绍兴文理学院医学院 浙江绍兴 312000
【摘 要】目的：探讨葛根素对东莨菪碱致小鼠恐惧记忆障碍的作用及机制。方法：用电刺激建立恐惧记忆模型小鼠,用东莨菪碱建立恐惧记忆障碍模型，随机分成5组：空白对照组、模型组、葛根素低、中、高剂量组。ig给予葛根素300 mg?kg-1、450 mg?kg-1、600 mg?kg-1，正常组及模型组则给予等量的生理盐水，连续灌胃5 次，以葛根素半衰期为给药间隔时间。于末次给药结束后30 min除空白对照组腹腔注射生理盐水，其他各组注射东莨菪碱2 mg?kg-1，30 min后用明暗箱检测记忆能力，各组取4只小鼠处死并测脑组织中SOD和MDA的含量。各组剩下的小鼠再用上述方法连续给药5 次再测潜伏期及取脑测SOD和MDA含量。结果：与模型组比较，葛根素组小鼠进洞潜伏期明显延长;葛根素能提高小鼠脑组织内SOD含量以及降低MDA的含量。结论：葛根素可以改善恐惧记忆障碍小鼠的记忆能力，且以预防结合治疗性处理组效果更好。
【关键词】葛根素；东莨菪碱；恐惧记忆障碍；超氧化物歧化酶；丙二醛
【中图分类号】R285 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0421-02
Effects of Puerarin on fear memory deficits and the role of SOD and MDA in brain of mice induced by scopolamine
Gangyu Wan，Wei Ji，Wenlong Wei，Zhaona Xu，Xiangxiang Dai，Xinbo Zhang，Chaoyang Yu*
（Medical college of shaoxing，zhejiang shaoxing 312000）
【Abstract】Objective: To investigate the Effects of Puerarin on fear memory impairment and the role of SOD and MDA in brain of mice induced by scopolamine and its mechanism.Methods： Electrical stimulation established mouse model of fear memory，and fear memory impairment model established by scopolaminel,the rats were randomly divided into five groups：the blank control group，the model control group，puerarin high-does group(300mg?kg-1)，puerarin medium-dose group(450mg?kg-1)and puerarin low-dose group(600mg?kg-1) respectively.the high-does group,the mediun-does group and the low-does group was given with puerarin by intragastric administration for 5 times with half-life of the dosing interval,the blank control group and the model control group was given with normal saline by the same way. All the groups except the normal control group were given with 2mg?kg-1 scopolamine by intraperitoneal injection after 30 minutes at the end of the last administration ,and use dark and light box to check the memory ability after 30 minutes.Take four mice from each groups were sacrificed and measured the levels of SOD and MDA from brain tissue.Use the above method of continuous administration of 5 times , then to measure incubation period and the levels of SOD and MDA from brain tissue.Results：Compared with the model group, incubation period of puerarin group of mice was prolonged ; Puerarin can improve the levels of SOD and reduced the levels of MDA from the brain tissue of mice.conclusion：Puerarin can ameliorate the ability of memorizing of the fear memory impairment mice,and prevention combination with treatment group have better results.
