毛爱红[1]2016年在《MicroRNA-449a增强人前列腺癌细胞辐射敏感性的机制研究》文中研究指明前列腺癌是全球男性第二大常见癌症,是男性癌症死亡的第三大因素。目前,放射治疗是一种最常见的、疗效明确的局限性前列腺癌治疗方法。但前列腺癌放射治疗决不是无害的,其放射治疗的肠、尿道副作用必须予以考虑。另外,有相当多数的前列腺癌患者自首次接受放射治疗后,后期存在局部辐射耐受和复发。因此,如何提高前列腺癌细胞的辐射敏感性、降低放射治疗剂量、有效杀死肿瘤细胞、改善放射治疗的疗效仍是目前临床医生和科研工作者亟待解决的问题。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性、非编码小RNAs(约22nt),在转录后水平调节基因表达。在人类基因组中,目前已发现并鉴定出了4000多条人源miRNAs,靶向至少60%的蛋白编码基因。毫无疑问,miRNA作为重要的基因表达调控因子,影响多个信号传导通路,包括在电离辐射(Ionizing radiation,IR)诱导的DNA损伤应答(DNA damage response,DDR)中发挥重要作用。近年来,越来越多的实验证据表明,miRNA参与肿瘤细胞的辐射敏感性调控,可能成为一种新型的、临床肿瘤放射治疗的致敏靶分子。为了揭示miRNA在前列腺癌细胞应答电离辐射中的表达变化及作用,阐明miRNA影响前列腺癌细胞辐射敏感性的分子机制,本论文首次采用人源miRNA芯片技术研究了不同LET的12C6+离子辐照后前列腺癌细胞中miRNA表达谱变化,筛选出电离辐射后差异表达的miRNAs。随后进一步采用荧光定量反转录PCR(q RT-PCR)进行验证。结果显示:不同LET的12C6+离子和X-射线辐照处理LNCa P细胞24h后,miRNA的表达变化并不同,包括miR-17-92簇、miR-15/16家族、miR-34家族和let-7家族。在LNCa P细胞中,X-射线和30ke V/μm 12C6+离子辐照后24h,miR-17-92簇、miR-15/16家族miRNAs显著上调,而let-7和miR-34家族miRNAs表达下调。与X-射线辐照相比,70ke V/μm的12C6+离子辐照后引起更多的miRNAs表达变化,其中miR-17-92簇、miR-15/16家族的miRNAs表达显著下调,而let-7家族和miR-34家族miRNAs表达上升。值得关注的是,X-射线和不同LET的12C6+离II子辐照后,miR-449a表达均有上调,采用生物信息学在线预测软件Target Scan预测发现c-Myc是miR-449a的一个阳性靶基因。已有文献报道,在各种人类恶性肿瘤中,包括前列腺癌,miR-449a表达下调,而c-Mcy基因过表达。我们的q RT-PCR结果也显示:与正常前列腺组织相比,miR-449a在前列腺癌组织中表达下调,而c-Myc显著过表达。在细胞应答IR中,miR-449a在LNCa P细胞中被诱导表达,而c-Myc表达被抑制。相关性分析表明,miR-449a与c-Myc表达呈负相关性。随后,我们构建了表达miR-449a的重组质粒GV214-miR-449a和表达c-Myc 3′-UTR及c-Myc 3′-UTR突变的重组质粒GV272-c-Myc 3′-UTR wt/mut。双萤光素酶报告系统实验证实,在LNCa P细胞中miR-449a直接通过与c-Myc 3′-UTR相结合靶向抑制c-Myc表达。利用GV214-miR-449a转染前列腺癌LNCa P细胞,发现miR-449a增强IR诱导的细胞生长阻滞,提高LNCa P细胞对IR的敏感性。利用RNAi技术,敲低c-Myc表达同样增强LNCa P细胞的IR敏感性。这些研究结果说明:miR-449a可以通过靶向下调c-Myc表达来增强前列腺癌细胞的辐射敏感性。但进一步的研究发现:miR-449a增强肿瘤细胞电离辐射敏感性的功能并不是广泛的。在Rb野生型的LNCa P和PC-3细胞中过表达miR-449a,降低电离辐射后的细胞活性,增强电离辐射诱导的细胞增殖抑制,最终使LNCa P和PC-3细胞对电离辐射敏感;但在Rb突变的DU-145细胞中过表达miR-449a,电离辐射后,细胞周期分布并无显著性变化,细胞凋亡率增加也不明显。通过分析前列腺癌细胞的分子生物学特征及采用WB分析发现,LNCa P、PC-3和DU-145细胞有不同的p53和Rb蛋白表达状态。一方面,LNCa P细胞表达野生型的p53、DU-145表达含有p53233leu和p53274phe两种突变的p53,而PC-3细胞不表达任何p53蛋白,表现为p53缺失;另一方面,LNCa P和PC-3细胞表达野生型Rb蛋白,而DU-145细胞在Rb基因的21号外显子缺失105bp的碱基对,表达无活性的截短体RB蛋白。因此,推测miR-449a增强前列腺癌细胞的辐射敏感性可能与RB蛋白的状态相关。进一步采用WB分析检测细胞周期和凋亡相关的信号蛋白表达发现,miR-449a/c-Myc增强前列腺癌细胞的辐射敏感性与CDC25A/RB/E2F1信号通路相关。一方面,miR-449a/c-Myc可通过抑制CDC25A/RB/E2F1信号通路及Cyclin B1/Cdc2周期相关蛋白增强电离辐射诱导的G2/M期阻滞。另一方面,miR-449a/c-Myc也可通过下调凋亡靶基因Bcl-2的表达,激活线粒体凋亡信号通路相关的蛋白表达,诱导细胞凋亡。这些研究结果为探讨前列腺癌的发生发展分子机理提供了新思路,考虑到miR-449a增强前列腺癌细胞辐射敏感性的潜能,本文的研究结果可为前列腺癌的放射治疗提供一个新靶点。
郭建全[2]2016年在《雷公藤红素抑制AR诱导前列腺癌细胞自噬的分子机制研究》文中研究说明前列腺癌是一种威胁男性健康的重大疾病,雄激素受体(Androgen Receptor,AR)信号通路在前列腺癌的发生与演进过程中发挥重要作用,因此,临床上通过手术或药物抑制AR信号通路是治疗早期前列腺癌的标准方法。但是雄激素剥夺只能在一段时间内延长患者的生存期,多数患者会在2年内发生癌症复发,发展为浸润性更强的去势抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)。目前的研究结果显示,去势抵抗的形成来源于AR信号通路被重新激活。基于此,已经有多种新型阻断AR信号通路的药物用于临床。雷公藤红素是从传统中药雷公藤根部分离的三萜烯类化合物,其化学结构与第三代AR信号通路阻断剂TOK-001相似,作用于AR降解途径,对CRPC的治疗具有潜在的应用效果。研究表明,抑制AR信号通路诱导细胞自噬。本研究首先分析了雷公藤红素抑制AR信号通路对细胞自噬的诱导。q PCR显示雷公藤红素诱导ATG5和ATG7基因表达上调;共聚焦显微镜观察发现雷公藤红素作用后自噬体与自噬斑数量增多;免疫印迹结果显示雷公藤红素处理后自噬标志物LC3-II/LC3-I比值升高,且自噬体受体蛋白p62表达降低,表明雷公藤红素诱导细胞自噬的发生,并促进自噬潮的进行。在雷公藤红素诱导细胞自噬过程中,伴随着AR蛋白的降低,提示AR负调控雷公藤红素诱导的细胞自噬。为进一步探究AR和雷公藤红素诱导的细胞自噬的关系,本研究通过RNAi技术沉默AR,结果显示AR沉默后细胞自噬水平升高;相反,过表达AR或通过R1881激活内源性AR则抑制基础水平以及雷公藤红素诱导的细胞自噬。这些结果表明,AR负调控雷公藤红素诱导的细胞自噬。抑制AR信号通路将诱导细胞凋亡,而凋亡间接地诱导自噬的发生。为分析凋亡的间接影响,我们利用雄激素阻断剂MDV3100抑制AR信号通路,证实在未发生凋亡的条件下,AR与自噬呈负相关。同样,雷公藤红素在不影响凋亡的条件下降低AR,导致细胞自噬。通过抑制剂处理进一步发现,凋亡被抑制不影响雷公藤红素诱导的细胞自噬;而自噬被抑制则促进细胞凋亡。AR作为转录因子既可以调控功能基因的转录,也可以调控非编码基因的转录。通过miRNA表达谱分析发现,雷公藤红素诱导自噬过程中miR-101以及miR-17-92a基因簇的表达显著下调,该结果通过q PCR得以验证。鉴于miR-101以及miR-17-92a基因簇的启动子区可以预测雄激素反应元件(ARE),我们推测AR转录激活这两个miRNAs抑制自噬。通过双荧光素酶报告基因分析以及染色质免疫沉淀证明AR能够与miR-101和miR-17-92a基因簇预测的ARE结合。在前列腺癌细胞系,miR-101和miR-17-92a基因簇的表达与AR表达水平呈正相关。在AR阳性细胞沉默AR基因造成miR-101和miR-17-92a基因簇的表达下调;在AR阴性细胞过表达AR基因造成二者表达上调。这些结果进一步证实AR转录激活miR-101和miR-17-92a基因簇。miR-101为自噬抑制剂。雷公藤红素降低AR,解除了其对自噬的抑制,但转染miR-101类似物可以弥补AR对自噬的抑制作用;过表达AR增强对自噬的抑制,但miR-101抑制剂共转染可以逆转AR高表达对自噬的抑制效应,表明miR-101是AR抑制雷公藤红素诱导的细胞自噬的一个效应分子。miR-17-92a基因簇与细胞自噬的调控关系未见报道,本研究通过蛋白免疫印迹实验和共聚焦显微镜观察,确认miR-17-92a基因簇抑制基础水平以及雷公藤红素诱导的细胞自噬。通过构建miR-17-92a基因簇的截短体,解析miR-17-92a基因簇成员分子与细胞自噬的关系,结果显示在基因簇中miR-17和miR-20a能够抑制基础水平以及雷公藤红素诱导的细胞自噬;而miR-18a则激活雷公藤红素诱导的细胞自噬。通过双荧光素酶报告实验、q PCR以及免疫印迹杂交对miR-17和miR-20a靶基因进行验证,确认ATG7是miR-17和miR-20a的下游调控基因。通过转染缺少3￠UTR的ATG7的表达载体进行细胞自噬恢复实验,结果进一步明确miR-17和miR-20a通过调控ATG7抑制雷公藤红素诱导的细胞自噬。为了明确雷公藤红素诱导自噬在前列腺癌中的作用,本研究进行了MTT以及克隆形成实验,结果显示细胞自噬被miR-101、miR-17、miR-20a以及巴弗洛霉素抑制后,活细胞数以及细胞的克隆形成能力均下降,表明雷公藤红素诱导的细胞自噬对前列腺癌细胞的存活具有保护效应。综上所述,本研究揭示了AR对细胞自噬的负调控作用,阐明了雷公藤红素通过抑制AR,降低自噬抑制因子miR-101以及miR-17-92a基因簇的表达进而诱导细胞自噬。通过自噬抑制剂或miR-101以及miR-17-92a基因簇抑制自噬,可以提高前列腺癌细胞对雷公藤红素的反应,表明自噬对肿瘤细胞生存具有保护作用。
