袁凤山, 张坤, 杨立新, 王大会, 尤春暖[1]2004年在《人胰岛素原基因胰外表达重组体的构建及鉴定》文中研究指明目的 :构建胰外表达成熟胰岛素的重组体。方法 :将人胰岛素原基因进行二处突变 ,突变后的胰岛素原基因与逆转录病毒载体 pLXSN重组并转染肝癌细胞。提取肝癌细胞基因组DNA ,PCR方法鉴定人胰岛素原基因与载体重组结果及在肝癌细胞基因组中整合情况。同时测定成熟胰岛素的表达。结果 :胰岛素原基因已整合到肝癌细胞基因组。突变的胰岛素原可被广泛存在的furin酶识别 ,在培养基内检测到较高浓度的成熟胰岛素。结论 :成功构建胰外表达成熟胰岛素的突变人胰岛素原基因逆转录病毒重组体。
张坤[2]2002年在《突变的人胰岛素原基因逆转录病毒重组质粒的构建及鉴定》文中研究指明前言 1 型糖尿病是由于胰岛β细胞自身免疫损伤导致的胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素，从而可达到永久治疗的目的。因此基因转移载体的选择对糖尿病的基因治疗至关重要。 逆转录病毒载体pLXSN来源于Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)，与携有人突变的胰岛素原基因质粒的PMD18-T载体具有共同的酶切位点，从而可作为载体运用分子生物学实验技术与人突变的胰岛速原基因重组构成新质粒。 本实验的目的是 1：掌握基因重组技术及鉴定方法。 2：构建重组的逆转录病毒载体，为糖尿病基因治疗的进一步试验奠定基础。 材料与方法 1．测序鉴定突变的人胰岛素原cDNA。 2．逆转录病毒表达载体的构建： (1)Hpa Ⅰ，BamH Ⅰ双酶切pLXSN。 (2)Sal Ⅰ酶切携有人突变的胰岛素原基因(MpINS)的PMD18-T载体，3末端平滑并将其5末端磷酸化(BKL)后，用BamH Ⅰ酶切。 (3)琼脂糖凝胶电泳，回收(1)和(2)中5kb和400bp的目的基因片段。 （3）用 TaKaRa DNA ligation kit将回收的（1）（2）片段连接成pLXSN＊MpINS o K）连接物转化感受态细胞HB 101。 K）筛选阳性克隆，提取质粒。 3·PLXSN－MPINS重组体的鉴定： 门严CR鉴定重组体。 （2）EcoR和 BamH酶切鉴定。 实验结果 1．突变的人胰岛素原CDNA测序结果见后。 2．突变的人胰岛素原质粒逆转录病毒载体重组质粒的构建： （1）Hpa＼BamH分别对应在p以SN（5．gkb）的 1477hp ＃149fop的位点，双酶切pLXSN后，电泳回收得到5860hp的片段，结果见图5。 （2）Sal、BamH分别对应在PMD18－T（2．7kb）的33hP 和452hP的位点，S＊ 酶切携有 MPINS的PMD18－T载体，BKL后再用BamH酶切，电泳回收得到418hp的片段，与标准分子量对照后证实含有MPINS，见图6。 3·PLXSN－MPINS重组体的鉴定： ＊）PCR鉴定重组体：连接物经扩增，电泳后出现清晰条带，见图7。 p）酶切鉴定插人方向：BamH上coR等限制性内切酶酶切得到5860hP和418hP两个片段的为单正向重组体，见图8。 讨 论 逆转录病毒载体（RV）介导的基因转移技术是一种高效的转 ·2·染技术，通过该载体的协助，目的基因进人靶细胞。RV不仅能高效转染，而且能将目的基因整合进宿主菌的染色体中，随着宿主菌的分裂将目的基因传递给下一代，这种技术在基因治疗中很常见。 pLXSN是一种源于MoMLV的新型载体，经重新构建而成，按照结构分是属于带有内部启动子的w。载体。它的结构基因gag，env0 等被删出，而且gag的翻译基因的起始密码子ATG被终止密码子TAG所取代。将5端MOMLV序列用相应的小鼠肉瘤病毒（MOMSV）的序列片段代替，这样就进一步降低了同源重组的概率，使逆转录病毒载体介导的基因转移隐患大大降低，具有较高的安全性。