【Key words】Puerarin;scopolamine;fear memory deficits;Superoxide Dismutase;Malondialdehyde
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种发生在老年期的以认知和记忆障碍为主的中枢神经系统退行性疾病，其认知和记忆障碍与海马结构萎缩和功能障碍密切相关，而海马的部分功能由“恐惧中枢”杏仁核的调节来实现。此外大量实验证明抗氧化剂对AD的发病有延缓和保护作用1。但是大多数合成的抗氧化剂并没有严格的毒理实验验证，所以人们更青睐天然的抗氧化剂。
葛根素是从中药葛根中提取的一种单体。属于黄酮类化合物，此外有研究2发现黄酮类化合物具有较强的清除自由基的能力，提高机体抗氧化应激能力。本实验对葛根素能否通过氧化应激途径来改善恐惧记忆障碍进行研究，从而为AD的治疗提供实验依据。
1 材料
1.1 动物 ICR清洁级雄性小鼠(3月龄，24±2g）75 只由浙江杭州医科大学实验动物中心提供[合格证号：SCXK（浙）2008-0033]。室温(20±2)℃,颗粒饲料喂养,自由饮水。
1.2 药物与试剂 纯度为98%的注射用葛根素（西安天丰生物科技有限公司，批号NF-20130924）；葛根素混悬液 （称适量注射用葛根素，加蒸馏水制成浓度为20mg/ml的葛根素混悬液供灌胃用，灌胃前须摇匀）；氢溴酸东莨菪碱(上海禾丰制药有限公司生产,批号H31021519)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒均为南京建成生物工程研究所提供；0.9%的生理盐水、无水酒精、蒸馏水、双蒸水、冰醋酸均为市售分析纯。
1.3 仪器 722型分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SC-2542低速台式离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；ZD-420电热恒温水槽(嘉兴市中新医疗仪器有限公司)；JA1003型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；小鼠ZH-DSX2型明暗箱（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）；研钵。
2 方法
2.1 恐惧记忆模型的建立 动物适应环境2 d，于第3 d进行足底板敏感性测试，筛选出敏感性好的小鼠，于第4 d让小鼠在穿梭箱中适应5 min，然后将小鼠放入明箱，测试小鼠进入暗箱的时间（主动回避反应潜伏期，其值<5 min，如果5 min内没有进入暗箱潜伏期记为300 s），等进入暗箱后给予0.5 mA的电刺激，小鼠则发生被动回避反应跑向明箱。每只小鼠一天训练2 次，持续一周，从而建立起恐惧记忆模型。再次剔除反应性过于迟钝的小鼠。
2.2 动物分组、给药与造模 小鼠按体重均衡及随机原则分组,分别为空白对照组、东莨菪碱模型组、葛根素300、450、600 mg?kg-1组,每组15只。东莨菪碱前给药的各组以葛根素半衰期38 min3为给药间隔时间连续灌胃5次。于末次给药结束后30min除空白对照组腹腔注射生理盐水，其他各组注射东莨菪碱2 mg?kg-1，30 min后用明暗箱检测记忆能力。检测结束后各组取4只小鼠处死并测定脑组织中SOD和MDA的含量。各组剩下的小鼠即东莨菪碱前后给药组，再以葛根素半衰期38 min为给药间隔时间，连续灌胃5 次。于末次给药结束后30 min后用明暗箱检测记忆能力。检测结束后各组取4 只小鼠处死并测定脑组织中SOD和MDA的含量。
2.3 小鼠明暗箱法 应用明暗箱装置，以小鼠主动回避反应为指标测定记忆能力。明箱用白炽灯光照亮，暗箱底部置铜栅可电击动物, 两箱之间有一小洞(7 cm*5 cm)相通供小鼠通过。测定时将小鼠置于明箱，利用小鼠趋暗性，记录小鼠四肢全部进入暗箱的时间，即为进洞潜伏期（主动回避反应潜伏期，其值<5 min，如果5 min内没有进入暗箱潜伏期记为300 s）。当小鼠进入暗箱后即刻通电(0.5mA4交流电) 电击动物，小鼠逃至明箱后取出。
2.4 采集样品及相关物质的测定 行为学测试结束后，立即脱颈处死，迅速在冰上剥离大脑，称重，加入脑重的9倍量生理盐水匀浆，在3500 r/min，4℃条件下离心10 min，取上清置于－20℃冻存。按试剂盒说明书测定脑匀浆上清液中SOD和MDA含量。
