广西医科大学附属肿瘤医院 530021
真核细胞染色体的DNA复制是一个复杂的，但高度管制的过程。通过多种蛋白因子和酶包括DNA聚合酶的合作，每个染色体在一个细胞周期中完成一次复制。DNA聚合酶δ是哺乳动物核DNA合成的主要酶类之一 。POLD1基因是DNA聚合酶δ的催化亚基p125的编码基因，DNA聚合酶δ的聚合酶及外切酶活性又集中位于p125亚基，因此POLD1基因在细胞周期的过程中的调控研究十分吸引国内外学者的关注。本文就POLD1基因的理化特性及生物学功能、表达水平改变、基因序列中的碱基突变、与其他调控因子的相互作用等方面对癌症的影响，从国内外的对POLD1基因研究中进行简要的阐述。
1、POLD1基因的理化特性及生物学功能
根据已有的研究可知，DNA聚合酶δ具有3'-5'核酸外切酶活性 。纯化的DNA聚合酶δ由一个125-kDa的催化亚基和一个功能尚未被定义的48-kDa的小亚基组成 。自1991年人为的从小牛胸腺DNA聚合酶δ中分离出其催化亚基125-kDa的POLD1基因编码序列后 ，人类相继从啤酒酵母、裂殖酵母、疟原虫和小鼠细胞中分离出该序列。人们发现POLD1基因编码序列中有增殖细胞核抗原（PCNA)结合位点 ，对DNA聚合酶δ活性具有由低到高的转换作用 。
经Northern Blot和cDNA克隆等技术研究，发现DNA聚合酶δ催化亚基的编码基因POLD1基因位于第19号染色体19ql3.3- 13.4上 。人类POLD1基因含有27个外显子和26个内含子。该基因cDNA全长3443bp ,其相对应的基因DNA序列长约32kb。POLD1基因片段分子量为125kD,可编码1 107个氨基酸残基。在序列的C—末端含有两个由半胱甘酸组成的锌指结构域，这两个结构域有高度保守性。序列的N—末端一个结合位点，能与一个36-kDa的增殖细胞核抗原（PCNA)结合5。POLD1基因的转录似乎是从多个位点开始，但主要起始位点在53个核苷酸的起始密码子ATG的上游，定位于328-bp以内。作为哺乳动物的看家基因之一，POLD1基因的启动子5’-端上游区域富含G/C，不含TATAbox。有两个ll-bp的同向复制序列(5' -GGGGCGTGGCC-3')位于-92bp和-22bp处，这两个ll-bp的重复序列对POLD1启动子以方向非依赖方式起到激活剂的作用。这两个重复序列缺失其中一个，POLD1启动子活性会下降2-4倍，两个都缺失时启动子活性则几乎消失8。两个重复序列的移码突变亦会使启动子活性显著下降 。在启动子的区域内-68到-58核苷酸位置似乎存在一个负调控序列，我们称之为E-Box,当E-Box缺失可导致启动子活性增加。有趣的是，这个区域内的序列（5'-CACTTG-3'在位置-63到-58）基本区域与螺旋-环-螺旋蛋白和螺旋-环-螺旋-拉链蛋白的结合位点非常相似8。两个ll-bp重复序列的左半部分（5'- GGGCG T-3'）类似于共识的Sp1结合位点的序列（5'- GGGCG G-3'; 31，32）。
POLD1基因的编码蛋白p125集中体现了DNA聚合酶δ的聚合酶和外切酶的活性，由 1107 个氨基酸残基组成。在人为的分离出p125亚基序列的研究进程中，发现人与鼠之间 pl25蛋白同源性为 93%，人与酵母之间同源性为 50%－60% 。P125蛋白中含有6个聚合酶同源序列区，具有保守性，但是每个序列区的保守性存在一定差异。从 N－末端开始按顺序排列为Ⅳ区、Ⅱ区、Ⅵ区、Ⅲ区、Ⅰ区及Ⅴ区 。Ⅰ区的保守性最高，Ⅳ区保守性最低但同时也参与扮演p125 蛋白外切酶活性位点的部分功能角色。Ⅴ区及Ⅵ区可以维持pl25蛋白三维结构 。N－末端的外切酶功能区域包括ExoⅠ（氨基酸310-326）ExoⅡ(氨基酸393-409)和ExoⅢ(氨基酸504-519)。外切酶功能区与聚合酶同源区的错落式结构配置，是p125蛋白集中体现外切酶和聚合酶活性的原因。p125 蛋白的 C－末端存在 CT－1、 CT－2 和 CT－3 三个高度保守的的区域。同时也存在两个由半胱甘酸组成的锌指结构域：ZnF1 及 ZnF2 。这两个结构域也具有有高度保守性，它们被认为参与“ DNA－蛋白”及“蛋白－蛋白”相互作用12。