有些学者利用PLXSN载体已成功地报道了对ADA下DNF。凝血因子Vlll等进行了基因转移及表达的研究。 前胰岛素原是在胰岛的p细胞内合成的，前胰岛素原在内质网由于共同转录信号序列被去除而形成胰岛素原，以后进人高尔基器，在前激素转化酶（PC。和PC＊的作用下，裂解出C肽，合成成熟的胰岛素川链和A链的复合体厂体内非p细胞不含PC。和PC。酶，因而不能合成成熟的胰岛素而分泌到细胞外。我们通过分子生物学的基因点突变技术，使人胰岛素原基因的B－C链与C－A链连接处的H元碱变成四元碱，从而可被非p细胞内普遍存在的i n酶所识别和剪切，合成成熟的胰岛素分泌到细胞外，参与糖尿病患者体内糖代谢的调节。而以往糖尿病的基因治疗模型中，虽可测到靶细胞内的胰岛素水平，但因不能分泌到靶细胞外或靶细胞外仅有少量成熟的胰岛素表达，而主要表达为胰岛素原，从而限制了其应用。 本实验利用逆转录病毒pChSN作为载体，与携有人突变的胰岛素原基因的载体PMD18－T具有共同的酶切位点BamHI，用限制性内切酶将两者分别切开，再运用分子生物学重组技术构成新质粒，该质粒既可使逆转录病毒的RNA基因的DNA拷贝稳定整合进被感染细胞的染色体中，使突变的胰岛素原基因稳定羡达胰 ·3·岛素并可将成熟胰岛素分泌到细胞外。从两方面为进一步实验奠定基础。 结 论 1．可运用基因重组技术构建突变的胰岛素原基因逆转录病毒重组体。 2．酶切电泳及PCR鉴定重组体中突变的胰岛素原基因克隆及插人方向正确，构建的新质粒可为进一步试验奠定基础。
兰丽珍[3]2004年在《逆转录病毒介导人胰岛素原突变基因转染肝细胞分泌成熟胰岛素的实验研究》文中指出第一部分人胰岛素原基因的定点突变和修饰目的：完成人胰岛素原基因5个碱基的定点突变，并加上信号肽和增强表达的Kozak序列，使之能在普通细胞中被Furin蛋白酶识别，从而去除C肽，分泌成熟胰岛素。方法：采用PCR体外定点突变技术（PCR-SDM），设计4对引物，引入5个Furin蛋白酶识别的突变位点，通过重迭延伸法PCR扩增，使人胰岛素原编码基因B10密码子由CAC突变为GAC；C3密码子由GAA突变为AAA；C4密码子由GCT突变为CGT；C32密码子由CTT突变为CGT，并在其上游加上信号肽和Kozak序列，将扩增片段克隆入T载体并测序。结果：DNA测序结果表明预期位点突变符合要求，信号肽和Kozak序列正确引入。结论：应用PCR诱导突变技术，在体外能准确、简便有效诱导国家自然科学基金资助(No.30070356)<WP=10>胰岛素原基因突变，使体外应用非内分泌细胞构建高效分泌成熟胰岛素细胞克隆成为可能。
王大会[4]2004年在《构建调控分泌成熟胰岛素的逆转录病毒重组质粒》文中提出前言 以DNA重组技术为核心发展起来的分子生物学技术，是人们认识生命本质的有利工具，已经渗透到工、农、医等各行业为各行业的发展做出无法估量的贡献。基因治疗已成为医学各学科研究疾病治疗的新途径和热点。1型糖尿病以单一一种蛋白质--胰岛素缺乏为特点，无疑成为基因治疗的理想疾病。 糖尿病的基因治疗国内外很多实验已经在糖尿病动物模型内尝试，基因治疗目前急待解决的问题是胰岛素的合理调控分泌和安全有效的载体导入系统。 本实验在前人的基础上，在突变的胰岛素原基因的上游连接二个调控元件：肝丙酮酸羧激酶(L-PK)基因启动子中的葡萄糖反应元件(GLRE)和胰岛素生长因子结合蛋白-1(IGFBP-1)基因启动子胰岛素反应序列，并转导入逆转录病毒载体。预想籍此转入鼠肝细胞完成胰岛素受血糖刺激和自身反馈抑制的理想分泌，从而为糖尿病基因治疗的进展并最终应用与临床做基础性的铺垫。 实验材料与方法 1．Mini Best plasmid Purification Kit提取质粒pLXSN-INS，pMD18-T-INS并鉴定。 2．测序鉴定pUC-GI质粒。 3．对突变的胰岛素原基因、胰岛素生长因子结合蛋白-1基因(IGFBP-1)、丙酮酸羧激酶基因(L-PK)进行限制性酶图谱分析。