俞岚[3]2010年在《PC-1促进前列腺癌进展的分子机制及在治疗中的意义研究》文中指出PC-1基因是本实验室周建光研究员发现并克隆得到的一个TPD52家族的新成员,是一个雄激素应答基因,在人前列腺组织中特异表达。PC-1在早期非转移、雄激素依赖前列腺癌LNCaP细胞中低表达而在晚期雄激素非依赖且骨转移的C4-2细胞中高表达;对前列腺癌的临床组织样本的免疫组化检测表明,PC-1随着前列腺癌分级的增加表达升高。因此本实验室前期研究了这个基因在前列腺癌进展中的作用,发现PC-1基因表达可促进前列腺癌细胞增殖,促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性生长,促进前列腺癌的恶性进展。这些研究表明PC-1具有癌基因的性质。但PC-1在临床药物治疗以及放射治疗中的作用还不明确,PC-1发挥生物学作用所涉及的下游分子及详细的分子机制没有研究清楚。为此,我们进行了一系列实验以确定PC-1的重要生物学意义及其所参与的分子事件,取得了如下主要进展:(1)用前列腺癌内分泌治疗药物雄激素拮抗剂casodex作用PC-1不同表达水平的前列腺癌细胞,发现PC-1基因表达在抗雄激素药物作用下依然促进前列腺癌细胞生长,表明PC-1可以拮抗抗雄激素药物对前列腺癌生长的抑制作用。同时检测了一些生长调控因子表达的变化,发现PC-1调节如Rb、cyclinE、p21和p27等重要细胞周期相关基因的表达,表明PC-1可能通过调节细胞周期调控因子参与细胞周期进程从而拮抗抗雄激素药物的作用。(2)进一步检测了PC-1对抗肿瘤药物LY294002和rapamycin(雷帕霉素)耐药性的影响,发现PC-1表达并不影响LY294002对前列腺癌细胞的抑制作用;而RNAi沉默PC-1表达和rapamycin联合使用可以显著抑制前列腺癌细胞的生长,与此对应PC-1高表达可以显著抑制rapamycin所诱发的细胞G0/G1期阻滞和其诱导的细胞自噬。进一步检测mTOR信号通路的变化情况,结果表明PC-1表达可以显著增加LNCaP细胞中mTOR底物4E-BP1的表达,RNAi沉默C4-2细胞中内源性PC-1的表达则会降低4E-BP1蛋白的水平,且PC-1高表达可以拮抗mTOR抑制剂rapamycin对4E-BP1的抑制作用。利用免疫沉淀、免疫印迹、GST-pull down方法证明PC-1和4E-BP1在细胞内和体外直接发生蛋白质分子间相互作用,4E-BP1蛋白在前列腺癌细胞中可通过泛素化蛋白酶体途径降解,进一步发现PC-1通过降低4E-BP1蛋白的泛素化水平维持其稳定性;对40例前列腺癌临床标本免疫组化检测表明PC-1和4E-BP1蛋白表达在前列腺癌进程中高度相关。(3)放射治疗仍然是局部前列腺癌的主要治疗手段之一。本研究利用MTT和克隆形成实验发现,沉默PC-1基因表达增加前列腺癌C4-2细胞辐射敏感性。γH2AX Ser139磷酸化焦点检测证明,PC-1基因沉默能够降低辐射诱导DNA损伤修复能力。进一步检测发现PC-1表达受辐射诱导,可于DNA损伤后定位于DSBs位点,并且影响照后DNA-PKcs自磷酸化位点S2056的升高,提示PC-1可能通过调节DNA-PKcs活性参与DNA损伤修复过程。同时发现PC-1表达沉默细胞4Gyγ射线照射后G2/M期阻滞延长,Cyclin B1蛋白表达水平高于对照细胞,表明PC-1可能参与DNA双链断裂损伤诱发的G2/M期阻滞调节过程。(4)为了进一步探知PC-1影响的未知分子和信号通路,利用Affymetrix的基因表达谱芯片对PC-1影响的基因进行筛选。基因芯片结果mTOR信号通路相关分子如EIF4A2在LNCaP-pc-1中上调,一些翻译起始因子如EIF4G3、EIF5A2等在LNCaP-pc-1中也发生了改变,这与之前的研究PC-1激活mTOR信号通路结果一致。细胞周期相关的基因也发生了变化。其中筛选到一些细胞运动、迁移和粘附及细胞骨架基因,如JAG1,THBS1,DSC3,MAP2,TUBA3和NEDD9等。(5)通过酵母双杂交筛选发现细胞骨架蛋白FLNa和PC-1发生蛋白质分子间相互作用,免疫沉淀、免疫印迹方法证明PC-1和FLNa在体内相互作用,GST-pull down实验证明PC-1和FLNa在体外相互作用,且PC-1 N端46个氨基酸结构域和亮氨酸拉链结构负责和FLNa的相互作用。免疫荧光实验发现两者在LNCaP细胞的细胞膜褶皱共定位,而且当PC-1和FLNa共转LNCaP细胞后,运动旺盛细胞显著增加,细胞形态发生明显改变,表明PC-1和FLNa相互作用可能影响了前列腺癌细胞骨架装配,从而影响前列腺癌细胞的运动和侵袭。进一步伤口愈合实验发现PC-1沉默使C4-2细胞体外迁移能力降低。以上结果表明PC-1和FLNa相互作用可能影响前列腺癌细胞的形态、运动和迁移。(6)另外,本研究还构建了FLNa沉默的前列腺癌LNCaP和C4-2细胞株,细胞水平实验结果表明FLNa沉默促进了前列腺癌细胞的增殖、存活和恶性化程度,初步证明FLNa可能是一个新的前列腺癌抑制基因。本研究发现PC-1在前列腺癌的发生发展中参与调控多种细胞活动,包括细胞增殖、细胞黏附迁移、细胞周期以及DNA损伤修复等,鉴于这些发现,PC-1将有可能成为一个前列腺癌治疗的有效分子靶标。
胡中一[4]2014年在《癌基因AGR2和双联苄化合物介导的DNA损伤信号在前列腺癌细胞衰老和凋亡中的作用》文中研究表明前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是老年男性常见的恶性肿瘤,其死亡率仅次于肺癌。数据显示,2012年新诊断的前列腺癌患者为110万,约占新增癌症病例总数的15%,其中四期PCa患者5年生存率仅为20%,10年生存率低于10%。虽然我国PCa的发病率明显低于欧美国家,但近年来随着人口老龄化、生活环境和饮食结构的改变等,我国PCa发病率增长迅速,且中晚期患者的比例远远大于国外,恶性程度高,预后差。预计2020年前后,我国前列腺癌发病率可能会超过60-70/10万。前列腺癌已成为临床关注的男性恶性疾病之一。PCa作为激素依赖性肿瘤,去势治疗是首选标准方案,约80%的前列腺癌对去势治疗敏感。然而绝大多数PCa患者经去势治疗1-2年后,肿瘤复发,成为激素难治性前列腺癌(Hormone Refractory Prostate Cancer, HRPC),抵抗内分泌治疗,抗凋亡能力强,伴随肿瘤的侵袭转移,死亡率高,预后差。由于HRPC的发展和演变是复杂的多因素、多信号通路参与的过程,目前的研究主要侧重于两方面,一是HRPC发生发展的机制,二是新靶点的鉴定及其干预药物。我们利用生物信息学技术,通过分析癌症和肿瘤基因图谱(Cancer Genome Atlas, TCGA)计划所提供的大规模基因组测序数据,绘制了人前列腺癌的基因组变异图谱,并进行系统分析,确定与HRPC的分期、侵袭转移、药物耐受等恶性表型密切相关的基因,筛选出AGR2为候选靶基因之一。由于TCGA的数据基础主要来自欧美人群,我们又利用中国汉族人群PCa患者的临床样本进行分析,发现AGR2与中国汉族人群PCa患者的恶性表型密切相关。进一步研究发现,降低AGR2在PCa细胞中的表达,可通过DNA损伤应答机制诱导细胞衰老。同时发现具有拓扑异构酶抑制活性的天然联苄化合物,可通过DNA损伤应答信号诱导PCa细胞衰老,而在DNA损伤程度较强时诱导激素非依赖PCa细胞凋亡。另外还发现,联苄化合物可通过抑制雄激素受体的表达和功能诱导激素依赖性PCa细胞凋亡。第一部分基于前列腺癌基因组图谱的AGR2功能分析与AGR2缺乏介导的DNA损伤诱导前列腺癌细胞衰老的机制作用目前已知的癌症有200多种,但是所有肿瘤在特殊类别(分型)或发展的不同分期方面都发现有基因组的特异变化,而正是基因组的改变导致了细胞分化、发育和生长通路的异常,从而引发细胞增殖、生长的失控。本论文通过分析癌症和肿瘤基因图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)计划所提供的大规模基因组测序数据,绘制了人类前列腺癌的基因组变异图谱,并进行系统分析,旨在找到所有癌基因和抑癌基因的微小变异,分析其在前列腺癌发生、发展的变化趋势及可能的作用,确定能够驱动PCa发生的潜在drivers或治疗靶点,以期发现前列腺癌发生发展和治疗的新策略。前梯度同源蛋白2(Anterior gradient protein2homolog, AGR2)是本课题组通过前列腺癌基因组图谱分析得到的候选靶基因之一。现已报道多种肿瘤的发生与发展伴随着AGR2表达的上调,包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和胰腺癌等等。在正常的前列腺组织中,AGR2受雄激素诱导表达,但是对前列腺癌样品的显微切割分析表明AGR2的mRNA和蛋白水平都较临近的良性组织有显著的升高。最近有报道指出,在前列腺癌患者的尿液中检测到高水平的AGR2,因此AGR2有望作为前列腺癌的尿检标志物。到目前为止,尚未报道过汉族人群前列腺癌组织中AGR2蛋白的表达情况及作用机制。