韦德华[1]2016年在《p53、线粒体基因多态性与二甲双胍辅助卵巢癌化疗增敏关系研究》文中研究说明研究背景卵巢癌因其早期症状不明显、不易发现,造成临床上发现时多为中晚期,并且在化疗过程中一线化疗药物紫杉醇联合卡铂产生的继发耐药时常发生,使得卵巢癌患者的5年生存期较短。在一线化疗药物耐药的情况下,如何有效的预测、减少耐药增敏化疗敏感性成为亟待解决的问题。如何精准的判断个体对一线化疗药物的原发和继发耐药性,为不同的患者提供个性化的治疗方案,增加化疗的敏感性,提高治疗的有效性,研究人员进行了大量的工作。上皮性卵巢癌在卵巢癌中占比超过50%,但由于上皮性卵巢癌的发生发展是一个多基因参与、多因素作用并经过较长时间形成的复杂的过程,因此,目前的研究成果并没有形成很好的理论去阐释卵巢癌的发病、发展和耐药现象。在研究中,越来越多的证据表明,细胞凋亡的改变与铂类药物耐药密切相关。而在细胞凋亡过程中,p53和线粒体起着重要的作用。现有大量的研究表明p53基因改变与铂类药物耐药密切相关,线粒体是p53调控对象和细胞中能量代谢的重要参与者,D-loop区是线粒体最易发生突变的区域,但是将p53和线粒体D-loop区的基因突变与卵巢癌发生、发展、耐药、药物增敏及预后之间关系的研究仍较少。本研究拟对p53基因和线粒体基因组中的D-loop区基因多态性与上皮性卵巢癌发生、发展、耐药、药物增敏及预后之间关系进行研究。在上皮性卵巢癌化疗增敏药物的选择上,虽然许多辅助增强化疗效果的药物被发现,但是大多临床效果仍待时间检验。本研究选取了虽然对卵巢癌化疗增敏效果有争议但在临床上安全使用20余年的廉价、安全药物二甲双胍作为增敏剂进行研究。许多回顾性研究和体外实验研究发现,二甲双胍对乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞株的细胞生长有抑制,但到临床统计中也有学者得出截然相反的结论。这种情况的出现可能与标本的纳入标准及数量有关,也可能与人种、地域差异、细胞株的选择有关。因此,有必要针对不同地域、不同的个体在细胞水平上研究二甲双胍是否可以起到对上皮性卵巢癌化疗的增敏作用,为临床提供理论依据。在实验方案的设计中,考虑卵巢特别是癌变卵巢组织往往取样困难,且几乎不可能在体内二次重复取样;因此,先利用医院保存的上皮性卵巢癌和非癌患者卵巢组织标本石蜡包埋切片作为研究对象,通过扩增、测序的方法对P53和线粒体D-loop区基因多态性和突变进行分析;在此基础上收集临床病患中上皮性卵巢癌和非癌患者卵巢组织、组织石蜡包埋切片、病患外周血中游离DNA,研究叁者中P53和线粒体D-loop区基因多态性差异。在实验方案设计中,考虑到常规研究中常常采用各种商品化细胞株,其生物学特性与在体内的原代细胞相比发生了较大的变化;因此,本研究将收集到的新鲜组织进行原代培养及有限传代并进行人工耐药驯化,观察不同基因突变耐药情况,以期有助于提高临床上对上皮性卵巢癌患者个性化治疗和预后评估。利用第叁代传代细胞进行二甲双胍化疗增敏效果与p53、线粒体基因突变关系的研究。并在此基础上,采用第叁代传代细胞注释裸鼠建立移植瘤,观察二甲双胍对不同个体来源移植瘤的影响,为进一步了解P53和线粒体D-loop区基因多态性与上皮性卵巢癌发生、发展、预后的关系提供新的理论依据,为二甲双胍在不同基因多态性上皮性卵巢癌病患中应用提供参考。第一部分p53、线粒体DNA多态性与卵巢癌的关系目的通过对医院临床资料完整明确的河南地区非癌患者卵巢组织和上皮性卵巢癌病人癌变的卵巢组织中p53、D-loop DNA的突变和多态性进行比较,依据测序结果结合临床上继发耐药情况,研究河南地区人群中p53、D-loop的多态性、突变和上皮性卵巢癌发生、耐药的关系,获得潜在的上皮性卵巢癌检测指标和易耐药检测指标。通过对病患外周血、传代细胞、卵巢组织及切片中p53、线粒体基因差异研究,探讨外周血中游离DNA检测卵巢癌及评估耐药性的可能,并对组织切片与实际新鲜组织多态性的差异比较,为临床和后续试验提供依据和借鉴。方法1.卵巢组织切片中p53、线粒体基因的差异研究选取郑州大学第一附属医院(以下简称“郑大一附院”)和濮阳市人民医院收治的在河南生活超过二十年的病患卵巢组织切片作为研究对象。其中60份上皮性卵巢癌组织石蜡标本为首次肿瘤细胞减灭术中收集到的,对照组61例卵巢癌阴性标本为非癌患者卵巢癌组织切片。1.1选取相同厚度的石蜡切片并称量,获取等量石蜡包埋卵巢组织。对这些组织切片中的DNA进行提取、鉴定,比较石蜡包埋组织存放时间对其中DNA提取的质和量的影响。1.2为实现大规模PCR鉴定、测序需要,将传统的PCR条件优化、扩增、鉴定、回收等实验流程优化为以荧光染料进行实时监测的荧光定量PCR,减少操作步骤,避免出错和污染。1.3利用DNAMAN软件将上皮性卵巢癌组织的PCR产物序列、非癌患者卵巢组织标本的PCR产物序列进行比对,如果上皮性卵巢癌组织与非癌患者卵巢组织中的核苷酸序列均为多样化,则为多态性;如果仅表现为上皮性卵巢癌组织的核苷酸序列与非癌患者组织标本不一致,则为突变。2.外周血、传代细胞、卵巢组织及切片中p53、线粒体基因差异研究2.1原代培养与传代:采用红细胞裂解液裂解红细胞,随后用0.3%胶原蛋白酶或联合胰酶在37℃的水浴中反应15min-30min,然后用含10%胎牛血清的1640培养基重悬细胞并加入细胞瓶中。利用成纤维细胞能迅速贴壁的特点,通过体外培养贴壁时间的差别将组织中的上皮细胞和成纤维细胞进行分离。选取适用于上皮细胞培养的低血清培养M199(SLM)作为后续培养的培养基,并在培养基中添加卵巢上皮细胞促生长因子和防止细菌生长的青链霉素双抗。在细胞长至铺满底部70%左右时用胶原蛋白酶消化并进行传代。2.2基因多态性研究:将患者对外周血、第叁代卵巢上皮细胞、新鲜卵巢组织及组织切片四组样本分别提取DNA,采用染料法荧光定量PCR扩增扩增并鉴定后送上海生工测序,测序结果用DNAMAN软件比对。2.2.1通过上皮性卵巢癌患者与非癌患者术前外周血游离DNA的对比,研究外周血游离DNA与上皮性卵巢癌的关系。2.2.2通过比较每个患者的外周血游离DNA、新鲜卵巢组织及卵巢组织切片中基因多态性的差异,研究外周血游离DNA检测代替组织切片检测的可能性以及评估两者和人体卵巢组织基因多态性、检测灵敏度的差异。2.2.3通过对第叁代传代细胞和原组织细胞基因多态性的比较,了解细胞传代至第叁代时相关基因位点的变化情况。结果1.卵巢组织切片中p53、线粒体基因的差异对121份临床卵巢组织切片进行DNA提取,采用实时荧光定量PCR结合熔解曲线来优化并监控p53和D-loop区基因的PCR。1.1所提取DNA OD260/OD280大都在1.7-2.0之间,且提取量随石蜡包埋组织存放时间的增加而减少。非癌患者组织切片中DNA含量和肿瘤患者组织切片中DNA含量无明显差别。1.2经过多轮的实验优化、验证,确定了p53基因和线粒体DNA的D-loop区基因不同片段在20μL荧光定量PCR体系中扩增的最佳条件。1.3通过测序发现,与非癌患者卵巢p53基因相比,p53基因发现突变位点9个,多态性位点127个。与非癌患者卵巢D-loop基因相比,D-loop区基因发现突变位点11个,多态性位点165个。p53的7号外显子44位密码子由C突变为A可检出阳性标本中的41份,检出率为68.3%;D-loop区73位密码子由A突变为G可检出阳性标本52例,检出率为86.7%,两者联合检测可实现对60份阳性标本的全检出。对于60例上皮性卵巢癌患者中治疗后1年内复发的患者标本进行序列对比、统计、分析,结果显示将Exon4-72G和D-loop309T作为复发标本检测指标进行检测的话,检出率为17/21。如果将Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A联合检测,复发标本检出率21/21,但非复发标本有5份判为阳性。2.外周血、传代细胞、卵巢组织及组织切片中p53、线粒体基因差异2.1非癌患者细胞第一代细胞长满培养瓶底部70%面积平均用时21天,肿瘤细胞平均用时18天。从第二代传至第叁代时,非癌患者卵巢细胞铺满培养瓶底部70%面积平均用时15天,肿瘤细胞平均用时12天。采用DAB染色对上述第叁代细胞进行了上皮细胞特有表面抗原CK19鉴定,结果显示均为阳性。30例卵巢癌患者中17例卵巢上皮细胞体外培养成功并传至第五代,15例非癌患者卵巢细胞成功培养7例并传至第五代。2.2结果显示:2.2.1非癌患者术前外周血游离DNA含量为7.7±2.6ng/mL,在17份卵巢癌中,2例I期患者含量为26.7±5.4ng/mL;6例II期患者为151±29ng/mL;9例III到IV期患者为234±32ng/mL。上皮性卵巢癌患者外周血中游离DNA含量较非癌患者升高明显。2.2.2新鲜卵巢组织及其石蜡包埋切片对p53基因、D-loop区基因突变位点和多态性位点检测效率一致。外周血中游离DNA检出效率稍差,与前两者相比,有4个p53基因多态性位点、2个D-loop区突变位点及11个D-loop区多态性位点未被检测。但对于p53的7号外显子44位密码子由C突变为A和D-loop区73位密码子由A突变为G两者联合检测,仍可实现对17份阳性标本的全检出。