选择合适的限制性内切酶位点进行基因重组。 4．重组突变人胰岛素原基因：在其上游重组调控分泌元件 (1)．XbaⅠ限制性内切酶切pMD18-T-INS质粒，3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次酶切，电泳切胶回收418bp条带。 (2)．SphⅠ限制性内切酶切pUC-GI质粒3’平滑，5’磷酸化；SalⅠ再次酶切，电泳切胶回收3740bp条带。 (3).连接上述两步骤产物。 (4).连接产物全量转人感受态细胞，筛选阳性克隆，提取纯化。 (5).鉴定重组质粒pUC一Gn。 5.构建含调控元件的突变人胰岛素原基因的逆转录病毒重组质粒。 (1).限制性内切酶Hindln酶切pUC一Gll质粒，产物乙醇精制后3’平滑，5’磷酸化;限制性内切酶Ec0RI再次酶切，电泳切胶回收1008坤条带。 (2).限制性内切酶BalnHI酶切pLXSN一INS质粒，产物乙醇精制后3’平滑，5’磷酸化;Ec0RI再次酶切，酶切产物全部上样电泳胶回收59加坤条带。 (3).连接上述两步骤产物. (4).转化感受态细胞JM 109，涂板过夜培养，筛选阳性克隆并提取纯化。 (5).PCR及酶切方法鉴定重组质粒pl盆SN一Gll。实验结果 1.突变的胰岛素原基因、胰岛素生长因子结合蛋白一1基因(IGFBP-1)、丙酮酸梭激酶基因(L一PK)进行限制性酶图谱分析结果见图9。 2.限制性内切酶Xbal，sall分别对应在T载体的T一A克隆位点EeoRV两侧，两酶切pMD18一T一INS后，切下约2690bp的载体片段及约418bp左右的突变胰岛素原基因片段。切胶回收突变胰岛素原基因片段电泳结果见图1。 3.限制性内切酶印hI，S欲I双酶切pUC一GI质粒后，胶回收3740bP条带电泳结果见图2。 4.分别应用限制性酶切及PCR两种方法鉴定重组质粒pUC一Gll。电泳结果分别见图3，图4。 5.重组质粒pUC一Gll插人片段的上游多克隆位点含有Ec0IU限制性酶切位点，下游含有Hindln酶切位点。双酶切后回收loosbP的目的DNA片段，电泳结果见图5。 6.pLXSN一INS质粒的突变胰岛素原基因插入在载体的多克隆位点的Ec0RI及BamHI两限制性酶切位点之间。BamHFEco班双酶切下的载体片段电泳结果见图6。 7.选择合适的限制性内切酶鉴定重组质粒pLXSN一Gll，结果见图7。应用多聚酶链式反应进一步鉴定重组质粒结果见图8。讨论 近年来，利用基因工程建立和分泌胰岛素的细胞系治疗糖尿病已经引起科研工作者的极大兴趣，并取得了可喜的进步。但糖尿病的基因治疗又面临着巨大的挑战，其中之一就是采取何种策略将胰岛素的水平限制在一个非常狭窄的生理范围内，否则，若将基因工程改造后的p细胞应用于人体内，会因为细胞释放过多的胰岛素引起低血糖，甚至严重致死。一些来源于真核细胞的启动子曾经尝试调控基因的表达，启动转录的物质为类固醇激素、氧气、重金属、或物理刺激(如放射线等)。然而这些启动子并不适用于应用临床治疗。 本实验选取胰岛素生长因子结合蛋白一1基因调节区及丙酮酸梭激酶基因的葡萄糖反应元件区作为基因调节序列，突变人胰岛素原基因与两段顺式调控元件(胰岛素生长因子结合蛋白一1基因调节区及丙酮酸梭激酶基因的葡萄糖反应元件区)重组，通过肝脏细胞特异的反式调控因子即转录因子即可实现细胞特异的调控表达。此种调控感受机体生理浓度葡萄糖及胰岛素的刺激，实现按生理需要调控胰岛素分泌。为糖尿病最终应用于临床奠定了坚实的基础。 把外源基因转人靶细胞的技术主要有:化学物理方法:DNA与一磷酸钙共沉淀法，脂质体包埋法，脂质体细胞融合法，显微注射法，电穿孔法;病毒载体的方法:RNA病毒和DNA病毒载体等。本实验采用了逆转录病毒载体转染法，其介导的基因转移具有高效转移，高整合，高表达和宿主细胞范围广的优点，是常用的基因转移系统，其感染?