本课题组对汉族人群前列腺组织AGR2蛋白的表达做了检测,发现在汉族人群前列腺癌组织中AGR2的表达水平显著高于良性组织,同时在前列腺癌细胞系中也观察到AGR2的表达明显高于前列腺正常上皮细胞,并首次发现和提出抑制前列腺癌细胞中AGR2的表达可导致显著性细胞衰老。通过详细剖析AGR2基因在前列腺癌细胞中的生物学功能,表明AGR2在前列腺癌检测和治疗中具有潜在价值。一、前列腺癌基因组图谱的绘制1.前列腺癌转录组严重失调。通过对256例前列腺癌组织以及45例前列腺癌旁正常组织的转录组测序(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing, RNASeq)数据分析,癌组织中24%以上的基因较正常组织有显著性上调或下调,其中蛋白编码基因(Protein-coding genes, PCGene)失调率为28.53%,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)失调率为27.64%,假基因(Pseudogene)失调率为16.61%。2.前列腺癌体细胞基因组中存在DNA序列拷贝数的畸变。通过对258例前列腺癌样本以及相匹配的正常对照组织的高分辨率单核苷酸多态性基因分型芯片(Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array6.0,SNP6.0)分析,共找到了2448个拷贝数异常的基因,包括961个PCGene,808个lncRNA和679个Psuedogeneo3.前列腺癌表观遗传学分析。通过对252例前列腺癌组织以及49例前列腺癌旁正常组织的全基因组甲基化芯片(Illumina Infinium HumanMethylation450BeadChip)分析,得到了2617个前列腺癌特异性过甲基化基因,提示前列腺癌中存在全基因组甲基化失衡。对259例前列腺癌组织以及50例前列腺癌旁正常组织的：miRNA深度测序(miRNASeq)数据分析显示,前列腺癌组织中36.90%的miRNA较正常组织有显著性上调或下调。二、基于图谱信息和实验数据对AGR2的表达和功能的分析1.AGR2基因在PCa组织中表达显著上调。通过对前列腺癌INASeq数据分析,发现AGR2基因在前列腺组织中有较高的基础丰度,而且在PCa组织中的表达丰度上调非常显著。而DNA序列拷贝数数据分析结果表明,AGR2的拷贝数在正常组织和癌组织中并无显著差异。另外,全基因组甲基化芯片分析结果显示,AGR2在肿瘤组织中并无异常甲基化修饰。这些结果表明,AGR2在PCa中的高表达并非拷贝数增加或甲基化异常,而mRNA稳定性增加、或在转录水平表达增强等机制可能参与其调控,尚需进行研究。2.AGR2在中国汉族人群PCa患者的组织中表达显著上调。由于TCGA的数据和文献报道主要来自欧美国家人群,而PCa的发生与种族有关。到目前为止,中国汉族人群前列腺癌患者组织中AGR2蛋白的表达情况及功能尚未报道。本课题通过免疫组化技术分析汉族人群良性前列腺增生、前列腺癌组织中AGR2蛋白的表达情况,结果显示,汉族人群前列腺癌组织中AGR2的表达水平显著高于良性组织,与欧美人群的表达趋势一致。Western blotting结果显示,AGR2在前列腺癌细胞系中的表达明显高于前列腺非恶性上皮细胞。因此,上述结果显示,AGR2基因在前列腺癌组织和细胞中的表达调控、生物学功能都有待进一步研究,以阐明其在前列腺癌发生发展和治疗中的潜在价值。3.AGR2在前列腺癌中的功能。基于RNASeq数据组对AGR2的连坐效应相关分析(Guilt-by-Association,GBA)提示,AGR2在前列腺癌中的功能可能与细胞周期、DNA损伤修复、细胞粘附等相关。文献已有报道,AGR2与细胞的增殖、侵袭转移等有关,但机制尚需进一步研究。三、DNA损伤应答参与AGR2介导的前列腺癌细胞衰老的机制研究1.下调AGR2抑制PCa细胞增殖。上述结果表明,AGR2在中国汉族人群PCa组织、细胞系中高表达,我们首先在AGR2表达相对较高的PC3细胞中通过RNAi下调AGR2的表达,观察细胞表型的变化。MTT结果显示,下调AGR2后,显著抑制PC3细胞的增殖。相反,在AGR2表达相对较低的LNCaP和DU145细胞中转染AGR2的表达质粒,细胞的存活数显著增加。BrdU掺入实验结果显示,三种PCa细胞中下调AGR2的表达后,BrdU的掺入显著降低,表明AGR2促进细胞增殖。Western blotting结果显示,下调AGR2后,抑制PCa细胞增殖、存活信号通路,如p-Akt表达水平下降,但Akt总蛋白的表达水平并无变化；p-ERK的水平略有下调,对总ERK蛋白的表达水平无影响。2.下调AGR2阻滞PCa细胞周期进程。免疫组化结果显示,PCa组织中AGR2的高表达伴随着周期蛋白Cyclin D1的表达上调,而周期抑制因子p16、pRb在良性前列腺增生、前列腺内皮肉瘤中表达升高,但在PCa组织中表达显著下调。IINAi结果显示,下调AGR2的表达,PCa细胞显著阻滞于G1期。3.抑制AGR2的表达诱导前列腺癌细胞衰老。利用siRNA抑制AGR2的表达后,PCa细胞扁平胀大呈现明显的细胞衰老形态。衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence associated P-galactosidase,SA-β-Gal)染色和衰老相关异染色质聚集灶(Senescence-associated heterochromatin foci,SHAF)分析进一步确认抑制AGR2表达可诱导前列腺癌细胞衰老。4.干扰AGR2的表达上调细胞周期抑制因子从而引起细胞衰老。在前列腺癌细胞系LNCaP(表达野生型p53)和PC3(p53无)中抑制AGR2表达后,p21以p53非依赖的方式表达上调,Cyclin D1、pRb的表达显著下降,p16的表达有所增加。RNAi实验结果表明,下调AGR2后诱导的LNCaP和PC3细胞衰老过程依赖于p21的激活。而在DU145细胞中(表达野生型PTEN,无功能性p53),下调AGR2的表达,使PTEN的表达有所增加,显著诱导p27的表达,而p16的表达有所增加,p21的变化不显著。进一步分析证实下调AGR2诱导的DU145细胞衰老则部分依赖于p27信号通路。5.抑制AGR2的表达诱导细胞衰老伴随DNA损伤。由于DNA损伤应答信号是诱导细胞衰老的主要机制之一,我们利用荧光抗体标记、流式分析DNA损伤的标志蛋白yH2AX的变化,结果显示,下调AGR2表达后,LNCaP和PC3细胞中yH2AX的表达显著增加,DU145细胞中yH2AX表达上调,但较LNCaP和PC3细胞弱,表明,DNA损伤参与AGR2下调诱导的细胞衰老过程,但机制尚需进一步探讨。第二部分DNA损伤应答抑制DNA损伤修复引起细胞衰老或凋亡的机制研究由于下调癌基因AGR2的表达,可诱导PCa细胞衰老,使我们进一步分析诱导细胞衰老作为PCa治疗的可能性。由于衰老细胞缺乏增殖能力,这无疑有利于肿瘤的治疗,因此诱导肿瘤细胞衰老(Prosenescence therapy)成为近年来的研究热点。研究发现,化疗(如DNA损伤药物顺铂、多柔比星等)后,肿瘤组织中除了凋亡细胞外,也产生衰老细胞,称为TIS (Therapy-Induced Senescence)。DNA损伤药物是目前研究较多的促进细胞衰老的诱导剂。药物诱导的DNA损伤类型有多种,例如喜树碱和依托泊苷可以通过捕获拓扑异构酶-DNA复合物触发DNA单链或双链的断裂；顺铂可与DNA结合,产生链内交联与链间交联,从而破坏DNA的功能；环磷酰胺可使DNA分子中的鸟嘌呤N7烷化后除去,留下缺失碱基后的空隙,造成移码突变。并且一种DNA损伤剂往往可以同时引起几种类型的损伤,其损伤效应的大小和类型与剂量及细胞所处的周期状态有关。对于不同的DNA损伤病变,特异的DNA损伤检控点通路将被激活。DNA损伤检控点通路是由一系列检控蛋白构成的复杂的信号转导网络,在细胞周期转换、DNA复制和染色体分离中发挥重要的作用,并对DNA损伤做出及时应答启动修复,以防止基因突变和遗传不稳定的发生。研究表明,毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated, ATM)、毛细血管扩张性共济失调症突变Rad3相关蛋白(ATM and Rad3-related,ATR)在DNA损伤应答系统中起到了至关重要的作用。ATM主要应对双链断裂,当DNA双链受损时,ATM发生自磷酸化并激活一系列下游分子,包括Chk2, BRCA1和NBS1等,在这些因子的共同作用下,细胞的应激系统被启动,产生周期阻滞,并进行DNA修复,细胞衰老和凋亡也可能随之发生。当细胞受到严重的DNA复制压力时ATR将被激活,并磷酸化Chkl,激活下游Cdc25分子,抑制CDK1/Cyclin B复合物活性使细胞周期阻滞,进而启动DNA修复程序。DNA双链断裂主要有两种修复机制,同源重组(homologous recombination,HR)和DNA末端链接(nonhomologous end joining,NHEJ)。HR修复是利用细胞内的染色体两两对应的特性,若其中一条染色体上的DNA发生双股断裂,则另一条染色体上对应的DNA序列即可当作修复的模版来回复断裂前的序列；NHEJ修复不需要任何模版,修复蛋白Ku70/86可以直接将双股裂断的末端彼此拉近,再借由DNA黏合酶的帮助下,将断裂的两股重新接合。DNA损伤检控点信号转导通路功能和DNA修复机制异常,DNA损伤不能及时得到修复,细胞将会走向衰老或凋亡。本课题组研究发现,双联苄化合物RD,能够诱导前列腺癌细胞DNA损伤,抑制DNA损伤修复,最终诱导前列腺癌细胞走向衰老或凋亡。一、低剂量片叶苔素D诱导前列腺癌细胞产生p21依赖的细胞衰老1.低剂量RD诱导前列腺癌细胞衰老。