显示出p53的7号外显子44位密码子由C突变为A和D-loop区73位密码子由A突变为G两者联合作为外周血游离DNA检测卵巢癌的潜在可能。2.2.3第叁代细胞较原卵巢组织新增p53基因突变位点2个,多态性位点11个,新增D-loop区基因多态性位点4个,提示传代造成了基因的改变。但发现的潜在的上皮性卵巢癌p53基因、线粒体D-loop区基因多态性检测指标和易耐药复发的检测指标位点未发生改变,可作为后续细胞水平研究的检测指标。结论选取临床确诊的90例上皮性卵巢癌患者和76例非癌患者的卵巢组织标本作为研究对象,通过对其p53基因、线粒体D-loop区基因的测序,发现了潜在的上皮性卵巢癌p53基因、线粒体D-loop区基因多态性检测指标和易耐药复发的检测指标。对其中的45例病患的卵巢组织、组织切片、外周血及传代卵巢上皮细胞标本显示进行进一步研发,发现上皮性卵巢癌患者外周血中游离DNA含量较非癌患者升高明显,石蜡包埋切片和外周血中游离DNA可替代新鲜卵巢组织作为基因多态性检测对象。传代虽然会造成基因的多态性变化,但发现的潜在的上皮性卵巢癌p53基因、线粒体D-loop区基因多态性检测指标和易耐药复发的检测指标位点未发生改变,可作为后续细胞水平研究的检测指标。第二部分p53、线粒体基因多态性与二甲双胍在卵巢癌化疗中增敏关系目的利用卵巢细胞体外传代第叁代细胞进行耐药驯化,模拟多次化疗耐药的现象,进而观察二甲双胍在紫杉醇、卡铂治疗中的增敏作用。通过检测p53、D-loop基因多态性,研究p53、D-loop基因多态性与卵巢癌耐药、二甲双胍增敏的关系。在动物模型中也采用患者卵巢组织细胞传代第叁代细胞建模,并采用非癌患者体血药浓度用药,模拟人在正常用药下二甲双胍对化疗的增敏作用,观察p53、D-loop基因多态性对增敏效果的影响。方法1.二甲双胍在传代卵巢癌细胞中的增敏作用选第一部分第二章成功传代5次的17株癌变卵巢组织的第叁代传代细胞作为研究对象,并用SKOV3细胞株作为阳性对照。将每株细胞在稀释为5×105/mL和1×105/mL两个浓度在96孔细胞培养板上各铺48孔。5×105/mL的48孔细胞进行耐药驯化,1×105/mL作为未驯化对照。耐药驯化采用短时间间歇式驯化,并按照耐药驯化所用紫杉醇(0、0.6、1.2μg/mL)、卡铂(0、10、25μg/mL)、二甲双胍(0、0.5、2.5μg/mL)不同水平的组合采用叁因素叁水平正交实验的方法分为9个组别。在叁次驯化后,仍按正交实验组别分别加入驯化时所用药物并培养72h,通过CCK8显色观察对实验组细胞的抑制率,研究二甲双胍在卵巢癌不同化疗中的增敏作用。2.二甲双胍在卵巢癌细胞裸鼠移植瘤中的增敏作用用第一部分第二章成功传代5次的17例癌变卵巢组织的第叁代传代细胞悬液接种于裸鼠皮下,构建卵巢癌裸鼠移植瘤,比较卡铂、紫杉醇联合用药与二甲双胍、卡铂、紫杉醇联合用药效果的差别。以移植瘤直径不小于6mm为建模成功的标准,将各株细胞中建模成功的裸鼠分别随机分为五组:第一组采用生理盐水作为对照;第二组作为低剂量组:二甲双胍400μg/只、紫杉醇80μg/只、卡铂200μg/只;第叁组为高剂量组:二甲双胍400μg/只、紫杉醇400μg/只、卡铂1000μg/只;第四组为低剂量对照组:紫杉醇80μg/只、卡铂200μg/只;第五组为高剂量对照组:紫杉醇400μg/只、卡铂1000μg/只。实验结束时对小鼠进行解剖,根据对照组和实验组移植瘤体积的大小比值进行抑制率计算。结果:1.二甲双胍在不同传代卵巢癌细胞中的增敏作用1.1对17株细胞进行耐药驯化,二甲双胍具有明显增敏作用的细胞12株。这12株细胞中9株有化疗耐药倾向。1.2利用Exon6-198G+Exon8-67A+D-loop309T+D-loop446A可在12株增敏作用的细胞中检测出11株,检出率为11/12。利用Exon4-72G+D-loop309T可在12株增敏作用的细胞中检测出8株,均为耐药株,耐药菌株检测率8/9。1.3二甲双胍单独使用,17株肿瘤细胞和7株非癌患者细胞均在72h出现2.72-3.56%不等的抑制,在120h出现3.24-6.83%不等的抑制。二甲双胍对细胞的抑制存在时间依赖,但不随二甲双胍的量改变,提示在这两个人体浓度值范围内,二甲双胍对细胞的抑制效果一致,但长期服用二甲双胍效果会好些。2.二甲双胍在卵巢癌细胞裸鼠移植瘤中的增敏作用17株细胞建模成功13株,最终成瘤大小和数量符合实验要求的9株。裸鼠实验表明,9组中包含细胞培养易耐药细胞5个(S9、S27、S29、S1、S17),其中4个(S27、S29、S1、S17)对铂类有耐药倾向,2个(S9、S27)对紫杉醇有耐药倾向,1个(S9)铂类、紫杉醇联合耐药倾向),紫杉醇、卡铂敏感细胞4个。对于紫杉醇、卡铂联合用药量高低进行比较,无论是否耐药,均存在明显的剂量正相关性。对于各剂量组中添加二甲双胍的对照来看,S11、S6、S19、S26四株对紫杉醇、卡铂敏感细胞中S19、S26表现出对二甲双胍不敏感。其他细胞株的裸鼠实验表明,低剂量的紫杉醇、卡铂在加入口服二甲双胍后对其细胞抑制率增高明显。与细胞水平实验结果一致。结论二甲双胍对卵巢癌耐药细胞具有一定的逆转耐药作用,p53的E7-44A和D-loop区73G两者联合检测出的卵巢癌阳性细胞中具有Exon4-72G、D-loop309T的多态性的容易复发,且对二甲双胍更为敏感,对于Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A基因型的卵巢癌细胞可使用二甲双胍进行增敏。
冯同富[2]2008年在《卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究》文中认为卵巢上皮癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。临床上,以铂类为基础的联合化疗是其最重要和最主要的治疗方法。尽管在化疗的最初阶段,卵巢上皮癌对抗癌药物表现出较好的敏感性,但是随着化疗的进行其逐渐获得多药耐药性,因而其五年生存率一直徘徊在30—50%。为了更好的认识卵巢癌的多药耐药机制,我们用卡铂对卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3进行间断、大剂量冲击,建立了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CB,并且从蛋白和基因两个水平筛选、鉴定了两种细胞间的差异分子。第一部分:卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证研究目的:对铂类耐药细胞株SKOV3/CB进行相关生物学指标的检测验证。方法:MTT法检测SKOV3/CB对卡铂的耐药指数及对CTX、5-FU、ADM、VP-16、泰素和DDP的交叉耐药性;采用21天细胞计数法绘制细胞的生长曲线并计算其倍增时间;流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布。结果:SKOV3/CB对卡铂的RI为3.09,对CTX、VP-16、泰素和DDP有不同程度的耐药性,但对5-FU和ADM仍然敏感;同SKOV3相比其凋亡率和S期细胞明显增加,但生长速度却显着降低。结论:SKOV3/CB表现出典型的多药耐药特征,该耐药模型十分稳定达到了后续的蛋白和基因实验的实验要求。第二部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的蛋白表达差异,并进行相关蛋白的筛选和鉴定。方法:提取卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3的总蛋白,用蛋白二维液相分离色谱技术(ProtemeLab~(TM)PF-2D)总蛋白进行分级分离,然后用其自带的Proteovue和Deltavue分析软件进行两种细胞间差异蛋白的筛选;用电喷雾离子化串联质谱(ESI-MS/MS)结合数据库比对进行差异蛋白的鉴定。结果:共分离筛选出差异蛋白54个,其中SKOV3/CB表达上调的34个,SKOV3表达上调的20个。鉴定出SKOV3/CB比SKOV3表达上调的差异蛋白15个,即人假想镁离子转运体(humanputative magnesium transporter protein,HPT)、人亮氨酸拉链样蛋白(Leucinezipper-like protein)、超氧化物歧化酶-1(Superoxide dismutase,SOD-1)、硫氧还原蛋白(Thioredoxin,Trx)、Immunoglobulin heavy chain variable region、SMYD2、周期蛋白依赖激酶6抑制因子(cyclin-dependent kinase 6 inhibitor)、MYL9(Myosinregulatory light polypeptide 9)、垂体腺苷酸环化酶促多肽(pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide,PACAP)、stanniocalcin homolog、G蛋白信号通路的调节因子(human regulator of G-protein signalling,RGS)、T cell receptor betachain、TADAl protein和AX887247 NID。