郑宏庭[5]2006年在《联合表达成熟胰岛素与葡萄糖激酶的HepG2细胞构建研究》文中认为研究目的:糖尿病以胰岛素绝对或相对缺乏而引致各种代谢紊乱为主要特征,其病因尚未完全阐明。传统治疗手段为外源性胰岛素替代治疗,由于与胰岛素分泌的生理模式不符,易致血糖波动和剂量不当而引起的相关并发症。细胞移植治疗是近年研究的热点,但由于胰岛B细胞分离与储存技术难度较大、代价昂贵,因此寻找新的移植细胞来源是该方法亟待解决的关键难题。本课题运用基因重组及转基因技术,将HepG2细胞成功改建为具有葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)的“胰岛代理细胞”(artificial beta cell),从而为该难题的解决找到一条新的途径。研究背景:1、肝细胞直接参与糖、脂代谢,拥有众多代谢相关蛋白及其基因中的葡萄糖反应元件(glucose inducible regulatory elements,GIREs),是构建“胰岛代理细胞”的理想靶细胞。2、将肝细胞改造为“胰岛代理细胞”,需解决以下叁个问题:①
王玉霞[6]2005年在《重组人胰岛素原基因在培养的大鼠肝癌细胞中基因转移和表达的研究》文中进行了进一步梳理前言 1型糖尿病(T1DM)是一种由于胰岛β细胞的自身免疫性损伤导致胰岛素分泌的绝对缺乏,而引起的代谢障碍性疾病。由于其是单一蛋白质—胰岛素缺乏所致的代谢障碍,从而成为基因治疗的适应症。通过基因转移技术将人胰岛素原基因导入糖尿病患者体内,以产生长期、稳定、按生理模式分泌的胰岛素,从而达到永久治疗的目的。但是该基因转入糖尿病患者体内或动物体内之前,必须在体外证明该重组人胰岛素原基因具有长期、稳定、按生理模式调节胰岛素分泌的能力。本实验通过把含重组人胰岛素原基因的质粒以逆转录病毒为载体转入大鼠肝癌细胞CBRH7919,筛选出含有重组胰岛素原基因的肝癌细胞,并检测该种细胞转染后38h及转染后1个月在不同葡萄糖浓度下其胰岛素的分泌情况。为下一步的动物水平实验打下基础。 本实验的目的是: 1 掌握细胞培养、复苏及冻存技术。 2 掌握基因转染技术及鉴定方法。 3 测定不同葡萄糖浓度下肝癌细胞在转染后38h及稳定表达后胰岛素的分泌情况。 4 掌握从细胞中提取DNA、PCR扩增目的DNA及电泳技术。 材料与方法 一、材料 1.大鼠肝癌细胞株CBRH7919细胞,购自中科院上海细胞生物研究所。 2.含有二点突变的胰岛素原基因重组质粒(GLRE),BP-1-INS_2及含
袁凤山, 王大会, 王冰, 张锦, 王玉霞[7]2005年在《人胰岛素原基因B10位定点突变对增强胰外表达效率的实验研究》文中认为目的构建在肝细胞内增强表达成熟人胰岛素的生理调控性人胰岛素原基因重组质粒。方法利用PCR定点突变技术在B-C及C-A连接处已两点突变的人胰岛素原基因上进行B10位突变,并在其上游连接肝细胞特异的3倍体葡萄糖反映元件(GLRE3)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1启动子(IGFBP-1P)。经酶切后将含有调控元件的3点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)插入逆转录病毒载体(pLXSN),脂质体介导转染大鼠肝癌细胞CBRH7919后检测成熟胰岛素表达情况及与含有调控元件的2点突变人胰岛素原基因(GLRE3-IGFBP-1P-3mINS)表达体的表达差异。结果人胰岛素原基因的B10位组氨酸编码序列CAC突变为门冬氨酸编码序列GAC。构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体质粒(pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS),酶切、PCR及测序鉴定各段基因碱基序列及连接方向正确。pLXSN-GLRE3-IGFBP-1P-3mINS经脂质体包裹转染大鼠肝癌细胞,细胞外液含5.0、25.0mmol/L的葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为5.03±0.72、43.90±2.30mU/L。未进行B10位突变的重组体转染组在同样葡萄糖浓度下胰岛素含量分别为<2.00、2.10±0.23mU/L。结论成功构建了含调控元件的B10位门冬氨酸人胰岛素原基因逆转录病毒载体重组质粒,该重组体已整合入鼠肝癌细胞基因组,其表达效率显着提高并受葡萄糖生理性调控。
