心10分钟，取沉淀物接种于新配的CDMN培养基中，同样放Mart Anoxomat Mark厌氧微需氧培养箱中35℃培养48~72小时。
1.3.6分纯
将传统粪便细菌培养与富集芽孢培养法CDMN培养基中可疑的菌落，分别接种于CDMN培养基分纯和普通的血平板中进行耐氧培养。其中CDMN培养基放Mart Anoxomat Mark厌氧微需氧培养箱中培养24小时，普通的血平板置普通培养箱35℃培养小时。
1.3.7上板条
将传统粪便细菌培养与富集芽孢培养法CDMN培养基中可疑的菌落（普通血平板中进行耐氧培养不生长），按说明上恒星HX-21革兰阳性芽孢菌属板条，放Mart Anoxomat Mark厌氧微需氧培养箱中35℃培养24小时。
13.8添加辅助试剂
在恒星HX-21革兰阳性芽孢菌属板条B1孔加靛基质3滴，B2孔加革兰碘液1滴，B3孔加硝酸盐还原试剂甲、乙各一滴，B4孔加VP试剂甲、乙各一滴。
2、结果
2.1GDH抗原快速检测
100例住院腹泻病人粪便标本，阳性为20例，阳性率为20%。
2.2传统粪便细菌培养
20例GDH抗原快速检测初筛阳性的粪便标本，恒星HX-21鉴定为艰难梭菌的有6例，检出率为30%。
2.3富集芽孢培养法
20例GDH抗原快速检测初筛阳性的粪便标本，恒星HX-21鉴定为艰难梭菌的有12例，检出率为60%。
3、讨论
艰难梭菌对氧十分敏感，对培养基要求比较高，大型医院一直以来选择CCFA平板，其特点就是成品化，但成本比较高，阳性检出率一般，CDMN培养基相对成本低，阳性检出率相对高，合适基层医疗机构。粪便标本含大肠杆菌，肠球菌，其它需氧厌氧菌比较多，在传统粪便细菌培养中，艰难梭菌普遍被抑制，比较难培养出来。富集芽孢培养法使用的CDMN营养肉汤含1%比例的牛磺胆酸钠，牛磺胆酸钠能促进艰难梭菌芽孢的形成，让芽孢成倍的增长，另外培养物加等体积的无水乙醇能去除其它的杂菌，在进行CDMN培养基就减少杂菌的抑制和干扰，提高了阳性检出率。
本次实验，使用GDH抗原快速检测可以快速的测定粪便标本艰难梭菌的存在，和细菌培养相似，检测GDH只能确定艰难梭菌的存在，但不能确定是否产毒素，这类方法一般具有较好的特异性，灵敏度一般在70%左右,基因诊断二分步可以检测毒素A和毒素B，是目前比较认可的方法，灵敏度达96%，特异度达100%[2]，但实验环境和布局要求比较高，成本比较高，不合适基层医疗单位开展。在GDH抗原快速检测阳性的粪便标本，培养法未能培养出艰难梭菌原因有：第一，艰难梭菌存在于0-3%的正常成人粪便中，GDH抗原快速检测可以出现阳性，但含量比较小，即使CDMN营养肉汤培养7天，其芽孢数量用不多，CDMN厌氧培养后未能培养出艰难梭菌；第二，艰难梭菌严格厌氧，在留取或者运输粪便标本中可能已经死亡，故GDH抗原快速检测出现阳性，但富集芽孢培养法未能培养出艰难梭菌。
当然富集芽孢培养法也有自身的缺点就是芽孢孵育培养时间长，不适合门诊病人，但与传统粪便普通培养法比较，富集芽孢培养法成本比较低，操作简易，艰难梭菌检出率更高，适合在基层医疗机构推广使用。
参考文献
[1]陈东科主编，实用临床微生物学检验与图谱第一版，北京：人民卫生出版社，2011:542—543
[2]曲芬.艰难梭菌感染的流行状况及诊治进展2010;23(1):8—10
论文作者:黄日昇,李轶春
论文发表刊物:《医师在线》2018年1月下第2期
论文发表时间:2018/5/15
标签：芽孢论文; 阳性论文; 粪便论文; 艰难论文; 抗原论文; 检出论文; 标本论文; 《医师在线》2018年1月下第2期论文;