这些蛋白涉及离子转运、信号转导、氧化还原、增殖分化、免疫、甲基化、周期和凋亡调控等多方面。结论:PF-2D结合ESI-MS/MS是一种进行能够差异蛋白筛选、鉴定的有效方法。鉴定出的蛋白通过多种复杂机制介导了卵巢癌对铂类的耐药性的产生,这些蛋白有可能成为疗效预测分子或新的治疗靶标。第叁部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的基因表达差异,并进行相关基因的筛选和鉴定。方法:采用人类全基因组表达谱芯片对卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3进行差异基因的筛选和分析;用半定量逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)对芯片结果进行核对验证。结果:共分离筛选出差异基因3506个,SKOV3/CB比SKOV3上调的差异基因共有1712个,其中上调10倍以上的共有163个,SKOV3比SKOV3/CB上调的差异基因共有1794个,其中上调10倍以上的共有70个。SKOV3/CB比SKOV3上调10倍以上的6个差异基因,即ANXA6、UGDH、ZNF198、ERCC5、TWIST2和BIRC3经半定量RT-PCR验证,表明上述6个基因在耐药细胞株中的表达的确高于敏感细胞株,证明基因芯片的结果是可信的。结论:基因芯片是分析肿瘤差异基因的一种高通量的强有力工具。卵巢癌的多药耐药是一个多种基因参与的复杂过程。
苏姗[3]2017年在《PARP-1和EMT在卵巢癌中的生物学功能及意义》文中提出研究背景妇科恶性肿瘤中,卵巢癌的发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌,是女性生殖系统第叁大恶性肿瘤,但其死亡率却居第一位。当卵巢癌患者以腹水或盆腔包块就诊时,大多数已经是临床晚期。卵巢癌减灭术合并铂类、紫杉醇为主的联合化疗是当今治疗卵巢肿瘤的主要临床手段。目前,卵巢癌的复发及化疗耐药成为困扰临床的主要障碍。卵巢癌患者对铂类为主的联合化疗初次敏感性达85%,但大多数患者最终因化疗耐药而导致复发。卵巢癌化疗耐药尤其是铂类耐药的发生机制及逆转途径已经成为目前重要的研究课题。因此,降低患者复发率,逆转化疗耐药,卵巢癌化疗耐药相关机制的研究成为目前的首要任务。近年,肿瘤化疗耐药的研究已经取得重要进展,耐药机制主要包括DNA损伤修复能力的增强,耐药蛋白的过度表达和细胞内一些蛋白酶的改变引起细胞解毒功能增强等。目前肿瘤细胞的耐药机制主要归因于DNA损伤修复能力的增强。聚酰苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly-ADPribose polymerase-1,PARP-1)是存在于绝大多数真核细胞的细胞核中的蛋白质翻译后修饰酶,是PARP家族中在体内含量最多也最具特异性的成员。PARP-1位于染色体lq41～42区,包含有23个外显子。PARP-1蛋白的分子量为116KDa,包含1014个氨基酸。通过对细胞内众多蛋白质和酶进行翻译后修饰,从而调节细胞内一系列分子事件。在DNA复制、DNA的损伤修复、控制细胞的增殖分化凋亡、维持基因组的稳定等方面,PARP-1发挥着重要作用。静息状态下,PARP-1在细胞内以非活性状态存在。PARP-1对DNA的损伤异常敏感,当出现辐射、化疗药物等致使DNA损伤后,损伤的DNA游离断端将会激活PARP-1,活化的PARP-1检测到游离的DMA末端并与之结合,迅速募集与DNA损伤修复相关的蛋白到目标位点,进一步激活并催化蛋白受体聚ADP核糖基化,ADP核糖基化与组蛋白H1、H2B结合后,核小体的正常结构受到影响,进一步引起染色体结构松弛,损伤部位易于结合DNA修复酶,从而参与断链DNA的损伤修复。然而当存在DNA广泛损伤时,PARP-1可促进细胞凋亡。研究显示,沉默PARP-1基因或应用PARP抑制剂能有效提高卵巢癌耐药细胞对顺铂药物的化疗敏感性。在上皮来源的恶性肿瘤细胞侵袭转移的过程中,上皮间质转化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)发挥了重要作用。EMT是具有极性的上皮细胞转换成为间质细胞并使其发生侵袭转移的过程,在肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用。EMT不仅在肿瘤的侵袭转移过程中发挥了重要作用,并且与肿瘤化疗耐药也可能存在一定的相关性。肿瘤细胞的EMT主要表现为上皮细胞的极性丧失及间质细胞具备迁移浸润能力。它降低了细胞之间的黏附力、增加了细胞迁移和浸润能力,不仅参与胚胎发育、组织重建、慢性炎症等过程,也是肿瘤浸润转移和多种纤维化疾病的重要机制之一。正常组织的上皮细胞整齐排列,为具有极性的单细胞层,细胞之间黏附紧密而规律,整齐地附着于基底部的细胞外基质上。间质细胞形态不规则,没有极性且细胞间黏附松散,由于细胞间黏附性小且无附着部位,因此具有迁移浸润能力。肿瘤细胞可通过EMT获得间质细胞表型,从而实现对周围组织的侵袭浸润。肿瘤细胞EMT过程中伴有:1.细胞形态学改变,上皮细胞失去极性和细胞间黏附力,变成不规则、松散排列的间质细胞;2.细胞表面标记分子表达改变:如上皮细胞标记蛋白E-cadherin、层连蛋白等表达下调;间质细胞标记蛋白如vimentin、纤维蛋白和SMA等表达上调;同时活化Snail、Twist、Slug等转录调控因子。这些改变导致上皮细胞失去极性和细胞间黏附力,从而导致细胞内肌动蛋白骨架重组。3.细胞生物学行为改变:上皮细胞由静止状态变为迁移浸润能力较强的间质细胞,并获得侵袭、抗凋亡能力的间质表型。有研究发现EMT减低了非小细胞肺癌组织对顺铂和紫杉醇的敏感性,由此推断参与EMT的相关因子及信号通路的激活或失调在肿瘤侵袭转移和化疗耐药的过程中起协同作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MARK)通路是 EMT过程中的重要信号转导通路之一,参与调节细胞的生长、增殖、分化及恶性转化等许多生物学效应。MARKs家族包括许多成员,其中在细胞信号转导通路中发挥重要作用的有3种:JNK、p38、ERK。既往研究显示,PARP-1抑制剂PJ34可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,提高C13*细胞对顺铂化疗药物的敏感性。磷酸化的ERK2激活PARP-1的途径不同于DNA受损引起的PARP-1活化,由此推断ERK2可调控PARP-1表达。由于激活PARP-1与ERK1/2具有相似的信号转导途径,有研究证实在没有DNA损伤的情况下,PARP-1可被磷酸化的ERK1/2激活。PARP-1在没有DNA损伤的情况下被pERK2激活是由于ERK2的磷酸化,而不依赖激酶的活性。pERK2直接作用于某些ERK2的底物使其活化而不依赖激酶的活性。由此我们推断,MAPK通路因子与PARP-1共同参与EMT,从而影响肿瘤细胞的化疗耐药。间质细胞标记蛋白波形蛋白(vimentin)和上皮细胞标记蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)被认为是EMT过程中关键的标志性分子。Vimentin作为真核生物细胞中主要的中间纤维,与微管、微丝共同构成细胞支架而维持细胞的完整性。除了维持细胞的完整性以外,vimentin的主要功能还包括:①参与细胞侵袭和转移;②参与细胞内外信号的传导;③参与细胞凋亡的调节;④参与基因组DNA表达的调控。其表达与肿瘤浸润转移呈正相关,表达越高,愈后越差。作为EMT、EndoMT的标志性分子,vimentin在肿瘤细胞中的表达都较正常组织高很多。Vimentin在EMT过程中作为重要的上游调节因子发挥关键作用。其表达与肿瘤浸润转移呈正相关,表达越高,愈后越差。作为上皮细胞连接的黏附剂,E-cadherin表达减少或沉默表达可致上皮细胞离散、失去极性,这提示E-cadherin与肿瘤的侵袭转移呈负相关,其可作为肿瘤的抑制因子,E-cadherin的表达减少或沉默表达与EMT的进展存在密切关系。E-cadherin的表达下调与Vimentin的表达升高相关,Vimentin的表达会干扰E-cadherin介导的细胞黏附。在早期卵巢癌中,E-cadherin的表达增加而不是减少。但是,一旦卵巢癌发生转移,转移腹水细胞显示,其E-cadherin的表达比原发肿瘤细胞中的表达显着减少。卵巢癌化疗耐药的过程中,PARP-1是否通过与EMT共同作用,影响其化疗耐药,以及对卵巢癌化疗耐药细胞生长、侵袭的作用,本文做了进一步研究。