王冰[8]2005年在《人胰岛素原基因非β细胞表达质粒的构建与包装》文中认为前言 1型糖尿病是一种受多基因调控,以胰岛素缺乏及高血糖为主要特征的自身免疫性疾病。目前的治疗手段主要是外源性胰岛素替代治疗,但每日注射胰岛素除给患者带来痛苦和不便外,还可导致严重低血糖。近年来,分子生物学尤其是重组DNA技术不断发展,由于糖尿病是因单一组分胰岛素缺乏引起的,且糖尿病患病率较高,使之成为基因治疗研究的热点之一。 本实验在前人将furin酶识别序列引入人胰岛素原基因并在其上游连接两个调控元件的基础上,采用定点突变技术,将人胰岛素原基因B链10位组氨酸突变为天冬氨酸,以增加成熟胰岛素的稳定性和产量。随之将携有调控元件的突变胰岛素原基因导入逆转录病毒载体,构建逆转录病毒重组质粒,并采用脂质体转染法将重组质粒导入PA317包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度,筛选出一株高效特异的产病毒细胞克隆,为下一步的细胞和动物实验打下基础,从而为糖尿病基因治疗最终应用于临床做基础性的铺垫。 实验材料与方法 一、诱导人胰岛素原基因B链10位组氨酸突变为天冬氨酸 1.设计引物。 2.PCR反应并应用1%琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段。 3.DNA片段的末端平滑,5’磷酸化,行连接反应。 4.PUC118-GⅡ_3导入感受态细胞,菌落的鉴定。 5.PUC118-GⅡ_3质粒的提取,纯化。 6.PUC118-GⅡ_3测序,以证实点突变的存在。 二、逆转录病毒重组质粒的构建
石琳[9]2008年在《腺病毒介导的突变型人胰岛素原基因转染人脐带间充质干细胞》文中研究指明研究背景:目前糖尿病已成为仅次于心脑血管病症和癌症的第叁大死亡疾病,它是一种影响体内胰岛素和糖含量的疾病,共有两种主要类型,分别为Ⅰ型和Ⅱ型,其共同特征是胰岛β细胞损伤或不能产生足够的胰岛素或机体不能有效的利用胰岛素,所以胰岛素就被作为治疗糖尿病的特效药应用于临床。由于随时需要注射胰岛素,给患者带来了极大的不便,目前国际上对糖尿病患者进行胰岛移植和基因治疗研究成为了热点。但面临的主要问题是供体不足,免疫排斥,胰岛素基因的转染效率和表达调控等。人脐带来源的间充质干细胞可以较易获得和纯化,并且易于基因修饰,可以将外源性基因转染间充质干细胞,建立一种安全的基因治疗的“细胞载体”。研究表明间充质干细胞还有免疫抑制功能,它不但在体外可以抑制T淋巴细胞增殖反应,在体内实验中也表现出了类似免疫抑制剂的作用,所以利用它作为细胞载体可以避免免疫排斥问题。并且我们利用基因重组的方法将胰岛素原基因进行改造,使其可以在非β细胞(间充质干细胞)中高效表达。相信我们的研究可以为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一些有力的实验依据。目的:将人胰岛素原基因进行两个部位的突变,通过腺病毒介导将其转染到人脐带间充质干细胞中,研究其表达分泌人胰岛素的能力。方法:应用RT-PCR的方法从健康流产胎儿胰腺组织中扩增pINS的cDNA序列,利用重迭延伸PCR方法对pINS基因在A链-C肽和C肽-B链的连接处进行两个部位的突变,产生Furin蛋白酶酶切位点。采用AdEasy~(TM)系统构建重组腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP。分离培养人脐带间充质干细胞,并对其生长特性,免疫表型,分化能力及Furin蛋白酶的表达进行鉴定。pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP感染人脐带间充质干细胞后,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测它们的感染效率,并确定最佳的感染复数(multiplicities of infection,MOI)。以感染复数为100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人脐带间充质干细胞1、3、5、7、10天后,RT-PCR检测人胰岛素原基因在人脐带间充质干细胞中表达;Western blot检测成熟人胰岛素和人C-肽在人脐带间充质干细胞中的表达;免疫荧光实验检测感染后48小时人胰岛素在人脐带间充质干细胞中的表达:ELISA实验检测感染后1、3、5、7、10天人胰岛素和人C-肽的分泌。结果:自健康流产胎儿胰腺组织中扩增出364 bp的pINS cDNA,连接入穿梭质粒中,构建重组腺病毒。pAdINS-M2经扩增纯化后滴度达到2.57×10~(10) PFU/mL,pAdINS的滴度为1.25×10~(10)PFU/mL,对照病毒AdGFP为4.85×10~9 PFU/mL。成功的从脐带组织中分离培养出间充质干细胞,绘制生长曲线,约3天扩增一代。细胞周期检测,大部分细胞都处于G0-G1期(占94.39%),小部分处于G2-M期(4.15%)和S期(1.45%)。在合适的诱导培养条件下,分离培养的人脐带间充质干细胞能够分化为脂肪细胞和成骨细胞。应用RT-PCR方法在人脐带间充质干细胞中检测到了Furin蛋白酶的存在,表明我们构建的含Furin蛋白酶酶切位点的人胰岛素原基因在此细胞中可以被切割产生成熟的人胰岛素。通过重组腺病毒pAdINS、pAdINS-M2和pAdGFP以不同感染复数感染人脐带间充质干细胞,利用荧光显微镜和流式细胞仪检测感染效率,确定MOI 100为最佳的感染复数。以MOI=100的pAdINS、pAdINS-M2或pAdGFP感染人脐带间充质干细胞1、3、5、7、10天后,RT-PCR方法检测到在pAdINS和pAdINS-M2感染的UC-MSCs中人胰岛素原基因都有表达;Western blot的结果显示pAdINS感染的UC-MSCs表达人胰岛素原,而pAdINS-M2感染的UC-MSCs中检测到了人胰岛素和C.肽,pAdGFP感染的UC-MSCs中两者都没有检测到表达。免疫荧光也检测了pAdINS-M2感染后48小时人胰岛素和C-肽在人脐带间充质干细胞胞浆中表达:ELISA检测感染后1、3、5、7、10天培养上清中人胰岛素和C-肽的浓度。结果显示,自感染后24小时目的基因就开始表达,第3-5天表达量达高峰,一周后表达有所下降。与RT-PCR和Western blot结果一致。结论:成功构建含有Furin蛋白酶切位点的人胰岛素原基因腺病毒重组体(pAdINS-M2);分离培养了人脐带源间充质干细胞,并对其进行了鉴定;重组腺病毒pAdINS-M2感染人脐带间充质干细胞后,表达分泌成熟人胰岛素和C-肽。可以为Ⅰ型糖尿病的治疗提供一些有力的实验依据。
刘兆喆[10]2003年在《含突变人胰岛素原基因质粒的包装及病毒滴度测定》文中提出前言 1型糖尿病是由胰岛β细胞自身免疫损伤导致胰岛素绝对缺乏的一种代谢障碍性疾病，目前临床上主要采用胰岛素替代疗法。随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们开始把研究重点放在1型糖尿病的基因治疗上。通过基因转移技术将突变人胰岛素原基因直接导入糖尿病病人体内，使其能在病人肝细胞染色体中稳定整合并且能按生理模式分泌出成熟胰岛素，最终可达到永久治疗1型糖尿病的目的。 本实验用包装细胞对突变人胰岛素原基因与逆转录病毒重组后产生的质粒进行包装并测定病毒滴度。