0.5μmol/L的RD处理细胞10天后,前列腺癌细胞PC3、DU145和LNCaP均出现细胞克隆能力显著下降、周期阻滞、细胞形态扁平胀大等细胞衰老特征。衰老相关β-半乳糖苷酶染色和衰老相关分泌表型(enescence-associated secretory phenotype,SASP)分析证实,RD诱导前列腺癌细胞产生明显的细胞衰老。DNA损伤标志蛋白yH2AX的免疫荧光结果显示,低剂量的P.D诱导前列腺癌细胞产生了明显的DNA损伤,Western-blotting结果显示,DNA损伤检控点蛋白Chkl/2和损伤修复相关蛋白Ku70/86与p-BRCAl表达受到抑制。以上结果提示,低剂量RD可能通过诱导引起前列腺癌细胞DNA损伤并抑制损伤修复,从而诱导细胞衰老。2.低剂量RD诱导的细胞衰老依赖于p21的激活。Western-blotting和实时定量PCR结果显示,RD处理后,前列腺癌细胞p21的表达显著增高。利用siRNA特异性的降低p21的表达,可显著逆转RD诱导的细胞衰老。3.RD诱导荷瘤动物体内癌细胞衰老。裸鼠荷瘤实验表明,RD能显著抑制荷瘤动物体内癌细胞生长。衰老相关β-半乳糖苷酶染色和衰老相关异染色质聚集灶分析表明,RD处理后,裸鼠体内癌细胞出现明显的细胞衰老。DNA损伤标志蛋白γH2AX的免疫组化结果显示,RD诱导裸鼠体内癌细胞出现明显的DNA损伤。免疫组化结果显示p21在RD处理组的裸鼠癌细胞中的表达显著上调,提示RD诱导裸鼠体内癌细胞衰老的机制可能与p21的激活有关。二、片叶苔素D诱导前列腺癌细胞DNA损伤并抑制损伤修复1.片叶苔素D诱导前列腺癌细胞DNA损伤,激活损伤应答程序。细胞周期分析结果显示,终浓度10μmol/L的RD处理细胞24h后,前列腺癌细胞细胞周期被明显阻滞在G2/M期,并伴随大量的细胞凋亡。yH2AX焦点分析、微核试验和彗星实验结果均证实,10μmol/L的RD诱导前列腺癌细胞PC3产生明显的DNA损伤。时相分析显示,DNA损伤检控点通路ATM/Chk2和ATR/Chkl在处理1h后显著激活。ATM/ATR抑制剂处理细胞后,能部分逆转片RD导致的细胞增殖抑制。2.片叶苔素D显著抑制DNA损伤修复。Western-blotting结果显示10μmol/L的RD显著抑制DNA损伤修复相关蛋白BRCA1的表达；DNA修复活性检测表明,RD显著抑制了HR和NHEJ修复系统功能,并抑制了DNA修复酶Ku70/86的表达和活性。基因芯片结果分析显示,受RD影响的基因主要集中在细胞增殖,细胞周期,DNA损伤和修复,以及凋亡相关通路。3.片叶苔素D诱导荷瘤动物癌细胞DNA损伤。裸鼠荷瘤实验表明,RD能显著抑制荷瘤动物体内癌细胞生长。Western-blotting和免疫荧光结果显示,RD能够改裸鼠体内癌细胞DNA损伤修复以及细胞凋亡相关通路基因的表达。其中DNA损伤标志蛋白yH2AX的显著上调表明,RD处理的裸鼠癌细胞存在明显的DNA损伤。第三部分双联苄化合物抑制雄激素依赖性前列腺癌细胞增殖机制研究随着肿瘤细胞生物学和肿瘤分子生物学研究的发展,人类对癌症的认识越来越深入,在肿瘤治疗方面取得了很多振奋人心的成果。例如：小分子化合物多西紫杉醇对去势治疗失败的转移性前列腺癌患者显示出明显生存优势,极大的改善了晚期前列腺癌患者的生存期。然而过半的前列腺癌患者存在药物不敏感及耐药现象,因而亟待研发新的抗肿瘤药物。双联苄(Bisbibenzyls)是从苔藓植物分离提纯得到的一类大环多酚类化合物,这类化合物结构新颖、多变,联苄之间具有连接方式和取代基团多样化的特点。前期研究发现这种化合物具有抗肿瘤、抗炎、抗真菌等多种生物活性,具有良好的开发应用潜力和前景。本课题组基于双联苄类化合物片叶苔素C(Riccardin C)、地钱素M(Marchantin M,MM)和片叶苔素D(Riccardin D)对雄激素依赖性细胞系LNCaP的增殖抑制作用,研究了其具体机制。近年来研究显示,P13K信号途径对雄激素非依赖性前列腺癌的发生起重要作用,而AR信号通路则是激素依赖性前列腺癌增殖的关键途径。雄激素受体(Androgenreceptor,AR)是一种核受体型转录因子,当雄激素与AR结合后,会引起AR构象的改变,使AR与热休克蛋白90(HSP-90)解离,随即活化而转移至细胞核内,并形成同源二聚体与雄激素受体应答元件(AREs)结合,诱导下游靶基因的转录表达,促进细胞增殖。因此,有效抑制雄激素依赖的前列腺癌中AR的表达和功能一直是倍受关注的热点话题。本课题研究结果显示,双联苄化合物片叶苔素C(Riccardin C)、MM和RD能显著抑制雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP的增殖能力。由于AR是LNCaP细胞增殖存活的关键调控因子,我们研究了双联苄化合物对AR表达和功能的影响以及与LNCaP增殖抑制之间的关系。一、双联苄化合物抑制AR的表达和功能促进LNCaP细胞凋亡1.RC、MM和RD抑制雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP恶性增殖。RC、MM和RD将LNCaP细胞周期阻滞在G0/G1期,并伴随着p53和p21蛋白水平的增高；Western-blotting结果显示,双联苄化合物处理后Bax/Bc12蛋白比例和PARP剪切形式明显增加,表明LNCaP细胞产生明显的凋亡。2. LNCaP细胞凋亡伴随着AR表达和活性的降低。荧光素酶报告基因分析和Western-blotting结果显示,RC、MM和RD明显抑制LNCaP细胞AR的转录活性和蛋白表达。当双联苄化合物处理后,LNCaP细胞中PSA启动子活性降低,免疫共沉淀(co-IP)结果显示AR与SRC-1结合减弱,提示AR的功能受到明显抑制。3.双联苄化合物抑制蛋白酶体活性诱导LNCaP细胞自噬。RC、MM或RD处理细胞24h后,蛋白酶体活性显著下降,Western-blotting和co-IP结果显示,泛素化AR在细胞内蓄积。LC3蛋白表达及免疫荧光分析证实双联苄化合物引起LNCaP细胞自噬,AR、 LC3及Ub的公定位分析提示,泛素化AR的降解与细胞自噬有关。第四部分结论及创新点一、结论1.前列腺癌组织基因组较正常组织出现了明显的变异。2.AGR2在前列腺组织中高表达,抑制AGR2诱导前列腺癌细胞衰老。4.片叶苔素D诱导前列腺癌细胞DNA损伤并抑制损伤修复,引起前列腺癌细胞衰老或凋亡。5.双联苄化合物能够抑制激素依赖的前列腺癌细胞AR的表达和功能,从而抑制其恶性增殖。二、创新点1.利用大样本、多平台、高通量的基因组学手段,细致绘制了前列腺癌基因图谱。为研究前列腺癌细胞发生、发展机制,探索新的诊断和治疗方法,提供了坚实的理论基础。2.首次报道AGR2在汉族人群前列腺癌患者中的表达分布,首次发现和提出在前列腺癌细胞中抑制AGR2的表达可诱导癌细胞衰老。2.首次报道双联苄化合物抑制AR的表达和功能,进而促进细胞凋亡。由于LNCaP细胞表达的是突变型AR,双联苄化合物的这种抑制作用将有益于AR持续活化的前列腺癌的治疗。3.首次报道片叶苔素D可诱导前列腺癌细胞DNA损伤并抑制损伤修复,从而导致癌细胞衰老或凋亡。由于DNA损伤修复机制是大多数DNA损伤类化疗药物敏感性的关键因素之一,片叶苔素D不仅能诱导前列腺癌细胞DNA损伤,并能进一步抑制损伤的修复,这些特点将使片叶苔素D成为很有潜力和竞争力的抗肿瘤候选药物。
魏澎涛[5]2016年在《miR-340通过靶向HMGN5抑制前列腺癌细胞的致瘤潜力》文中研究说明前列腺癌是一种世界性的常见癌症,严重威胁男性生活健康。微小RNA(micro RNAs)异常表达广泛参与肿瘤的发生,mi R-340已被报道在不同癌症类型中抑制肿瘤生长。然而,mi R-340是否在前列腺癌中发挥重要作用目前尚未见报道。因此本研究的目的是探索mi R-340在前列腺癌中的表达模式和其功能。然后验证mi R-340是否通过其靶基因HMGN5抑制前列腺癌增殖和侵袭,为前列腺癌提供了新的可能的治疗靶点。本课题包括以下3部分:第一部分:mi R-340在前列腺癌细胞和组织中的表达研究。第二部分:mi R-340对前列腺癌细胞生物学行为的影响。第三部分:mi R-340靶基因及其肿瘤抑制机制初步研究。第一部分:mi R-340在前列腺癌细胞和组织中的表达研究方法:1)收集标本,包括20例前列腺癌癌组织与20例配对的癌旁组织标本。2)使用RPMI 1640培养PC-3、22RV-1、DU-145和LNCa P前列腺癌细胞。RWPE-1正常人前列腺上皮细胞无血清培养基培养。3)采用RT-PCR检测前列腺癌癌组织与癌旁组织标本中mi R-340的表达水平,以及前列腺癌细胞系和正常人前列腺上皮细胞mi R-340的表达水平。结果1)与癌旁组织相比,前列腺癌组织中mi R-340的表达明显下降。2)与正常人前列腺上皮细胞相比,前列腺癌细胞系mi R-340的表达明显下降。结论:mi R-340在前列腺癌组织和癌细胞系表达均显著下调。第二部分:mi R-340对前列腺癌细胞生物学行为的影响方法:1)用细胞转染的方法转染mi R-340 mimics和anti-mi R-340至前列腺癌细胞考察增加或抑制者细胞中mi R-340表达对列腺癌细胞增殖和迁移的影响。2)采用MTT法及克隆形成实验检测mi R-340过表达及抑制mi R-340表达对前列腺癌细胞增殖的影响。3)采用TUNEL方法检测mi R-340过表达及抑制mi R-340表达对前列腺癌细胞凋亡的影响。4)采用western blot检测mi R-340过表达及抑制mi R-340表达对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白caspase-3表达水平的影响。5)应用基于Transwell小室的侵袭实验检测mi R-340过表达及抑制mi R-340表达对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。