第一部分PARP-1抑制剂PJ34、ERK抑制剂U0126对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3生长、侵袭的作用实验目的:通过卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV-3中分别加入PARP-1抑制剂PJ34和ERK1/2抑制剂U0126,检测细胞的侵袭能力,及E-cadherin和vimentin的表达,以探讨在卵巢癌顺铂耐药细胞中PJ34、U0126与EMT的相互作用机制及对卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3生长、侵袭的作用。实验方法:PJ34、U0126干扰卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3。实时荧光定量PCR、Western blotting法检测处理后细胞中E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表达情况。MTT法检测PJ34、U0126在SKOV-3细胞增殖中的作用、Transwell侵袭实验检测PJ34、U0126在SKOV-3细胞迁移中的作用。实验结果:PJ34、U0126明显抑制卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3的生长增殖,且PJ34联合U0126的作用效果较单用PJ34明显。PJ34、U0126可提高SKOV-3细胞中E-cadherin的表达,vimentin则反之,从而进一步抑制卵巢癌耐药细胞EMT的进展。U0126可增强PJ34对SKOV-3细胞生长侵袭的抑制作用。实验结论:1.PARP-1和ERK1/2联合通过EMT途径影响卵巢癌耐药细胞的生物学行为。2.PARP-1抑制剂和ERK1/2抑制剂可作为卵巢癌术后愈后的临床数据分析。3.PARP-1抑制剂和ERK1/2抑制剂的低毒性、高特异性的剂量还需进一步研究。4.PARP-1抑制剂联合ERK1/2抑制剂可作为卵巢癌靶向治疗的新靶点。第二部分PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮细胞SKOV-3中的表达及意义实验目的:通过检测PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮细胞SKOV-3,卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3中的mRNA的水平和蛋白表达情况,探索卵巢癌顺铂耐药与PARP-1及EMT的相关性。实验方法:实时荧光定量PCR、Western Blotting法检测卵巢癌上皮细胞,卵巢癌顺铂耐药细胞中PARP-1、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表达情况。实验结果:PARP-1、vimentin在卵巢癌顺铂耐药细胞SKOV-3阳性表达率高于卵巢癌上皮细胞SKOV-3,而E-cadherin则相反,差异均具有统计学显着性(P<0.05)。E-cadherin表达与PARP-1表达呈负相关(P<0.05),vimentin表达与PARP-1表达呈正相关(P<0.05)。实验结论:1.PARP-1,EMT可影响卵巢癌细胞对铂类药物的化疗耐药。2.PARP-1可通过影响EMT中的E-cadherin和vimentin的表达进而影响卵巢癌细胞对顺铂药物的化疗耐药。3.是否还有其他因子与PARP-1共同影响E-cadherin和vimentin的表达,有待于进一步研究。
李状[4]2012年在《二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究》文中提出第一章卵巢癌多药耐药的研究进展(文献综述)卵巢恶性肿瘤是女性生殖器叁大恶性肿瘤之一。卵巢隐匿于盆腔的深部,早期病变时不易被发现,一旦出现症状时大多属于晚期,治疗后容易复发,死亡率亦一直位居妇科恶性肿瘤之首。目前卵巢癌的治疗目的是早期争取治愈、晚期控制复发、延长生存期及提高患者生活质量。治疗原则是以手术为主,联合化疗及放疗的综合治疗。大多数的情况下,手术是很难将卵巢癌的转移灶彻底的切除干净。对于那些残留的细小的转移和种植结节.都需要化学药物来进行治疗。因此,化疗在卵巢癌治疗的过程中具有极其重大的意义。晚期卵巢癌的治疗方法主要以肿瘤细胞减灭术及术后辅助化疗为主。但化疗失败常会导致卵巢癌的复发,其主要原因在于肿瘤细胞产生的多药耐药(multidrug resistance,MDR)。以顺铂为主的联合化疗对卵巢癌的有效率达40%-60%,由于疾病进展和机体对化疗产生耐药,晚期卵巢癌患者的5年生存率低于20%。所以,多药耐药是肿瘤化疗失败的主要因素之一。因此,肿瘤产生耐药机制的研究以及在临床上预防耐药、对抗耐药并尝试逆转耐药就成为了当前卵巢癌治疗中的热点和难点,成为提高卵巢癌的治疗效果及改善卵巢癌患者生存的重要目标之一。第二章卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义目的探讨卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因(DHFR)(?)的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR法测定80例卵巢癌组织、50例良性卵巢组织及30例正常卵巢组织中的DHFR mRNA表达情况,分析其与卵巢癌临床病理及多药耐药的相关性。结果(1)DHFR mRNA表达量在止常卵巢,良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中分别为0.584±0.234,0.895±0.783和0.197±0.412,相比较差异有统计学意义(P<0.001,P=0.027,P 陈志敏[5]2016年在《MACC1与卵巢癌患者预后及其顺铂耐药性关系的分子机制研究》文中指出卵巢癌是妇科领域比较常见的恶性肿瘤,也是死亡率较高的妇科肿瘤之一。有资料表明,中国卵巢癌的发病率为十万分之五,且呈上升趋势。随着新的高效低毒化疗药物的临床应用,卵巢癌预后有所改善,但其5年生存率仍徘徊在50%左右。且其复发率较高,约为80%,在治疗起始后的3年内极容易复发,预后较差。结肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1,MACC1)是一种和肿瘤转移密切相关的基因,能促进结肠癌细胞发生增殖侵袭,并促使肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)诱导下结肠癌细胞的扩散转移的发生,是HGF/C-met(c-metprotoncogene)信号通路中met基因的关键调节因子。多项研究证实,在胃癌、肝癌和胰腺癌等多种恶性肿瘤组织中均可检测到高表达的HGF和C-met,其过表达与恶性肿瘤的复发和预后不良存在相关性。目前卵巢癌的主要治疗方式为手术治疗和化疗联合进行。近年来,随着临床和科研的不断深入,卵巢癌治疗方案有所调整,但临床治疗效果及患者预后并未明显提升。铂类化合物被证明是治疗卵巢癌最有效的化疗药物,但其化疗耐药的存在使得其5年生存率仅为50%左右。目前的有关研究比较多地集中在阐述卵巢癌患者的致病机理,但是迄今为止上皮性卵巢癌发生发展中的分子生物学相关机制并未得到明确阐述。化疗耐药的产生是制约卵巢癌患者预后改善的重要因素,因此研究化疗耐药机制、寻找有效的分子治疗靶点及低毒高效耐药逆转剂,具有比较广阔的临床应用前景。目的对我院收治的卵巢癌患者的基本临床及病理资料进行分析,结合患者的生存时间,探索影响卵巢癌患者预后的因素。基于课题组前期对MACC1与卵巢癌的相关关系的初步分析,更深层次地研究MACC1、HGF、C-met和HE4蛋白在卵巢癌中的表达,探讨其在卵巢癌发展中的作用和相关性,并为判断预后提供观察线索。通过研究MACC1干扰对上皮性卵巢癌细胞以及癌耐药细胞对顺铂敏感性的变化,进一步探索MACC1在卵巢癌化疗耐药中的作用,同时通过MACC1基因在细胞内的耐药性研究为临床上逆转卵巢癌化疗耐药、提高化疗敏感性提供新的理论,并通过体内实验进一步探讨MACC1在卵巢癌移植瘤增殖中的作用。方法1.采用统计学的Pearson卡方检验、Kaplan-Meier生存曲线、log-rank检验和Cox回归等方法来分析上皮性卵巢癌患者的临床病理特征与术后预后特点,明确预后危险因素及影响预后的独立因素;2.采用组织芯片技术、免疫组织化学染色等方法获取MACC1、C-met、HGF和HE4在癌组织和癌旁组织中的表达率;3.采用统计学的Pearson卡方检验、Kaplan-Meier生存曲线、log-rank检验和Cox回归等方法分析不同表达率下的上皮性卵巢癌患者的临床病理特征及预后情况;4.利用细胞培养技术培养顺铂耐药和敏感细胞株,采用实时荧光定量PCR以及Western blot的方法,检测不同分组中MACC1在m RNA和蛋白水平表达情况,并采用MTT法来评价不同组对顺铂化疗敏感性的变化情况;5.采用流式细胞学检测不同组别顺铂加药前后细胞凋亡情况,采用实时荧光定量PCR以及Western blot的方法来检测ERK1/2及p-ERK1/2、cleaved caspase-3和caspase-3蛋白的变化情况,同时分析加入U0126后对上述蛋白表达的影响;6.