前文中所述的POLD1基因及p125蛋白的所有高度保守性的区域，对DNA聚合酶δ在DNA复制合成进程中所发挥的功能是十分重要的。 这些保守性的区域若出现任何缺失、变异等异常情况，均能直接导致DNA聚合酶δ的活性异常进而引起细胞增殖异常。
2、POLD1基因表达异常与癌症
在人急性淋巴白血病细胞（Molt4-cell）的高速增殖进程中，发现POLD1基因mRNA和p125蛋白质水平的高峰期G1/S期间,POLD1启动子活性比正常细胞高出4倍,表明POLD1基因的活跃表达与细胞恶性增殖是正相关的，同时该基因是在转录水平受细胞周期的调控 。
欧贤红等收集 20例原发性肝癌组织和对应的癌旁组织标本，并检测了组织中POLD1基因及p125蛋白的表达情况,数据显示POLD1基因中在肝癌组织高表达，而在癌旁组织中低表达 .P125蛋白表达情况与POLD1基因一致并且与肿块大小和临床分期呈正相关。Sanefuji 在他的实验中指出，pl25蛋白与肿瘤的分化情况存在相关可能性，因为在有血管浸润、细胞低分化及预后差的原发性肝细胞癌中pl25蛋白呈表达上调状态。
Maehara等人经过比较高分化胃癌组织、低分化胃癌组织及正常胃组织中的Polδ的活性,证实了低分化胃癌中Polδ总活性明显的高于另外两种组织 。Polδ的功能活性集中体现在它的催化亚基POLD1基因上。阮细玲等人进行了扩大样本量的实验，在 62例胃癌组织及对应的癌旁组织中检测了POLD1基因的编码蛋白pl25的表达，发现pl25在癌组织的表达高于癌旁胃组织,并且再次指出pl25的表达水平与肿块大小相关 。
我们收集了69例经病理确诊的乳腺癌患者新鲜手术标本，取用乳腺癌组织及其相对应的癌旁乳腺组织，同时检测其中的POLD1基因及p125蛋白的表达情况。结果发现，POLD1基因及p125蛋白在乳腺癌组织中均呈显著高表达，对应癌旁组织中呈低表达。我们还发现，POLD1基因及p125蛋白在乳腺癌的不同临床分期中表达存在一定差异性，POLD1基因与乳腺癌的临床病理特征ki67阳性表达呈正相关。
3、POLD1基因突变与癌症
即使DNA复制的保真度很高，有些错误总是逃避校对，尤其是当复制过程中，基因发生的突变时，往往导致癌症的发生。在哺乳动物中，聚合酶校对缺陷导致错配修复能力缺失也会导致基因出现突变表型,并提高癌症易感性 。早在20世纪80年代后期，人们就发现，在四个错配修复基因（种系突变MSH2，MLH1，MSH6和PMS2）的缺陷，是遗传性结直肠癌和Lynch综合征的致病因素，由此鉴定这四个基因的缺失为自发突变性的提高的原因 ， ， ， 。 错配修复基因缺失在其他类型的癌症中也存在,如子宫内膜癌、大肠癌、肺癌及胃癌 。
DNA聚合酶是负责合成的DNA，并进行复制，在DNA修复和基因重组中必不可少的。DNA复制是一个非常复杂的过程，并在真核细胞中涉及多种酶包括B家族聚合酶聚合酶α，聚合酶δ和聚合酶? 。在DNA聚合酶δ中，POLD1基因在功能或调控区发生碱基置换突变表型,可能引起处于平衡的调控网络被打破,导致肿瘤发生。在小鼠的POLD1基因序列上读码框，发生点突变(D400A)的模型中，发现校正能力缺陷并有高度上皮细胞癌易感性 。最近有研究指出，人类的POLD1基因序列中发生外切酶结构域突变极易患“聚合酶校对相关性息肉病”，该疾病多表现为大肠腺瘤和大肠癌，并且具有显性遗传倾向 。POLD1基因的编码蛋白pl25集中体现有聚合酶和外切酶活性，活性位点均为基因序列上的高度保守区域，可以参与修复受损伤的碱基，识别并切除错配的碱基。人们在表达p125蛋白聚合酶活性的保守区域的同一位点基因序列中，构建小鼠POLD1L604G和POLD1L604K变异体的杂合基因，作为突变小鼠模型30。试验中发现和相同位点的野生型对照组比较，POLD1L604G杂合基因组的小鼠寿命及细胞表型与野生型组一样；而POLD1L604K杂合基因组的小鼠寿命大为变短,加速癌变 。