由于逆转录病毒载体(PLXSN)本身是由Moloney小鼠白血病病毒改建而成，在改建中其gsg、env、pol叁部分编码野生型病毒颗粒所必需的基因被去除，无法编码病毒结构蛋白，而包装细胞则是已经人为导入了表达病毒结构蛋白基因的细胞系，故载体需要经过包装细胞的反式补偿才能装配成病毒颗粒。本实验所用包装细胞PA317是第二代包装细胞，其产生的逆转录病毒可感染多种动物，具有广谱的宿主范围，而且还具有高病毒滴度，不产生辅助病毒的特点，适用于人类基因治疗的实验研究。 本实验的目的是： 1．掌握细胞培养及冻存技术。 2．掌握基因转染技术及鉴定方法。 3．筛选出高滴度的产病毒细胞克隆，为糖尿病基因治疗的进一步实验奠定基础。 材料与方法 H材料 PLXSN质粒购自美国CLONTECH公司。PLXSN－MpINS质粒是由前一步实验人员将MpINS质粒与PIHSN重组构建而成。PA317包装细胞购自中国科学院上海细胞库。NIH3Th细胞系由本室提供。脂质体（LIPOFECTAMINEm）购自美国 M TeCImolo－gies公司。cafs（Geneticin）、DMEM（D讪既co’s mo沥ea E呼e’smedium）培养基均购自北京华美公司。PCR试剂购自中日合资宝生物工程（大连）有限公司。25Inl培养瓶和6孔培养板购自北京华美公司。 一方法 1．用碱裂解法提取含突变人胰岛素原基因的质粒。 2．应用脂质体载体介导方法将PLXSN－MpINS质粒转染至PA317包装细胞。 门转染前24小时，将对数生长期的PA317细胞按4rllir孔加人6孔培养板，并用单无 DMEM培养液将细胞配成 10’细Mud浓度。 2）转染当天，按脂质体试剂操作说明书的优化组合条件进行实验，将PLXSN－MPffiS质粒转染至PA3 17细胞，并将未转染的PA317细胞设为对照组。 3．用G418筛选出阳性产病毒细胞克隆并测定病毒滴度。 4．用1’mrOL法提取末转染和转染后PA3 17细胞的基因组DNA。 ·2· 5．采用PCR检测突变人胰岛素原基因的整合情况以证明所产生的病毒DNA没有发生重排或丢失。 实验结果 1．PA317抗性克隆的形成。 经脂质体介导将PLXSN－MpINS导人PA317细胞并用G418筛选可得到大小不等的细胞克隆（图门，而对照组无细胞克隆形成且绝大部颁亡（图2人说明基因转导已经成功。 此后逐渐将长大的抗性克隆局部消化并转移到6孔板，再传至 25 Inl培养瓶内。 收集PLXSN－MpINS－PA317的培养上清用以转导NIH3Th细胞。 2．病毒滴度的测定 挑选出7个克隆按病毒滴度计算公式计算得到下表： 表 IPA3 17的病毒滴度＊fu／Inl） 克隆 病毒滴度＊） l 二．80 X 104 ZI．23X104 31．15 X 104 4 二．44X10’ 5 9．72 X 103 61．93 X 104 7 2．10 X 104 ·3· 3．目的基因整合的鉴定 用PCR扩增及电泳鉴定突变人胰岛素原基因的整合情况：发现阳性克隆细胞基因组都扩增出418hp的目的基因片段电泳条带，而未转基因的PA317细胞DNA则无此条带（图3入证明突变人胰岛素原基因已在 PA3 17细胞基因组上稳定整合。 讨 论 脂质体转染法的原理是：脂质体通过和样品中DNA相互作用，形成脂质体－DNA复合物。这种脂质体一DNA复合物可以吸附于靶细胞表面，通过脂质体膜与细胞膜融合而将外源DNA导人纲胞内。脂质体转染法操作方便、毒性低、转染效率可靠、既适用于瞬时转染也适用于稳定转染。但脂质体转染法存在一个主要缺点即转人的基因不能稳定长期表达。为了克服这一不足，我们使用逆转录病毒载体来介导，将构建于逆转录病毒载体上的突变人胰岛素原基因通过脂质体转染到靶细胞。逆转录病毒载体除了具有可转染的靶细胞种类多，转染效率高等优点外，还可整合至靶细胞染色体中，进行复制转录，从而得到稳定表达。 将目的基因导人靶细胞是基因治疗过程中的一个重要环节，其效率的高低将直接影响基因治疗的效果甚至成败。而逆转录病毒载体介导的基因转移中高滴度感染性逆转录病毒包装细胞系的获得对目的基因转?
参考文献：
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