收集细胞培养中经过不同处理的细胞,采用RT-PCR的方法以及Western blot来检测不同处理组中裸鼠的MACC1 m RNA和蛋白表达,并记录不同处理组裸鼠移植瘤的重量及肿瘤的生长速度。结果1.淋巴结转移、临床分期、病理分化、残余肿瘤直径和化疗情况是影响上皮性卵巢癌患者预后的独立因素,对上皮性卵巢癌患者预后的危险大小依次为:淋巴结转移>病理分化>化疗情况>临床分期>残余肿瘤直径;2.MACC1、C-met、HGF和HE4在卵巢癌组织中的表达率明显高于其在癌旁组织中的表达,其在肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、组织病理分化、残余肿瘤直径和化疗情况中存在差异;3.MACC1、C-met、HGF和HE4高表达患者的中位生存期低于低表达者,其表达水平两两之间存在相关性,存在协同作用;4.MACC1基因沉默组的MACC1 m RNA和蛋白水平低于空白组和空质粒组,MACC1沉默组的顺铂半数抑制浓度(IC50)低于空白组和空质粒组,转染p-super-EGFP-MACC1 sh RNA组MACC1基因表达下调,其m RNA和蛋白水平较未转染组和空质粒组明显下降;5.同浓度顺铂对MACC1沉默的SKOV3/DDP的抑制率显着高于其对转染空质粒和未转染组的抑制率,MACC1沉默组细胞增殖速度低于空质粒组与未转染组,MACC1基因沉默的细胞与未转染组和空质粒组相比,caspase-3、p-ERK1/2蛋白含量明显的降低,而cleaved caspase-3则明显升高;6.pc DNA-MACC1组中的裸鼠肿瘤组织中MACC1的m RNA表达、蛋白表达、裸鼠移植瘤的重量及肿瘤的生长速度均高于未处理组和空载体转染组,未处理组和空载体转染组之间无差异。结论1.MACC1基因表达异常与上皮性卵巢癌的发生发展存在密切联系,MACC1、C-met、HGF和HE4之间的协同作用与上皮性卵巢癌细胞的恶性转化相关;2.MACC1基因在SKOV3/DDP细胞中的表达呈现明显升高趋势,沉默MACC1能有效逆转SKOV3/DDP细胞对顺铂的耐药性;3.MACC1有可能参与到卵巢癌对顺铂的敏感性调节,其可能通过ERK通路调节增殖、凋亡及顺铂敏感性;4.MACC1在上皮性卵巢癌发生发展中会产生多样的生物学行为改变,可能成为治疗上皮性卵巢癌的新型分子靶点。 李梦迪[6]2015年在《A2M和CRABP2基因介导Fas凋亡信号通路逆转卵巢癌铂类耐药的研究》文中研究说明目的本课题组前期成功利用卵巢癌SKOV3细胞株建立了卵巢癌的裸鼠顺铂耐药模型, 得到了卵巢癌顺铂获得性耐药细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ,并对其耐药过程进行了动态系统生物学分析,整和基因表达谱及蛋白质谱的数据信息后,筛选到α2巨球蛋白(A2M)和视黄酸结合蛋白Ⅱ (CRABP2)在各处理组的耐药细胞中均显着降低。本实验继续前期的研究,将A2M和CRABP2导入TCGA提供的499例卵巢癌人类组织全基因组表达谱数据中,分别分析它们与卵巢癌患者铂类化疗耐药和临床预后等的相关性,为将A2M和CRABP2作为潜在的卵巢癌铂类耐药途径的上游调控分子提供临床依据。另外,进一步在基因和蛋白水平上对A2M和CRABP2进行功能验证,并探讨它们表达失衡后对下游耐药相关信号通路的影响,为寻找逆转卵巢癌顺铂耐药的新的靶点奠定基础。方法利用TCGA数据库分析A2M和CRABP2基因的mRNA表达在敏感和耐药患者中的差异；ROC曲线分析二者的表达是否与耐药相关；采用Pearson相关分析二者的表达与卵巢癌患者的总生存期,化疗间隔生存期和无进展生存期的关系；Cox regression分析A2M和CRABP2基因诊断卵巢癌患者耐药的敏感性；最后将TCGA提供的283例卵巢癌患者全基组表达谱数据分别分为A2M和CRABP2高低表达两个组,Kaplan-Meierw分别分析卵巢癌患者铂类化疗间隔生存期在A2M和CRABP2高低表达组之间的差异。利用课题组前期建立的卵巢癌顺铂获得性耐药的SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞株和顺铂敏感的SKOV3-GFP亲本细胞株分别在裸鼠皮下种植成瘤,成瘤后分次顺铂体内干预,实时荧光定量PCR和Western Blot验证分次顺铂干预的移植瘤组织中A2M和CRABP2的mRNA和蛋白表达,检测瘤组织中与细胞增殖及凋亡相关的主要通路中重要节点基因的表达水平,分析二者的表达变化对下游信号通路表达变化的影响。利用PWPI和pSico慢病毒表达系统和SKOV3-GFP/DDPⅡ细胞株,构建CRABP2基因过表达的顺铂耐药细胞株SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2,并且采用mcherry红色荧光标记,CCK试剂盒分析过表达CRABP2后细胞的IC50、耐药指数的变化,Western Blot检测CRABP2基因过表达后对细胞周期调控相关蛋白表达和下游Fas细胞凋亡信号通路上节点基因的蛋白表达的影响。结果相对于敏感病例,A2M和CRABP2基因在铂类耐药患者表达下降(P<0.05,P<0.05),与耐药相关(P<0.05,P<0.05),与卵巢癌患者总生存期,化疗间隔生存期和无进展生存期高度相关(P<0.00,P<0.00),它们的表达量越高,患者的生存期越长；Cox regression分析结果也表明二者可以作为独立的卵巢癌患者预后的指标。ROC曲线分析发现A2M和CRABP2的表达与卵巢癌患者的铂类耐药相关(Area=0.969,0.980) 。Kaplan-Meierw分析结果证实A2M和CRABP2高低表达组的患者的铂类化疗间隔生存时间均有显着差异(P<0.00)。细胞凋亡相关的Fas信号通路上重要节点基因Fas, FADD, Caspase10, Caspase9和Caspase3随顺铂注射次数的增加在耐药组织中相对低表达(P<0.00),而其下游与DNA修复相关的基因PARP1随顺铂注射次数的增加在耐药的移植瘤组织中相对高表达(P<0.05)。所有这些基因在移植瘤组织中的蛋白表达也呈现与mRNA大致一致的趋势。不同次数顺铂作用后的瘤组织中A2M、CRABP2的mRNA相对表达量与Fas信号通路节点基因和下游PARP1的表达变化均存在相关性(P<0.05,P<0.00)。相对于SKOV3-GFP/DDPⅡ和空白对照的SKOV3-GFP/DDPⅡ-Blank细胞株,过表达CRABP2的SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2细胞株对于顺铂的IC50均显着降低(P<0.00),耐药指数明显下降(P<0.00)；其细胞周期被显着抑制,细胞凋亡被激活：细胞周期依赖性蛋白激酶CDK4、CDK6和CDK2以及细胞周期蛋白cyclin D1的表达在SKOV3-GFP/DDPⅡ-CRABP2细胞中显着减弱(P<0.00),而细胞周期的阻断剂p27 kip1的蛋白表达显着增强(P<0.00);Fas凋亡信号通路上的节点基因Fas、FADD、Caspase10、 Caspase9和Caspase3的蛋白表达显着增强(P<0.00),而凋亡信号通路下游的DNA修复相关基因PARP1的蛋白表达则显着降低(P<0.05),即过表达CRABP2基因后的卵巢癌顺铂耐药细胞恢复了对顺铂的敏感性。结论A2M和CRABP2与卵巢癌的顺铂耐药有关,它们在耐药的卵巢癌细胞和组织中表达减弱。二者作为潜在铂类耐药调控信号途径的上游关键信号分子,可通过激活Fas凋亡信号通路的作用维持卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性,过表达后可使耐药的卵巢癌细胞恢复对顺铂的反应性。这给临床上逆转卵巢癌铂类耐药的治疗提供了新的靶点和理论基础。 王瑛[7]2014年在《“滋阴填精方”对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤的作用及LRP、GST-π表达的影响》文中认为[目的]卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其死亡率居女性生殖系统肿瘤之首。当前卵巢癌的治疗方式仍以手术为主,化疗、放疗等为辅,手术方案主要是肿瘤细胞减灭术,化疗以铂类为基础。卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药性成为卵巢癌治疗的阻碍,目前对卵巢癌药耐药机制的中西医研究较多,中医在此研究中的比重逐渐增加,许多研究发现中药及其有效成分能够逆转卵巢癌耐药,使卵巢癌细胞对化疗药物敏感,然而对中药复方逆转卵巢癌耐药的研究较少。临床以及文献研究中发现化疗后患者的中医证型以虚证为主,常见的有阴虚证、气虚证等,中药能够有效的改善患者的症状,但是其机理尚不明确。根据辨证论治,随证立法,方从法出的中医思维,提出“滋阴填精方”(由黄精、麦冬、白芍、白术组成)可以调控卵巢癌化疗耐药的假说,并且通过体外实验、动物实验来验证,为逆转卵巢癌化疗耐药寻求新方法。