2.5 数据统计处理 实验数据均以均数±标准差(x±S)表示；采用Prism5.0 Demo画图软件进行绘图，采用SPSS17.0统计软件处理，多个组比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性；P>0.05为差异不具有显著性。
3 结果
3.1 对明暗箱试验中潜伏期的影响 与对照组比较，东莨菪碱模型组小鼠的潜伏期明显降低且有显著差异(P<0.05)，与模型组比较，东莨菪碱前低中剂量给药组和东莨菪碱前后中剂量给药组潜伏期明显延长且有显著差异(P<0.05)，东莨菪碱前高剂量给药组和东莨菪碱前后低、高剂量给药组潜伏期有所延长但与模型组比较无统计学差异（P>0.05）。结果见表1和图2。
1,3与空白对照组比较P<0.05,2,4与东莨菪碱模型组比较P<0.051,3
4 讨论
随着全球人口老龄化，AD的发病率日趋上升，AD其最终影响生活质量的关键因素是学习记忆和认知功能的障碍，而现在已经证实胆碱能系统的活性与人的学习记忆和认知功能密切相关。故脑内胆碱能神经元的退化是导致AD的重要原因之一。而胆碱能受体阻滞剂东莨菪碱建立动物学习记忆障碍模型是常用的观察药物对学习记忆障碍改善的试验方法5-6。本试验用
东莨菪碱建立恐惧记忆障碍模型，用明暗箱法观察不同剂量葛根素对恐惧记忆模型小鼠恐惧记忆的影响。行为学结果显示葛根素450 mg?kg-1具有改善东莨菪碱所致恐惧记忆障碍的作用。
SOD是体内清除氧自由基的重要酶之一,能够清除氧自由基而对机体细胞产生保护作用；MDA是机体发生脂质过氧化作用的产物,氧自由基可通过过氧化作用引起细胞损伤。徐晓虹7研究发现葛根素可以通过提高SOD活性同时降低MDA活性来改善D-半乳糖致衰老小鼠抗氧化能力；王丽娟等8研究发现葛根素是通过减少SOD的消耗来提高抗氧化酶的活性从而改善U14宫颈癌小鼠的氧化功能；杨东旭等9对B-淀粉样AD 模型小鼠学习记忆能力的研究发现葛根素明显改善模型小鼠的学习记忆，使小鼠脑及血中的SOD 增多、MDA 减少；此外研究还发现10-11葛根素还可以通过增强SOD、GSH-PX活力和GSH含量,降低MDA含量来拮抗醉酒小鼠体内的氧化反应和缓解过氧化氢引起的大鼠心肌细胞氧化应激损伤；能够抑制脂质过氧化物所致的衰老退行性变12；本实验发现：葛根素450 mg?kg-1无论是预防性处理组还是预防结合治疗性处理组，均不同程度的增加SOD含量和减少MDA含量。相比之下，预防结合治疗性葛根素450 mg?kg-1处理组升高脑内SOD含量和降低MDA含量的效果更佳。
陈炜[13]等在葛根素对阿尔茨海默症的治疗作用及机制初探的研究中发现葛根素在治疗AD患者中能降低脂质过氧化物酶的含量、增加SOD活性，本实验进一步验证了葛根素可以提高类似AD小鼠的抗氧化能力，故可为临床通过提高机体抗氧化能力途径治疗阿尔茨海默症提供实验依据。
葛根为豆科植物野葛的干燥根，味甘辛，性凉。祖国医学认为，葛根归脾、胃经，具有解表退热、生津止渴、升阳止泻、透疹发表等功效，可用于治疗外感发热头痛、津液匮乏、消渴、发疹不透、热痢、高血压头晕、颈项强痛等病证。临床上常用于治疗高血压、冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑缺血、脑淤血、脑梗死等心脑血管病，但它对东莨菪碱诱发的恐惧记忆障碍是否有改善作用还缺乏研究。通过本实验可发现，葛根素能明显改善东莨菪碱诱发的小鼠恐惧记忆障碍且预防结合治疗性葛根素450 mg?kg-1效果更佳，同时这一改善作用可能是通过抗氧化途径实现。
参考文献:
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基金项目:
2013年浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划项目(编号2013R426026）
作者简介:
万刚玉，女，(1993-)，浙江绍兴，本科，研究方向：神经药理研究.
通讯作者：
俞朝阳，绍兴文理学院医学院药理学副教授，研究方向：从事神经药理研究。
论文作者:万刚玉,季微,魏文龙,徐朝娜,戴翔翔,张信波,俞
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/10
标签：小鼠论文; 莨菪论文; 葛根素论文; 记忆论文; 潜伏期论文; 模型论文; 恐惧论文; 《中医学报》2015年8月论文;