结果:1)mi R-340过表达可以抑制前列腺癌细胞增殖,抑制其表达可以诱导前列腺癌细胞增殖。2)mi R-340过表达可以抑制前列腺癌细胞克隆形成,抑制其表达可以增加前列腺癌细胞克隆形成。3)mi R-340过表达可以促进前列腺癌细胞凋亡,沉默mi R-340表达可以抑制前列腺癌细胞凋亡。4)mi R-340过表达可以抑制前列腺癌细胞侵袭,沉默mi R-340表达可以促进前列腺癌细胞侵袭。结论:在前列腺癌细胞中mi R-340过表达能够显著抑制前列腺癌细胞增殖、诱导其凋亡、抑制其侵袭能力。第三部分:mi R-340靶基因及其肿瘤抑制机制的初步研究方法:1)构建含有野生型和突变型HGMN5 3’UTR的mi R-340结合元件的荧光素酶表达质粒,与mi R-340 mimics或anti-mi R-340共转染至DU-145细胞考察HMGN5是否是mi R-340的直接靶基因。2)采用荧光定量PCR检测mi R-340 mimics或anti-mi R-340对HMGN5m RNA表达的影响。3)采用Western blot检测mi R-340 mimics或anti-mi R-340对HMGN5蛋白以及Bcl-2,cyclin B1和MMP9蛋白表达的影响。4)共转染HMGN5和mi R-340 mimics考察HMGN5过表达对mi R-340mimics诱导的前列腺癌细胞生物学行为的影响。5)Spearman分析前列腺癌组织中HMGN5 m RNA的表达与mi R-340表达水平相关性。结果:1)mi R-340可直接靶向HMGN5基因。2)mi R-340过表达明显降低前列腺癌细胞HGMN5 m RNA及蛋白的表达。相反,抑制mi R-340能明显增加HGMN5 m RNA及蛋白表达。3)mi R-340过度表达明显抑制前列腺癌细胞Bcl-2、cyclin B1和MMP9蛋白的表达。相反,沉默mi R-340可增加这些蛋白表达。4)mi R-340过表达抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭的作用可以被HMGN5过表达所逆转。5)前列腺癌组织中HMGN5 m RNA的表达与mi R-340得表达水平呈显著负相关。结论:确定HMGN5为前列腺癌细胞mi R-340的直接靶基因,mi R-340过表达通过负调控HMGN5抑制前列腺癌细胞致肿瘤潜力。我们首次报道了mi R-340在前列腺癌中的关键作用以及mi R-340和HMGN5的直接关系。因此,本研究不仅提供了前列腺癌的肿瘤发生的分子基础,而且还提示了前列腺癌的潜在治疗靶点。
邵晨, 晏伟, 秦卫军, 赵忠良, 邵国兴[6]2003年在《肿瘤坏死因子在前列腺癌细胞凋亡中的作用》文中认为目的 :研究参与维甲酸诱导的前列腺癌细胞DU - 1 4 5凋亡过程的相关基因。方法 :应用浓度为 1 0 - 5mol·L- 1 全反式维甲酸作用前列腺癌细胞系DU - 1 4 5细胞 36h和 72h ,诱导DU - 1 4 5细胞凋亡 ,光镜及电子显微镜观察细胞形态及结构的改变 ,并采用基于PCR的改良消减杂交技术克隆与凋亡相关的基因。结果 :在DU - 1 4 5细胞凋亡过程中 ,有大量TNF基因及其家族成员的参与。结论 :TNF家族基因在由全反式维甲酸诱导的前列腺癌细胞系DU - 1 4 5细胞凋亡过程中 ,起着相当重要的作用
焦淑凡[7]2012年在《基因沉默HMGA1调控前列腺癌细胞生长与凋亡研究》文中研究表明本研究选择肿瘤细胞高表达的高迁移率族蛋白A1(The high mobility groupA1，HMGA1)分子作为干扰靶点，将pU6mRFPsiRNA-HMGA1重组质粒转染至人前列腺癌细胞PC-3M，检测基因沉默HMGA1对前列腺癌细胞PC-3M生长与凋亡的影响，为进一步研究HMGA1在前列腺癌细胞中的生物学功能提供实验依据。采用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测PC-3M细胞HMGA1基因mRNA与蛋白表达；采用脂质体转染法将pU6mRFPsiRNA-HMGA1重组质粒瞬时转染至前列腺癌细胞PC-3M，倒置荧光显微镜观察转染效率；RT-PCR、WesternBlot及免疫荧光细胞化学技术检测pU6mRFPsiRNA-HMGA1基因转染后PC-3M细胞HMGA1mRNA和蛋白水平的表达；MTT法与平板克隆实验检测基因转染后PC-3M细胞的增殖活性与克隆形成能力；流式细胞术（FACS）检测HMGA1基因沉默后细胞凋亡变化；RT-PCR检测肿瘤细胞凋亡相关因子Bax、Bcl-2、p53、DR3与免疫抑制相关因子TGF-β、IL-10、VEGF和FasL mRNA表达水平变化。结果表明：PC-3M细胞中HMGA1mRNA及蛋白高表达；将pU6mRFPsiRNA-HMGA1重组质粒瞬时转染至PC-3M细胞，转染效率大约在50%-60%；基因沉默组（pU6mRFPsiRNA-HMGA1RNAi）与细胞对照组及空载体组比较，HMGA1在mRNA及蛋白水平的表达均降低；细胞增殖活性与细胞克隆形成能力降低（p<0.05）；流式细胞术结果显示pU6mRFPsiRNA-HMGA1RNAi组细胞凋亡百分率(61.9%）显著高于PC-3M组(4.5%)和pU6mRFP组（4.49%）；基因沉默组可抑制凋亡相关因子Bcl-2与DR3mRNA表达，促进p53、Bax基因mRNA的表达；基因沉默组可抑制免疫抑制相关因子VEGF、FasL、TGF-β、IL-10mRNA的表达。研究结果提示：沉默HMGA1基因可以抑制前列腺癌细胞PC-3M的增殖活性和克隆形成能力；沉默HMGA1基因可促进前列腺癌细胞PC-3M凋亡；沉默HMGA1基因可以抑制前列腺癌细胞PC-3M抑凋亡相关因子的表达，增强促凋亡因子的表达；沉默HMGA1基因可以抑制免疫抑制相关因子mRNA表达。此研究为HMGA1作为肿瘤基因治疗的分子靶点提供了实验基础与理论依据。
金中[8]2016年在《盐酸石蒜碱对前列腺癌的作用及机制研究》文中指出研究背景前列腺癌(Prostate Cancer, Pca)是发生于前列腺上皮的恶性肿瘤,是老年男性常见的恶性肿瘤。在世界范围内,前列腺癌发病率位于男性所有恶性肿瘤的第二位,死亡率居第六位,严重威胁人类生命健康。既往我国前列腺癌发病率相对较低,但随着人口老龄化的加剧,生活环境的污染,饮食生活习惯的改变以及前列腺特异抗原筛查的逐步推广,近年来其发病率逐渐增高。根据不同的病情,前列腺癌的治疗方式包括主动监测,根治性手术治疗,外放射治疗(External Beam Radiotherapy, EBRT),近距离照射治疗,试验性前列腺癌局部治疗及内分泌治疗等。目前内分泌治疗是治疗早期前列腺癌的标准手段之一,然而在临床中发现,大多数患者经内分泌治疗一段时间后便进而发展为去势抵抗性前列腺癌(Castrate-resistant Prostate Cancer, CRPC)表现出对雄激素阻断不敏感,肿瘤恶性程度高。对于去势抵抗性前列腺癌可采用化疗。目前以Docetaxel(多西他赛)为基础的化疗已成为此类患者标准的一线化疗方案,但大部分的化疗药物都表现出毒副作用较大,选择性差或多药耐药等缺陷。近来,醋酸阿比特龙等新兴药物被证明对晚期前列腺癌有一定疗效,但是这些药物有效率不高,且高昂的花费在一定程度限制了其在我国的临床应用。Sipuleucel-T (Provenge)是世界上第一种有效的治疗去势抵抗性前列腺癌的肿瘤疫苗,但同样面临上述治疗费用性价比的问题,因此有必要继续研发一些安全、有效且花费较低的药物用于治疗前列腺癌。目前,在开发抗肿瘤新药方面,从天然植物中提取有效抗癌成分己经成为一个重要研究方向。在抗肿瘤天然药物的开发中,生物碱属于目前研究较多的一个分支。生物碱是一类含氮的碱性有机化合物,有类似碱的化学性质,主要存在于自然界的动植物中。大多数生物碱有复杂的环状结构,环内多包含有氮元素,以此为基础的结构表现出丰富的生理药理活性。目前已探明的生物碱约有2000种左右,在生物医学领域,把生物碱按照化学结构分为七种类型,依次为吡啶类和哌啶类,有机胺类,吲哚类,莨菪烷类,甾体类,异喹啉类,萜类。石蒜碱属于异喹啉类生物碱,为吡咯并菲啶的衍生物。石蒜碱是从石蒜科植物中分离得到的第一个生物碱,也是该科植物中最普遍的生物碱。石蒜碱具有多种生物药理活性,现有的研究证明,石蒜碱具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗疟疾、抑制乙酰胆碱酯酶活性、抑制维生素生物合成以及保护心血管等作用。近年来,石蒜碱丰富的药理、生理活性引起了生物医药研究领域的广泛关注,有关石蒜碱及其衍生物的抗肿瘤作用及机制研究方面的报道呈上升趋势。到目前为止,相当一部分研究已证明石蒜碱对肿瘤细胞的生长抑制作用显著高于其对正常细胞的生长抑制作用。石蒜碱对肿瘤的作用表现出广谱性,现有研究揭示了石蒜碱及其衍生物对白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、食道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等肿瘤显示了不同程度的抑制作用。已有的研究揭示了石蒜碱抗肿瘤作用的复杂性,石蒜碱对前列腺癌细胞的杀伤作用是否存在其他机制尚未明确。因此有必要深入研究石蒜碱对前列腺癌细胞的影响,并探索可能存在的新机制。NF-kB是一种控制DNA转录、细胞因子产生和细胞存活的蛋白质复合物。NF-kB几乎存在于所有类型的动物细胞中并参与细胞对诸多刺激的响应,这些刺激包括应激、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化LDL及细菌或病毒抗原。