[方法]在证实耐顺铂细胞系耐药性的前提下,建立卵巢癌耐顺铂动物模型,分为四组,分别是模型组、顺铂组、“滋阴填精方”+顺铂组,“滋阴填精方”组。对这四组分别进行干预,处死动物后,测量瘤体积、瘤重、计算抑瘤率,HE染色法检测各组瘤体的病理组织结构,免疫组织化学法检测LRP、GST-π的表达。[结果]1.“滋阴填精方”协同顺铂可有效地抑制肿瘤生长,抑制率达到65.06%,抑制率高于单独使用顺铂组。2.顺铂,“滋阴填精方”+顺铂,“滋阴填精方”均可显着下调LRP的表达水平,与模型组相比均具有显着差异,P均小于0.05；“滋阴填精方”+顺铂组中LRP的表达低于顺铂组、“滋阴填精方”组,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.05)；顺铂组中LRP的表达低于“滋阴填精方”组,差异具有统计学意义,P<0.05。3.顺铂,“滋阴填精方”+顺铂,“滋阴填精方”均可显着下调GST-π的表达水平,与模型组相比均具有显着差异,P均小于0.05；“滋阴填精方”+顺铂组中GST-π的表达低于顺铂组、“滋阴填精方”组,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.05)；顺铂组的GST-π的表达低于“滋阴填精方”组,差异具有统计学意义,P<0.05。[结论]1.“滋阴填精方”可协同顺铂抑制卵巢癌耐顺铂裸鼠移植瘤的生长。2.“滋阴填精方”可能是通过降低LRP、GST-π的表达来降低卵巢癌对顺铂的耐药性。 刘玲[8]2014年在《miRNA-mRNA差异表达与卵巢癌多药耐药关系的研究》文中提出卵巢癌在女性生殖道恶性肿瘤发病率中占第叁位，但是死亡率高居第一。化疗是治疗卵巢上皮癌重要手段之一，但多药耐药的产生又是导致化疗失败的中心环节。卵巢上皮癌多药耐药机制十分复杂，目前研究认为可能涉及肿瘤细胞内化疗药物的外排、DNA损伤与修复、细胞凋亡异常和信号传导通路障碍等分子机制，但是至今仍未找到安全有效的逆转耐药靶点。本研究拟通过运用miRNA芯片技术和基因芯片技术，以及生物信息学等多样化研究手段，从临床到基础研究，然后回归临床的研究桥梁，阐述卵巢上皮癌多药耐药分子机制，为寻找安全有效的逆转卵巢上皮癌多药耐药治疗靶点提供理论基础。研究目的：筛选卵巢上皮癌多药耐药相关miRNA表达谱。材料和方法：采用Agilent miRNA芯片，检测5例卵巢上皮癌耐药组织、5例敏感组织、5例卵巢良性肿瘤和5例正常卵巢组织的miRNA表达情况，运用Fc差异倍数，获得了卵巢上皮癌耐药组和敏感组差异大于2倍的上调或下调miRNA。用多个在线软件分别预测上调和下调差异miRNA对应的靶基因，并运用GO分析和Pathway通路富集等生物信息学方法分析预测到的靶基因潜在的生物学功能和参与的信号通路。用QRT-PCR验证芯片结果，并扩大样本量检测目的miRNA的表达情况，并分析miRNA表达水平与临床病理因素关系。结果：miRNA芯片筛选出与卵巢上皮癌多药耐药相关的差异表达miRNA共62个，其中有42个miRNA在卵巢上皮癌耐药组织中上调、20个miRNA下调，上调miRNA预测到1391个靶基因，下调miRNA预测到1231个靶基因。GO分析结果显示：上调表达的miRNA预测到的靶基因主要参与了细胞蛋白质代谢过程和RNA聚合酶II启动子的转录调控过程，下调表达的miRNA预测的靶基因主要参与转录调控、蛋白酶参与的细胞蛋白质分解代谢过程以及细胞蛋白质分解代谢等过程。KEGG Pathways通路分析提示上调表达的miRNA预测的靶基因主要参与TGF-beta信号通路和粘着连接信号通路。疾病富集分析部分靶基因与卵巢上皮癌或卵巢肿瘤相关。QRT-PCR验证miRNA芯片结果，差异表达的miR-200a-3p、miR-382-5p、miR-1、miR-152和miR-299-5p与芯片表达趋势一致，扩大临床样本验证亦得到了一致的结果，其中miR-200a-3p在卵巢癌耐药组织中下调0.31倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；miR-382-5p、miR-152和miR-299-5p分别上调3.53倍、2.69倍和2.70倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；miR-1上调1.14倍，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：我们通过miRNA芯片技术筛选出了跟卵巢上皮癌耐药相关miRNA表达谱，同时靶基因预测提示我们一个miRNA可以调控多个靶基因，而一个靶基因又可能同时受几个miRNA的调控，可见miRNA的调控机理是十分复杂的。生物信息学分析提示差异表达miRNA预测到的靶基因广泛参与多个生物学过程，我们可以推测这些异常表达的miRNA可能通过调控特定功能的靶基因，参与重要信号传导通路，在肿瘤的生长及肿瘤耐药产生过程中发挥重要角色。后期需要进一步研究以认识这些差异miRNA参与卵巢上皮癌耐药发生的相关分子机制。研究目的：筛选卵巢上皮癌多药耐药相关mRNA表达谱。材料和方法：采用Agilent lncRNA芯片，检测5例卵巢上皮癌耐药组织、5例敏感组织、5例卵巢良性肿瘤和5例正常卵巢组织的mRNA表达情况，获得与卵巢上皮癌耐药组和敏感组差异大于2倍的上调或下调mRNA。运用GO分析和Pathway通路富集等生物信息学方法分析差异表达mRNA潜在的生物学功能和参与的信号通路。用QRT-PCR验证芯片结果，并扩大样本量检测目的mRNA的表达情况，并分析mRNA表达水平与临床病理因素关系。结果：mRNA芯片筛选出于卵巢上皮癌多药耐药相关差异表达mRNA共855个，其中在卵巢上皮癌耐药组织中上调表达的mRNA598个，下调表达的257个。生物信息学分析结果显示上调mRNA主要参与细胞粘附、生物黏附、调节细胞增殖、免疫反应以及血管发育等31个生物学过程，下调mRNA未富集到显着相关生物学过程。KEGGPathway分析结果显示上调mRNA主要参与了粘着斑和ECM-受体相互作用的信号传导途径。QRT-PCR验证芯片结果，KIT、HGF、CSF1R、PDGFRB和KIAA1804与芯片表达趋势一致，扩大临床样本验证亦得到了一致的结果，其中KIT、HGF、CSF1R、PDGFRB基因在EOC耐药组织中分别上调3.81倍、2.74、2.03倍和2.92倍，差异有统计学意义（P﹤0.05），而KIAA1804基因则下调0.42倍，差异有统计学意义（P﹤0.05）。结论：利用基因芯片基础筛选出了跟卵巢上皮癌多药耐药相关的mRNA表达谱，丰富了目前已知的跟耐药相关的靶基因数据。生物信息学提示差异表达mRNA多参与细胞粘附、调节细胞增殖、免疫反应等生物学过程，以及部分mRNA被富集在粘着斑和ECM-受体相互作用的信号通路上，提示这些差异基因可能通过多种途径参与卵巢上皮癌多药耐药的发生，后期需要进一步研究以认识这些差异miRNA参与卵巢上皮癌耐药发生的相关分子机制。研究目的：构建与卵巢上皮癌多药耐药相关miRNA-mRNA调控网络。材料和方法：对筛出的卵巢上皮癌多药耐药相关的miRNA差异表达谱和mRNA差异表达谱信息运用MAGIA软件进行整合分析，并选取miRNA跟mRNA负相关的miRNA-mRNA，构建卵巢上皮癌耐药相关miRNA-mRNA调控网络图，并用QRT-PCR方法验证关键位点miRNA和mRNA的表达，并分析miRNA-mRNA表达水平与临床病理因素关系。结果：miRNA表达谱和mRNA表达谱关联后，共得到53对负关联的miRNA/miRNA，其中包括10个miRNA和43个mRNA，被富集到的靶基因最多的是miR-429和miR-381，对应靶基因数目分别为16个和8个，而被最多miRNA关联调控的mRNA分别是ERBB4、PRKCE和PPP1R9A，印证了一个miRNA调控多个靶基因，而一个靶基因可受到多个miRNA调控。扩大临床样本QRT-PCR验证结果：相比于卵巢癌敏感组，miR-429、miR-373-5p在卵巢耐药组中分别下调0.35倍和0.39倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；对应靶基因KANK2、ZEB2和CTSD分别上调2.56倍、3.15倍和1.89倍，差异有统计学意义（P＜0.05）；miR-381、miR-495和miR-410在耐药组中分别上调2.36倍、2.46倍和2.42倍，差异有统计学意义（P＜0.01）；对应的靶基因ERBB4、TIAL1、FGFRL1和MPPED2分别下调0.46倍、0.38倍、0.29倍和0.43倍，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：经过QRT-PCR验证以及文本挖掘，我们认为构建与卵巢上皮癌多药耐药相关的miRNA-mRNA调控网络图比较可靠，提示了在卵巢癌耐药组织中miRNA和mRNA复杂的调控网络关系，亦从多基因多靶点角度阐述了卵巢上皮癌多药耐药的发生机制。