4、POLD1基因和多种调控因子的相互作用与癌症
在POLD1基因启动子中ll-bp重复序列的左半部分（5'- GGGCG T-3'）类似于的Sp1结合位点的序列（5'- GGGCG G-3'; 31，32）。事实上，一些实验表明，Sp1的可以绑定到POLD1启动子的11-bp的重复序列上。Southwestern blot分析表明，一个105 kDa的蛋白质，与Sp1的蛋白质结为复合体，可以绑定到11-bp重复序列8。另一个Sp1的家族蛋白——Sp3，也可以通过同样的方式绑定到11-bp的重复序列上8。这两个Sp1的家族蛋白通过蛋白复合体方式激活POLD1启动子活性，进而促进细胞周期进程8。也许是由于Sp1与p53存在重合的结合位点，p53可以与Sp1竞争结合POLD1启动子 。然而，当野生型的p53通过竞争结合到POLD1基因中时，基因的启动子活性收到抑制 。当突变型p53竞争性结合到肝细胞中的POLD1基因时，细胞的侵袭性增殖能力显著提高 。
Rb蛋白是视网膜母细胞瘤的一种抑癌基因产物，受周期素依赖蛋白激酶的调节。Rb蛋白在细胞核中以活化的脱磷酸化和失活的磷酸化的形式存在,以调控细胞的分化和增殖。Rb蛋白对控制细胞分裂、分化、凋亡和肿瘤的产生关系密切。具有LXCXE的氨基酸结构域的蛋白常与Rb蛋白结合。例如它与E2F转录因子结合来调节E2F参与的转录过程。有研究发现pl25蛋白中第711-715氨基酸残基上的LXCXE区是与Rb蛋白结合的位点,这表明POLD1基因可能参与Rb蛋白介导的肿瘤产生 。在阮细玲等人的实验中已经知道p21对胃癌细胞的增殖有抑制作用 。在另一项实验研究中，选取乳腺癌细胞株MCF-7，人为的构建了MCF-7-p21细胞模型后发现，MCF-7-p21细胞在p21高表达情况下增殖速度明显比MCF-7细胞减慢，血清依赖性增强,细胞的锚定和非锚定依赖性增殖均受到抑制；荧光素酶报告基因实验发现MCF-7-p21细胞模型中POLD1基因启动子的活性明显收到抑制 。这些实验初步表明，p21对POLD1基因具有明显的抑制作用，这些作用可能是直接的也可能是间接的。以上实验结果表明，p53、Rb蛋白、p21这些已知的以及其他一些可能存在的未知的调控因子，在细胞周期的进程中通过协同调控模式，共同调节POLD1基因在细胞中的癌特异性表达。
5、结论
综上所述,POLD1基因的表达在恶性增殖的细胞中，具有癌特异性，但其表达量异常的具体机制我们目前也尚在探索阶段。POLD1基因在高度保守的功能区或表达外切酶活性区域发生突变，从而引发错配修复缺失导致癌症的发生。POLD1基因的在恶性细胞中的癌特异性很可能是通过多种已知或未知的调控因子如p53、Rb蛋白、p21等，在不同的机制和通路上协同调控的。
POLD1基因与细胞恶性增殖关系极为密切,在癌症的发生发展过程中，具体起到哪些正常的或异常的作用和机制，仍需要我们继续深入了解。
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论文作者:李锦源
论文发表刊物:《医师在线》2017年5月上第9期
论文发表时间:2017/7/4
标签：基因论文; 蛋白论文; 序列论文; 细胞论文; 活性论文; 突变论文; 组织论文; 《医师在线》2017年5月上第9期论文;