在哺乳动物中,NF-kB家族由五个相关的转录因子：P50/NF-kB1、P52/NF-kB2、 REL/c-Re1、Rel-A/p65和Rel-B组成。这些转录因子均具有一个由300个氨基酸组成的N-末端DNA二聚域,称为Rel同源结构域(RHD)。通过RHD,NF-kB家庭成员可以形成同源和异源二聚体。RelA、c-Rel和RelB基因含有羧基端的转录激活域(TADS),这使他们能激活靶基因的表达。与此相反,p50和p52不含C-末端TADS;因此,p50和p52二聚体抑制转录,除非他们与含有TADS的蛋白质如RelA、c-Re1、RelB或BCL-3(一个转录相关共激活因子)结合。NF-kB的转录活性受到存在于细胞质中的IκB蛋白的抑制。目前有7个确定的IκB家庭成员,包括IkBα, IkBβ, Bcl-3, IkBε, IkBγ,以及前体蛋白P100和P105。当NF-kB与IκB结合时,因NF-kB不能入核而不具备转录活性。当IκB被磷酸化之后,NF-kB便可以解除IκB的抑制作用,进入细胞核,调节相关靶基因的转录。大量的细胞因子,致癌剂,和肿瘤微环境都能通过相应的信号通路活化NF-kB,从而调控下游蛋白的表达,参与肿瘤的发生,进展,侵袭,转移等。研究证实NF-kB在多种恶性肿瘤中处于异常激活状态,而抑制NF-kB的活性可抑制多种肿瘤的进展,提示NF-kB在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。NF-kB信号通路和前列腺癌关系密切,多项研究表明,NF-kB在一系列前列腺癌细胞系和前列腺癌动物模型中持续激活,在缺乏雄激素受体表达的前列腺癌细胞系PC-3,DU145中发现NF-kB高度活化。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是一类高度保守的内源性抗细胞凋亡因子家族,主要通过抑制Caspase活性和参与调解NF-kB的作用而抑制细胞凋亡。Survivin是IAP家族中的一个成员,具有抗细胞凋亡、调节细胞周期和参与血管生成的作用。Survivin在分化成熟的正常组织中(胸腺和生殖腺除外)几乎不表达,而在大多数常见的恶性肿瘤组织高表达。美国国立癌症研究中心对60种肿瘤细胞系进行检测,结果显示Survivin在60种肿瘤细胞系中普遍高表达,包括肾癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等。由以上结论可见Survivin和泌尿系肿瘤关系密切,研究发现Survivin在不同的前列腺癌细胞株均有表达,表明Survivin在前列腺肿瘤的发生、发展中扮演一个重要的角色。研究还发现Survivin不仅在前列腺癌中高表达,而且与前列腺癌的临床分期、病理分级相关。综上所述,前列腺癌发病率呈逐年上升趋势,NF-kB信号通路是前列腺癌中的重要信号通路,.石蒜碱表现出良好的抗肿瘤活性,目前尚未有研究探讨盐酸石蒜碱(Lycorine Hydrochloride, LH)通过NF-kB信号通路及其下游Survivin对前列腺癌细胞的影响,所以我们认为有必要明确LH在前列腺癌细胞中的作用。本研究首先探讨了LH对前列腺癌细胞中NF-kB信号通路的影响,随后进一步探讨了LH对NF-kB信号通路下游靶标Survivin的作用,最后通过细胞增殖、周期、凋亡、肿瘤克隆形成、肿瘤细胞迁移、裸鼠皮下成瘤等实验分析LH对前列腺癌细胞表型的影响。本论文可分为以下三章。第一章盐酸石蒜碱抑制前列腺癌细胞NF-kB信号通路目的：盐酸石蒜碱在多种肿瘤中发挥抑癌的作用,但目前尚没有研究探索盐酸石蒜碱对前列腺癌细胞NF-kB信号通路的作用。本研究拟探索盐酸石蒜碱对前列腺癌细胞株PC-3和22Rv1细胞内NF-kB信号通路的影响。方法：分别用LH、BAY及LH+BAY作用于PC-3和22Rv1细胞48小时,用40ng/ml TNF-a刺激PC-3和22Rv1细胞株内NF-kB信号通路,提取作用0min和15min后细胞总蛋白,用Western Blot检测PC-3和22Rv1细胞内NF-kB信号通路相关蛋白P-KKα/β、IKKα/β、P-P65、P65、P-IkBα、IkBα的表达情况。结果：与DMSO组相比,LH、BAY及LH+BAY作用后,PC-3和22Rv1细胞中P-IKKα/β、P-P65、P-IκBa蛋白表达量明显下降。结论：盐酸石蒜碱可以有效抑制前列腺癌PC-3和22Rv1细胞株内NF-kB信号通路。第二章盐酸石蒜碱抑制前列腺癌细胞中Survivin表达目的：探讨盐酸石蒜碱作用后对前列腺癌细胞内NF-kB信号通路下游靶标survivin的影响。方法：用2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μMBAY、2μg/ml LH+lOnM YM-155、5μM BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nMYM-155作用于PC-3细胞48h后,分别提取细胞总RNA和总蛋白,分别采用qPCR, Western Blot和免疫荧光检测LH作用后对PC-3细胞内survivin mRNA及蛋白表达水平的影响。结果：与DMSO对照组相比,2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+10nM YM-155、5μM BAY+10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nM YM-155处理后,PC-3细胞内survivin的表达在mRNA水平和蛋白水平均明显下降(P<0.05)。免疫荧光结果显示：DMSO作用后,survivin在前列腺癌PC-3细胞中呈强荧光着色；而与DMSO组相比较,2μg/ml LH、5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+lOnM YM-155、5μM BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+lOnM YM-155处理后,PC-3细胞内荧光着色逐渐减弱。结论：盐酸石蒜碱可以有效抑制前列腺癌PC-3细胞株内NF-kB信号通路下游靶标survivin的活性,且这种抑制作用在和BAY、YM-155联和使用时具有协同效应。第三章盐酸石蒜碱对前列腺癌细胞表型的影响目的：探讨盐酸石蒜碱作用后对前列腺癌细胞株PC-3和22Rv1细胞生物学特性的影响。方法：以前列腺细胞株PC-3、22Rv1细胞为研究对象,实验处理组设为：①DMSO处理组；②LH处理组；③BAY处理组；④YM-155处理组；⑤LH+BAY联合处理组(L+B)；⑥LH+YM-155联合处理组(L+Y)；⑦BAY+YM-155联合处理组(B+Y)；⑧LH+BAY+YM-155联合处理组(L+B+Y)。分别作用于PC-3和22Rv1细胞24-48小时后,采用MTS研究LH对前列腺癌细胞体外增殖的影响；采用流式细胞计数研究LH对前列腺细胞凋亡和周期的影响；采用平板克隆形成实验研究LH对前列腺癌细胞体外克隆形成能力的影响；采用Transwell研究LH对前列腺癌细胞体外迁移能力的影响；同时建立裸鼠移植瘤模型,考察LH体内抗前列腺癌的作用。结果：1、LH在干预后2、3、4、5d后明显抑制PC-3和22Rv1细胞的增殖(P<0.05),其对PC-3和22Rv1细胞的增殖抑制程度与BAY和YM-155的抑制程度相当(P>0.05)。同时,LH与BAY或YM-155联用时,LH可加强BAY和YM-155对PC-3和22Rv1细胞增殖的抑制作用。2、LH对前列腺癌细胞凋亡的影响：LH可显著促进PC-3细胞及22Rv1细胞的凋亡(p<0.05)。其诱导PC-3和22Rv1细胞凋亡程度与BAY和YM-155相当(P>0.05)。但是LH与BAY和YM-155联用时可加强BAY和YM-155对PC-3和22Rv1细胞凋亡的促进作用。3、LH对前列腺癌细胞周期的影响：LH可显著降低PC-3和22Rv1 S期细胞的比例(p<0.05)。其效果与BAY和YM-155类似(P>0.05)。但LH与BAY和YM-155联用时,LH可显著加强BAY和YM-155对22Rv1 S期细胞比例的降低作用(p<0.05)。4、LH对前列腺癌细胞体外克隆形成能力的影响：与DMSO处理组相比,LH处理组的细胞克隆形成能力显著降低(p<0.05),而LH和BAY、YM-155处理组组间无差异(p>0.05)。同时,与单药处理组相比,两药联合或三药联合处理组明显降低PC-3和22Rv1细胞的克隆形成能力,表明LH可抑制前列腺癌细胞的体外克隆形成能力。5、LH对前列腺癌细胞体外迁移能力的影响：与对照组比较,2μg/ml LH、 5μM BAY、10nM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY、2μg/ml LH+10nM YM-155、 BAY+lOnM YM-155、2μg/ml LH+5μM BAY+10nM YM-155处理后PC-3细胞及22Rv1细胞穿过小室的数目均明显减少(p<0.05),同时与单药处理组相比,两药联合或三药联合处理组PC-3细胞穿过小室的数目均明显减少(p<0.05)。而LH、BAY和YM-155单药处理组组间无差异(P>0.05),L+B、L+Y和B+Y处理组组间无差异(p>0.05)。表明LH可抑制前列腺癌细胞的迁移能力,同时LH与BAY和YM-155联用时可获得对前列腺癌细胞迁移能力更强的抑制作用。6、LH对前列腺癌细胞皮下成瘤能力的影响：与PBS对照组相比,LH和YM-155均能显著抑制移植瘤的生长速度和肿瘤体积(p<0.05),而LH注射组和YM-155注射组组间无差异(p>0.05)。同时,与PBS对照组相比,LH和YM-155亦显著抑制了肿瘤的重量(p<0.05)。结论：LH可以通过抑制NF-κB及其下游靶标Survivin的作用方式,抑制前列腺癌细胞增殖,促进凋亡,阻滞细胞周期,降低细胞迁移能力,降低体内成瘤能力,并且这种抑制作用在LH和BAY、YM-155联和使用时具有协同效应。