而关键位点的miRNA及其负调控mRNA具体以何种方式和途径参与EOC多药耐药机制的发生，需要后期做进一步深入的功能学研究，以期找到确实可靠的逆转卵巢上皮癌MDR被关键靶点，指导临床更好得防治卵巢上皮癌多药耐药的发生，提高患者预后和生活质量。 杨华[9]2006年在《耐药性卵巢癌的耐药机制及治疗的研究进展》文中研究指明卵巢癌是严重威胁妇女生命和健康的常见恶性肿瘤，其发病率在妇科恶性肿瘤中居第3位，死亡率居首位。卵巢癌早期诊断率较低，确诊时有60％～70％的患者已属晚期。目前，晚期卵巢癌的治疗方法主要为肿瘤细胞减灭术并辅以术后化疗。但至少有60％的化疗患者出现获得性耐药，晚期卵巢癌(Ⅲ期)患者5年生存率仅为20％～30％。化疗对其总体生存率并无明显改善，这其中的主要原因是由于卵巢癌细胞对化疗药物产生了多药耐药性。多药耐药性是指肿瘤细胞可耐受各种结构、功能及杀伤机制各异的多种化疗药的致死剂量的特性。合理的化疗方案虽可最大限度的发挥各种药物的作用，但仍因耐药性的出现而告失败。因此，研究肿瘤产生耐药的机制，并在临床上预防耐药、对抗耐药并尝试逆转耐药就成为当前卵巢癌治疗中的热点和难点，成为提高卵巢癌的治疗效果、改善卵巢癌患者生存的重要目标之一。肿瘤对化疗药物的多药耐药性的产生是由多重因素复杂作用的结果，目前对于卵巢癌耐药机制的研究主要集中于以下几个方面：①与耐药相关基因及其表达产物的研究。②与耐药有关的酶类的研究。③其他与耐药有关的物质的研究，如巯基化合物中的谷胱甘肽和金属硫蛋白等。目前对耐药性卵巢癌患者的治疗方法主要有：手术和化疗。晚期卵巢癌(Ⅲ期、Ⅳ期)患者在完成手术与化疗后达到临床缓解后至少有60％复发。对耐药性卵巢癌患者的手术指征、手术时机及与化疗的关系目前还存在争议，应根据患者不同情况采用适当的手术方式与手术范围。通常认为手术治疗仅适用于以下几种情况：复发的肿瘤灶明确且相对孤立，估计手术切除可能性大；对以往化疗有较好的反应，术后有可用的较敏感的化疗方案；为了解除肠梗阻等症状。同时还要结合患者的生活状态、经济情况评估患者对手术的可能耐受程度，确认术后患者能够受益。化疗主要有两个方面：一是选用与初期化疗没有交叉耐药性的化疗药物或化疗方案：依托泊苷(VP-16)、脂质体阿霉素(pegylated liposomal doxorubicin，PLD)，Caelyx、拓扑替康(topotecan)、吉西他滨(gemcitabine)、奥沙利铂(oxaliplatin)等都具有很好的疗效。二是尝试使用耐药逆转剂：包括①钙离子通道阻断剂：维拉帕米、双嘧啶胺醇；②钙调蛋白抑制剂：叁氟拉嗪等；③免疫调节剂：环孢素或非免疫抑制性的环孢素类似物PSC833；④奎尼丁类；⑤激素、激素拮抗剂类。另外，外周造血干细胞移植支持下的大剂量化疗也是一种新的尝试。卵巢癌是一种严重威胁妇女生存的疾病，随着一些新化疗药物的广泛应用，近年来对化疗耐药的研究出现一些新进展：①单层细胞培养卵巢癌耐药模型向叁维立体模型转变。②卵巢癌耐药机制的研究也开始将细胞外间质的影响考虑在内，以探讨细胞微环境对肿瘤细胞化疗敏感性的影响。③目前有证据表明肿瘤转移和化疗耐药密切相关，因此，耐药研究与肿瘤细胞其它生物学特性研究综合化可能在今后为人们进一步关注。 任芳[10]2017年在《miR-421通过靶向组蛋白赖氨酸去甲基化酶5A调控卵巢癌增殖、迁移和侵袭的初步研究》文中提出研究背景:在所有的妇科恶性肿瘤里,上皮性卵巢癌是死亡率最高的一种。近年来,随着对卵巢癌研究的深入,卵巢癌的治疗也有了长足发展。先行肿瘤细胞减灭术(满意的),接着使用紫杉醇和铂类为主的联合化疗,这是目前卵巢癌的标准治疗方案。这种治疗方案虽然改善了初治卵巢癌的预后,但其总体生存率仍无明显改善,III期和Ⅳ期(晚期卵巢癌)患者的5年生存率仍仅仅只有29%和13%,这与卵巢癌化疗耐药及侵袭转移有关。因此,研究卵巢癌发生发展过程的分子机制,可以为寻找新的有效的治疗方法提供理论基础,在改善卵巢癌患者的预后方面具有重要的临床意义。肿瘤靶向基因治疗是针对肿瘤组织有别于正常组织的特征,通过分子生物学技术将目的基因靶向导入特定的组织细胞或在特定的组织细胞中靶向表达,修复缺陷基因或抑制致瘤基因,从而在不影响正常细胞的情况下,使肿瘤细胞生长受到抑制。因此,与传统的化疗相比,肿瘤靶向基因治疗具有特异性强,疗效明确,副作用低等优点,具有广阔的应用前景。肿瘤靶向基因治疗的叁大靶点包括细胞生长因子受体、细胞内信号传导系统以及新生血管。目前应用于卵巢癌分子靶向制剂主要包括ErbB受体家族抑制剂(吉非替尼,西妥昔单抗等)、VEGF受体家族抑制剂(贝伐单抗,索拉菲尼等)、诱导凋亡及逆转耐药制剂(如TLK-286,P-gp抑制剂等)、PDGF和c-Kit抑制剂(格列卫)及基因治疗(P53基因治疗)等。然而,上述分子靶向制剂在前期临床研究中治疗效果欠佳,其原因之一是由于在肿瘤的发生发展的过程中,往往有多个抑癌基因的失活,在肿瘤治疗过程中,针对单一基因的治疗常常不足以抑制肿瘤的生长。因此,探索卵巢癌发生发展的多因素环节,寻找新的治疗靶标有可能为卵巢癌的治疗提供新的选择。表观基因机制是指基因的功能或表达水平在基因组序列不变的情况下发生可遗传的改变。主要包括:DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA干扰等。表观遗传修饰针对整个基因组而不是特定的基因,其调节可同时恢复多个抑癌基因的表达,并降低基因突变的发生率,提高基因组稳定性,可能为肿瘤分子靶向治疗提供新的靶点。随着对表观基因改变的认识,将表观基因药物与基因药物连用将是肿瘤治疗的一个新的起点。组蛋白赖氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylase genes,KDMs)在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。其可通过催化去除组蛋白N末端赖氨酸残基上的甲基,而组蛋白去甲基化状态调控着基因的表达,参与染色质功能的调节,这是一种重要的表观遗传学调控方式。去甲基化主要发生在组蛋白H3、H4的多个赖氨酸位点上,从而介导基因的激活或者沉默。因此当KDMs的表达发生变化时,其会随之导致组蛋白的去甲基化状态也发生相应的改变,从而发生某个或某些基因的异常沉默或者激活。在恶性肿瘤的发生发展过程中,这一系列的变化往往与之密切相关,也贯穿于癌症的各个阶段。因此,癌症在一定程度上是一种表观遗传疾病。KDM5A又称RBP2或JARID1A,是KDMs家族的一个重要成员,它能特异性地作用于组蛋白的H3的第4位赖氨酸位点(H3K4me3)上,对其作用,使之发生去甲基化修饰。KDM5A是由于在2007年之前,KDM5A以pRb结合蛋白的方式为人所知,因此又称RBP2。它由ARID(即AT-rich interaction domain)、JmjN、JmjC、non-T/E1A、C5HC2、LXCXE尾部和2~3个PHD结构域构成。其中KDM5A的特异性去甲基化酶活性区是JmjN和JmjC;ARID可与DNA CCGCCC尾部发生结合,从而导致靶基因转录翻译受到抑制,进一步影响肿瘤的发生和发展的过程。KDM5A可通过多种途径在肿瘤的发生发展中发挥作用。2010年,Zeng J等研究发现:KDM5A在胃癌里过表达,并与胃癌细胞的增殖与衰老关系密切;应用RNA干扰技术沉默KDM5A能够激活细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,从而诱导胃癌细胞衰老,调控胃癌细胞的增殖。同时,KDM5A可以通过激活Akt信号通路上调N-cadherin和Snail的表达水平,或者直接与ITGBβ1(整合素β1)的启动子进行结合,从而调控癌细胞的恶性生物学行为,如侵袭和转移等。KDM5A还参与促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭转移,主要是通过上调细胞周期蛋白如:cyclin D1和integrinβ1的表达。同时,肿瘤细胞耐药也同样存在KDM5A的参与。Jinling Hou等研究发现,KDM5A在乳腺癌中的过表达与乳腺癌细胞化疗耐药相关。通过应用shRNAs抑制乳腺癌细胞的KDM5A的基因表达,导致了H3K4甲基化程度增加和CDKIs激活,提高了EGFR(epidermal growth factor receptor)抑制剂的抗肿瘤效果,从而提示KDM5A可作为乳腺癌的潜在治疗靶点。但KDM5A在卵巢癌发生发展中的作用与分子机制目前尚未见报道。microRNA(即微小RNA,miRNA)是一种内源性非编码小RNA,长度约为18-25nt,进化上高度保守。mi RNA通过与靶基因的互补结合,导致靶基因的切割及翻译抑制,从而调控靶基因的表达。mi RNA对靶基因的调控并不是一一对应的,一个miRNA可直接调控约两百个靶mRNA,同时多个miRNA也可调控同一个靶基因。人类基因组内含有的miRNA可达到上千个,可调控将近33%的蛋白编码基因。近年来,越来越多的研究表明,miRNAs在肿瘤发生和进展中起到了重要的作用,约50%的mi RNAs与多种人类肿瘤相关。这并不是一个偶然事件,从目前的研究来看,有许多已证实功能的miRNA,这些miRNA在不同肿瘤中所起的作用各不相同,即可能作为致癌基因起作用,也可能作为抑癌基因发挥作用,参与肿瘤发生进展及转移的各个阶段。