张东旭[9]2013年在《microRNA-199a慢病毒载体的构建及其对激素非依赖前列腺癌细胞肿瘤生物学特性的作用研究》文中进行了进一步梳理一、研究背景及目的前列腺癌（prostate cancer）是中、老年男性常见的泌尿系恶性肿瘤。其发病率和病死率分别居全球男性癌症发病率的第二位和第六位。在美国，前列腺癌的发病率位居男性恶性肿瘤之首，居40岁以上男性癌症死因次席。目前中国等亚洲国家前列腺癌发病率虽远低于欧美等发达地区，但随着中国社会老龄化程度的加剧、肿瘤检测手段的提高及饮食、生活习惯、居住环境的改变，发病率呈明显增长趋势。因此，前列腺癌越来越受到人们的关注。其发生、发展、恶化机制和治疗手段研究已经成为泌尿外科的热点研究之一。前列腺癌（PCa）早期无相关临床症状，虽然目前血清前列腺特异性抗原（PSA）等筛查手段的应用，其检出率明显提高，但仍存在相当比例患者在确诊前列腺癌时处于疾病进展期:高血清PSA值，高Gleason评分、且发生局部或远处骨转移，从而失去根治性前列腺切除的机会而选择内分泌治疗。去势治疗对雄激素依赖型前列腺癌疗效确切，包括手术和药物去势两种方法，均可促使肿瘤细胞逐渐凋亡并降低患者PSA水平，缓解疼痛等症状，有效延缓肿瘤的恶化及转移。但内分泌治疗即最大雄激素阻断（MAB）的有效时间较短，其中位有效时间仅为14-30月，后期几乎所有患者都将发展为雄激素非依赖前列腺癌（AIPC）。对泌尿外科医师而言，发展为雄激素非依赖性前列腺癌（AIPC）的患者对内分泌治疗及化疗均不敏感且疾病恶化迅速，是无法治愈的阶段，患者中位生存时间仅18～20月。研究表明前列腺癌进展与雄激素受体及相关信号通路的改变密切相关，但激素依赖性前列腺癌如何转变为激素非依赖性前列腺癌的机制尚不清楚。因此，研究前列腺癌发生、发展、恶化、转移中雄激素受体及信号通路的作用以及受体相关的调控机制，极大有助于了解前列腺癌从激素依赖转变激素抵抗的分子机制。Micro-RNA是内源性非编码RNA分子，由长约18～25个单链核苷酸组成。研究表明，众多Micro-RNA不仅在多肽链的合成中发挥作用，而且能有效调节转录基因的表达，对细胞增殖、分化、凋亡和代谢等过程起着重要调节作用，其对肿瘤细胞生物学特性的调控是近年来医学、生物学等领域研究的热门，提示生物体内存在着由RNA介导的遗传信息表达调控网络。一个Micro-RNA可以调控多个靶基因，而一个靶基因又可同时被多个Micro-RNA所调控，不同类型的肿瘤以及肿瘤发生、进展、恶化中的不同阶段，都有自己独特的Micro-RNA异常表达谱.一般认为在动物细胞中，Micro-RNA主要通过不完全互补的方式与编码蛋白mRNA的碱基配对结合，引起目标靶mRNA的失活、降解或翻译受阻，从而在转录后水平进行对基因的调控。研究认为，microRNA-199a（缩写为miR-199a）在诸多人类恶性肿瘤中起抑制肿瘤细胞生长的调控作用，如乳腺癌、大肠癌、骨肉瘤等等，但是有关miR-199a对前列腺癌细胞的作用及相关调控机制至今未见相关文献报道。鉴于慢病毒载体系统能高效、稳定地将目的基因导入哺乳动物的原代或肿瘤细胞系且可以在体内长期稳定的表达，受免疫、内环境等影响小，安全性较高。我们拟通过基因芯片检测及临床肿瘤标本及癌旁组织验证miR-199a在前列腺癌组织及周围正常前列腺组织的差异表达，并通过构建miR-199a慢病毒过表达载体研究miR-199a表达水平的变化对前列腺癌激素非依赖细胞肿瘤生物学特性的影响，为后续针对miR-199a进行前列腺癌的分子靶向治疗奠定基础。二、研究方法、结果（一）microRNA-199a慢病毒过表达载体的构建及其效率验证慢病毒载体系统能稳定、高效地将目的基因导入哺乳动物的原代或肿瘤细胞系，且可以在体内长期稳定的表达，受免疫、内环境等影响小，安全性较高等优点。因此我们选择慢病毒载体体系构建pCDH-miR-199a载体。首先根据文献报道及Genebank查询的相关基因序列，合成特异性引物（带酶切位点），real-time PCR技术对目的基因片段进行扩增，RT-PCR产物双酶切及载体酶切后连接到pCDH体系中，经过阳性质粒转染293T细胞、慢病毒的获得、浓缩及滴度测定，通过荧光显微镜成像得出我们构建的pCDH-miR-199a慢病毒获得较高的浓度滴度。慢病毒感染前列腺癌激素非依赖DU-145细胞后，经PCR检测，结果证实构建的pCDH-miR-199a载体能显著上调miRNA-199a在DU-145细胞中表达水平。上述实验结果为后续进行miRNA-199a表达水平的变化对DU-145细胞肿瘤生物学特性的影响奠定了基础。（二）microRNA-199a在临床前列腺癌（PCa）组织中低表达（16对肿瘤与癌旁组织）首先利用基因芯片技术发现miR-199a在临床前列腺癌标本组织与癌旁正常的前列腺组织之间存在有统计学意义的表达差异。取经手术切除的前列腺癌和癌旁正常组织各16例，肿瘤组织的定位根据术前磁共振（MRI）等影像学检查、术前穿刺病理报告肿瘤阳性位点、前列腺切除组织的硬度触摸等手段来大体明确。术后病理切片染色明确所取标本组织包括前列腺癌和周围正常前列腺组织。所取的标本分别置入液氮中冻存和中性福尔马林溶液中固定。上述冻存及固定标本经RNA抽提、Poly(A)加尾和反转录反应、RT-PCR反应，结果发现16对术后病理诊断明确为前列腺癌与周围正常癌旁前列腺组织的miR-199a表达水平存在显著差异，与正常癌旁组织比较，肿瘤组织miR-199a的表达水平显著下降（P=0.07）。通过上述结果表明，miR-199a极有可能参与调控了前列腺癌的发生、发展及向激素非依赖转变等病理过程。（三）miR-199a高表达对前列腺癌细胞DU-145增殖、迁移、克隆形成及细胞周期与凋亡的影响。第三部分实验中，我们通过慢病毒载体介导miR-199a高表达，以研究miR-199a对前列腺癌激素非依赖细胞生物学特性方面的影响。我们选择DU-145细胞株为研究对象，通过慢病毒载体有效感染前列腺癌DU-145细胞，病毒感染后第五天在倒置荧光镜下观察得出慢病毒感染DU-145细胞效率高。通过细胞增殖实验检测DU-145细胞生长状况，与空白和阴性对照组相比，miRNA-199a高表达后的DU-145细胞的增殖能力明显受到抑制，酶标仪595nm检测的OD值降低。我们设计了Transwell实验研究miRNA-199a高表达后对雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU-145迁移能力的影响，结果发现，高表达miRNA-199a明显抑制前列腺癌DU-145细胞的迁移能力。肿瘤的克隆形成能力方面，我们通过DU-145细胞在平板上的克隆形成能力来反应并衡量肿瘤细胞的成瘤能力。我们发现，通过慢病毒载体介导miRNA-199a高表达后，DU-145细胞的克隆形成能力显著降低，表现为与con、Lv-shcon组相比，Lv-shmiRNA-199a组克隆的数目少，克隆的体积小，且克隆分散，成团能力差。在克隆形成实验中，我们发现高表达miRNA-199a明显抑制前列下癌DU-145细胞的克隆形成能力，具体表现为克隆体积小、分散，且成团能力差。为进一步探讨miRNA-199a高表达后对前列腺癌DU-145细胞周期产生的影响，我们利用PI染色流式细胞技术来检测细胞周期分布和细胞凋亡比例，根据细胞周期各阶段所含DNA的不同，来测定细胞的周期分布，结果发现表明miRNA-199a高表达后能够导致DU-145细胞出现G1/S期阻滞。此外，miRNA-199a高表达后能够促进DU-145细胞出现凋亡。三、结论综合以上三部分实验结果，我们认为：从芯片检测及临床组织标本验证miRNA-199a在前列腺癌中显著低表达，慢病毒载体能够高效、稳定的上调目标靶分子miRNA-199a在前列腺癌细胞中的水平，miRNA-199a可被作为肿瘤抑制因子抑制前列腺癌细胞的相关肿瘤生物学功能及特性，鉴于前列腺癌从激素依赖转向非依赖的具体机制目前尚未明确，miRNA-199a有可能被设计为抑制并治疗激素非依赖前列腺癌的靶向分子靶标。
周许敏[10]2016年在《HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中的调控作用及其相关机制的研究》文中认为背景：前列腺癌作为威胁男性健康的常见肿瘤,其发病率和死亡率呈现逐年上升的趋势。目前,据有关报道,前列腺癌的发病率居全球男性所有恶性肿瘤发病率的第二位,死亡率居第五位。我国前列腺癌的发病率与死亡率虽比其他发达国家低很多,但近年来随着社会的进步、人口的老龄化、人们饮食习惯的改变以及医疗条件的改善呈现明显上升的趋势,已严重威胁我国男性的身体健康。由于我国幅员辽阔,有很多地方的就医环境不太理想,目前临床上发现的晚期前列腺癌较多,尽管随着我们国内医生对前列腺癌认识的不断提高,各种检查手段,如PSA、B超检查,以及不断地宣传,公众对健康知识认知程度的提高,现在越来越多比较早期的前列腺癌患者被发现,但效果依旧不尽人意,在临床治疗方面也存在效果不佳的情况。目前前列腺癌的发病机制也不甚清楚。因此,对前列腺癌的发病机制进行深入的研究,寻找特异性和敏感性都较好的前列腺癌分子标志物以及有效的治疗靶点,对我国前列腺的临床诊断和治疗都具有非常重要的科学研究价值。我国学者韩赵东等在最近研究中应用基因芯片以及双向电泳和质谱分析的方法鉴定出了前列腺癌中的2566种肿瘤蛋白,进一步通过生物信息学分析发现了60个差异性表达的肿瘤蛋白,其中有37个表达上调,而23个表达下调。而其中在前列腺癌中表达存在明显差异性的有14种基因及其蛋白产物(ACLY, CAPG,GSTM3, GSTP1, HNRNPL, IMPDH2, KRT15, MCCC2, MSN, MYL9, PYGB, SERPINB5, TRAP1 and VCL). HnRNP L全称是核内不均一核糖核蛋白L,其系hnRNP家族的一员。人HnRNP L定位于19q13.2,全长1759bp,含有17个外显子。有研究报道,hnRNP家族中的各成员在DNA损伤修复、转录、hnRNA剪接mRNA输送、降解等生物过程中发挥着重要作用。核内不均一核糖核蛋白L(HnRNPL)最早是由Pinol-Roma S等在早期转录片段中意外发现的核糖核蛋白,这种蛋白富含胱氨酸及脯氨酸,目前已知其与肺癌、肝癌、结直肠癌等肿瘤的发生发展关系密切,而在本课题组前期研究中也发现其能够影响生精细胞的增值和凋亡。已有研究报道hnRNP家族中的HnRNP K与前列腺癌有着紧密的关系,可能参与调控前列腺癌的增殖和凋亡,但HnRNP L与前列腺癌的关系罕见报道。本研究首先探讨HnRNP L与前列腺癌患者的各项临床指标之间的关系,进一步在体内外研究HnRNP L对前列腺癌增值、凋亡的影响并揭示其可能的分子机制,最终阐明HnRNP L在前列腺发生发展中可能扮演的角色,并为前列腺癌的临床诊断和治疗提供一种新的肿瘤分子标志物和治疗靶点。目的：1探讨HnRNP L与前列腺癌患者的各项临床指标之间的关系；2通过体内外的功能实验阐明HnRNP L与前列腺癌细胞增殖、凋亡的关系；3通过一系列分子生物学实验最终揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能发挥的分子调控机制。方法：1 HnRNP L在前列腺癌组织中的表达情况以及与各项临床病理参数的关系于西安艾丽娜生物有限公司购得一包含81例前列腺增生症样本和99例前列腺癌样本的组织芯片,通过免疫组化S-P法检测各个样本中HnRNP L的表达情况,并结合各样本的各项临床病理参数,用相关统计学方法进行关联性分析；于南方医院泌尿外科收集得10对前列腺癌和癌旁配对组织,进行组织研磨提取蛋白后进行WB检测10对配对组织中HnRNP L的表达情况。2分别敲低和过表达HnRNP L在各前列腺细胞株中的表达,研究其对前列腺癌增殖、凋亡水平的影响首先,采用Q-PCR和WB检测HnRNP L在三株前列腺癌细胞株(PC3、DU145、Lncap)中的表达情况,筛选HnRNP L表达较高和较低细胞株,对表达较高细胞株(DU145)进行慢病毒敲低处理,对表达较低细胞株(Lncap)进行慢病毒过表达处理,而对于中间表达细胞株(PC3)既进行敲低处理也进行过表达处理；进一步通过cck-8实验、Transwell侵袭实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验以及流式细胞术检测HnRNP L敲低或过表达前后,前列腺癌细胞株增殖和凋亡情况的改变。3 HnRNP L调控前列腺癌细胞增殖和凋亡的可能的分子机制通过免疫荧光、CO-IP、RIP以及pull-down等实验方法检测HnRNP L与增殖、凋亡通路中可能相互作用的蛋白或基因,进一步通过WB检测HnRNP L敲低和过表达前后增殖以及凋亡通路中各蛋白水平的改变,最终揭示HnRNP L在前列腺癌增殖、凋亡中可能的调控机制。结果：1 HnRNP L在前列腺癌组织中的表达及其表达与临床病理参数的关系1.1 HnRNP L与前列腺癌各项临床病理参数的关系免疫组化检测结果表明：在81例前列腺增生症组织中HnRNP L的阳性表达率是29.63%(n=24),而在99例前列腺癌组织中HnRNP L的阳性表达率是84.8%(n=84),二者差异具有统计学意义(p<0.05)；同时,结果也表明：在前列腺癌中,HnRNP L表达情况与临床分期、病理分级呈正相关(p<0.05)。随后,Western blot检测结果显示HnRNP L在前列腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织。2分别敲低和过表达HnRNP L在各前列腺细胞株中的表达,研究其表达对前列腺癌细胞增殖及凋亡的影响2.1利用慢病毒技术构建稳定转染细胞株模型Q-PCR和Western blot结果显示DU145细胞株中HnRNP L的表达水平最高,Lncap细胞株中HnRNP L的表达水平最低,而PC3细胞株中HnRNP L的表达水平居中,因此在后续实验中对DU145细胞株仅做HnRNP L稳定敲低的处理,对Lncap细胞株仅做HnRNP L稳定过表达的处理,而对PC3细胞株既进行敲低HnRNP L的处理,也进行过表达HnRNP L的处理；转染48h后,经WB检测各株细胞敲低和过表达的效率,选择构建成功的稳转细胞株模型用于后续的功能实验。2.2敲低HnRNP L的表达对前列腺癌细胞株增殖能力的影响采用CCK-8细胞活性试验检测HnRNP L敲低后对DU145细胞株和PC3细胞株增殖能力的影响,并绘制生长曲线图。统计学分析结果显示：与对照组相比,DU145和PC3细胞株中敲低组细胞的增殖能力降低,差异具有显著的统计学意义(p<0.05),不同的时间点对DU145和PC3细胞株的增殖能力影响显著(p<0.05),各时间点组与处理组间交互效应显著(p<0.05)；平板克隆形成试验结果显示：DU145细胞株中敲低组和对照组的克隆形成率分别是42.3%和75.1%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的克隆形成率分别是31.8%和67.5%,两两比较,差异显著,具有统计学意义(p<0.05)；流式细胞术对细胞周期的检测结果显示：DU145细胞株中敲低组和对照组的G1期细胞数百分比分别是53.62%和33.14%,S期细胞数百分比分别是30.37%和55.01%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的G1期细胞数百分比分别是81.09%和40.13%,S期细胞数百分比分别是14.03%和28.37%,统计学分析表明DU145和PC3细胞株中敲低组和对照组的细胞数百分比具有统计学差异,提示敲低HnRNP L的表达后,前列腺癌细胞株的增殖能力受到抑制,可能是因为其细胞周期阻滞在G1期而导致。2.3过表达HnRNP L的表达对前列腺癌细胞株增殖能力的影响同理,CCK-8结果显示：Lncap和PC3细胞株中过表达组较对照组的细胞增殖能力明显增强,差异具有显著的统计学意义(p<0.05)；平板克隆形成试验结果显示：Lncap细胞株中过表达组和对照组的克隆形成率分别是33.6%和25.9%,而PC3细胞株中过表达组和对照组的克隆形成率分别是79.5%和51.6%,统计学分析表明Lncap和PC3细胞株中过表达组细胞的克隆形成能力明显高于对照组,差异具有统计学意义(p<0.05)；流式细胞术细胞周期检测结果显示：Lncap细胞株中过表达组和对照组的G1期细胞数百分比分别是45.60%和48.53%,S期细胞数百分比分别是36.65%和32.87%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的G1期细胞数百分比分别是38.94%和36.48%,S期细胞数百分比分别是42.86%和27.55%,统计学分析表明过表达组和对照组差异明显,具有统计学意义,提示HnRNP L过表达具有促进前列腺癌细胞增殖的能力,可能是因为其加快了细胞周期的进程。2.4敲低及过表达HnRNP L对肿瘤生长能力的影响裸鼠皮下成瘤实验结果显示：PC3细胞株敲低组、对照组和过表达组肿瘤的大小差异明显,具有统计学意义(p<0.05),瘤体制成蜡块并切片后经免疫组化检测发现PC3细胞株敲低组、对照组和过表达组的肿瘤组织中增殖指标Ki-67的阳性表达率分别为10.1%、42.6%和69.2%,差异具有统计学意义(p<0.05),提示：与对照组相比,敲低HnRNP L能抑制肿瘤的生长,而HnRNP L过表达能促进肿瘤的生长。2.5敲低和过表达HnRNP L对前列腺癌细胞凋亡情况的影响流式细胞术对细胞凋亡的检测结果显示：敲低HnRNP L后,DU145敲低组和对照组细胞的凋亡率分别是14.7%和7.7%,而PC3敲低组和对照组细胞的凋亡率分别是44.9%和15.5%,统计学分析表明敲低组和对照组细胞的凋亡率具有统计学差异,提示敲低HnRNP L表达具有促进前列腺癌细胞凋亡的能力。过表达HnRNP L后,Lncap细胞株中过表达组和对照组的凋亡率分别是13.2%和13.9%,而PC3细胞株中敲低组和对照组的凋亡率分别是9.0%和16.9%,统计学分析表明过表达组和对照组的凋亡率具有统计学差异,提示HnRNP L过表达抑制了前列腺癌细胞株的凋亡能力。3 HnRNP L调控前列腺癌细胞增殖及凋亡的分子机制免疫荧光结果提示HnRNP L和BCL-2在PC3细胞核内具有共定位现象,而CO-IP和pull-down结果更进一步证明HnRNP L与BCL-2之间存在相互作用的关系,而RIP结果显示HnRNP L能与p53的mRNA相互作用进一步影响p53蛋白的表达,以上结果提示HnRNP L是分别通过调控p53和BCL-2的表达情况来影响前列腺癌细胞的增殖和凋亡能力。结论：研究结果表明HnRNP L在前列腺癌中是高表达的,并且其与前列腺癌的临床分期和病理分级都密切相关。HnRNP L在前列腺癌中可能发挥着促进肿瘤细胞增殖和抗凋亡的作用,其作用机制可能与p53/p21/cyclin D1信号通路和bcl-2/caspase 9/caspase 3信号通路有关。总的来说,HnRNP L有望成为前列腺癌临床诊断和治疗的一种新的分子标志物和治疗靶点。
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