近年来,miRNA在转录后水平对于基因的调控一直是研究的热点之一。近年来,miRNAs在卵巢癌发生发展中的作用也受到越来越多的关注。有研究通过应用微阵列芯片或大规模并行测序技术,发现卵巢癌中存在一系列异常上调或下调的miRNAs。但miRNAs的下调更为常见,尤其是在晚期和高级别病变中。虽然目前卵巢癌中miRNA差异表达谱并没有得到一致的研究结果,但仍然有一些miRNA在多个研究中被发现具有相同的异常表达模式。例如,let-7是一个明确的抑癌miRNA,它在几乎所有上皮性卵巢癌的miRNA表达谱研究中都呈现下调的表现,其靶基因包括胚胎基因HMAG2、Mlin-41和IMP-1和着名的癌基因ras。因为在癌变早期往往有胚胎间充质基因的重新表达,与胚胎发育过程类似,因此let-7表达下调造成的癌细胞去分化很有可能是上皮性卵巢癌发生的早期因素。不同的是,上皮间质转化(EMT,epithelial-mesenchymal transition)是在上皮性卵巢癌发生种植转移的过程中的重要机制之一。miR-200是EMT的关键调控者,miR-200表达的下降伴随着上皮性卵巢癌转移的发生,这个过程是miR-200通过其靶基因——两个E盒结合转录因子ZEB1和ZEB2,来调节E-钙粘蛋白的表达而实现的。这些研究结果均提示miR-200下调在上皮性卵巢癌的进展、转移阶段发挥作用。此外,还有一些调控细胞调亡(如miR-34s)或增殖(如miR-143)的miRNA的异常表达通过引起肿瘤细胞增殖凋亡平衡而促进上皮性卵巢癌的发生、发展。可见,上皮性卵巢癌中miRNA的表达异常与DNA拷贝数改变、表观遗传因素、转录因子调控及miRNA加工蛋白的变化等机制有关。最近研究发现,miRNA可以靶向KDMs家族,从而参与调控肿瘤的发生及侵袭转移。近日,杜克大学王小凡教授发现缺氧诱导的miR-215通过抑制表观遗传调控因子KDM1B及调节多条信号通路的活性,重编程胶质瘤起始细胞(Glioma-initiating cells,GICs)适应了这种缺氧微环境,对胶质瘤的发生、发展及转移起到了至关重要的作用。因此深入研究miRNA与KDMs家族在卵巢癌中的表达状况及相互作用,对研究卵巢癌的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于卵巢癌的诊断、治疗及预后判断。目前,国内外尚无KDM5A与卵巢癌相关关系的研究报道,且其上游由哪种miRNA调控也未见相关报道。miR-421靶向KDM5A是否参与卵巢癌的发生发展、其与卵巢癌细胞的生物学行为关系如何、其对卵巢癌的临床意义何在等问题尚不清楚。第一部分KDM5A在卵巢癌组织中的表达和临床意义以及分子机制研究目的:评估KDM5A在卵巢癌中表达的临床意义以及和临床特征及预后的关系,然后进一步研究KDM5A在卵巢癌增殖侵袭转移中的调节作用及其分子机制。方法:1.对卵巢癌基因表达谱进行挖掘(利用BRB-Arraytools基因芯片分析软件),下载GEO及TCGA公共数据库中的卵巢癌基因芯片数据,分析KDM5A在卵巢癌组织与正常卵巢组织中的表达情况。并结合其临床随访数据,分析KDM5A在卵巢癌组织中的表达与临床病理特征及预后之间的关系。2.从郑州大学第一附属医院妇科收集51例卵巢癌和51例正常卵巢组织的组织标本,并提取总RNA,应用Realtime-PCR方法检测51例卵巢癌组织和51例正常卵巢组织中的KDM5A中的mRNA表达水平。3.卵巢癌组织中的KDM5A蛋白表达强度应用组织芯片技术检测,并分析KDM5A表达与卵巢癌患者临床因素及患者预后之间的关系。4.将靶向KDM5A的siRNA转染至卵巢癌细胞系OVCAR-8和SKOV-3,利用RNAi技术沉默KDM5A,研究其对卵巢癌细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭的生物学行为的影响。5.数据的统计分析采用GraphPad Prism 5软件进行,数据采用均数±标准差。两组数据间的比较采用的方法为Mann-Whitney’s检验或双侧Student’s t-test。总生存期分析方法为Kaplan-Meier survival curves,以α=0.05作为检验水准。结果:1.生物信息学分析KDM5A在卵巢癌组织中的表达:与正常卵巢组织对比,卵巢癌组织中KDM5A mRNA表达水平呈显着升高(P﹤0.0006)(GEO公共基因数据库)。KDM5A低表达的卵巢癌患者的生存时间明显好于KDM5A高表达的患者(TCGA公共基因数据库),提示KDM5A的过表达和卵巢癌患者的临床预后密切相关。2.临床标本验证KDM5A mRNA表达:对临床收集的卵巢癌组织和正常卵巢组织各51例中检测发现:卵巢癌组织中KDM5A mRNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P﹤0.05)。3.临床标本检测KDM5A蛋白表达:根据卵巢癌组织芯片的分析结果我们发现,卵巢癌组织中KDM5A的蛋白表达水平明显增高。Kaplan-Meier分析结果显示卵巢癌组织中KDM5A的表达水平与患者的临床预后密切相关,单因素分析结果显示KDM5A的表达与FIGO分期(P=0.012)、淋巴结转移(P=0.005)有关,而与年龄(P=0.937)、组织学类型(P=0.841)、病理分级(P=0.686)无明显相关。4.功能学验证:KDM5A基因敲减后,卵巢癌细胞系的增殖、迁移和侵袭能力均明显下降,细胞成瘤能力受到显着抑制;凋亡率明显升高。结论1.KDM5A在卵巢癌中表达水平明显高于正常卵巢组织;2.KDM5A的高表达与卵巢癌患者的FIGO分期、淋巴结转移以及患者预后明显相关,表明KDM5A在卵巢癌发生发展过程中可能发挥了重要作用;3.沉默KDM5A的表达后,卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显抑制,同时可诱导卵巢癌细胞的凋亡。第二部分靶向KDM5A的miRNA的筛选鉴定及其调控卵巢癌增殖的分子机制研究目的:利用生物信息学技术筛选和鉴定可能靶向KDM5A的miRNA,进一步研究KDM5A在卵巢癌中异常表达的上游分子机制。方法:1.通过在线预测工具(Targetscan,miRanda,miRwalk)计算分析预测能够靶向KDM5A的miRNAs的集合,筛选出潜在的可能靶向KDM5A的miR-421,并与临床收集的51例卵巢癌和51例正常卵巢组织中的miR-421的表达水平检测相结合。2.利用TCGA数据库中卵巢癌的mi RNA芯片表达谱及其随访数据,分析卵巢癌组织中miR-421的表达与卵巢癌预后的关系。3.过表达mi R-421后,在卵巢癌细胞中检测KDM5A mRNA和蛋白表达水平变化,并观察卵巢癌细胞的增殖及侵袭能力的变化。4.通过双荧光素酶报告实验,对miR-421靶向KDM5A的负性调控作用进行验证。5.数据的统计分析应用GraphPad Prism 5,数据应用均数±标准差表示。组间数据的比较方法为Mann-Whitney’s检验或双侧Student’s t-test。总生存期的分析方法采用Kaplan-Meier survival curves,以α=0.05作为检验水准。结果:1.通过生信学分析发现,miR-421可能靶向调控KDM5A;并且利用RT-PCR检测发现,卵巢癌组织中miR-421的表达水平显着降低(P<0.0001),进一步通过荧光素酶报告实验证实miR-421含有KDM5A结合位点的萤光报告基因的活性。2.通过Kaplan-Meier分析显示:miR-421的表达水平与卵巢癌患者预后明显相关(P=0.016),mi R-421低表达的卵巢癌患者,其生存时间差于高表达者,提示miR-421的表达水平与卵巢癌患者预后密切相关。3.miR-421过表达可对KDM5A表达水平有明显影响。mi R-421过表达后,与KDM5A敲除有相似的效果,可导致卵巢癌细胞系的增殖及侵袭能力明显下降。初步表明miR-421对KDM5A的负性靶向调控可在转录后水平进行,从而参与卵巢癌的侵袭和转移。结论:1.miR-421在卵巢癌中低表达,其可能是抑癌基因。miR-421的表达水平和卵巢癌患者的临床预后密切相关。2.miR-421能够特异性的靶向结合KDM5A基因,miR-421/KDM5A调节轴在卵巢癌的发生和发展中可能起到了重要的作用。第叁部分miR-421对卵巢癌生物学行为影响的体内研究目的:进一步研究miR-421靶向KDM5A在体内对裸鼠体内卵巢癌移植瘤生长的影响。方法:1.将miR-421稳定过表达组(Lenti-miR-421)和空病毒对照组(Lenti-mock)的卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下,观察miR-421对卵巢癌生物学行为的体内影响。2.观察并记录裸鼠体积和重量,观察miR-421稳定过表达组(Lenti-miR-421)和空病毒对照组(Lenti-mock)裸鼠肿瘤体积和重量的变化,绘制肿瘤生长曲线。3.RT-PCR技术检测裸鼠肿瘤组织中的miR-421及KDM5A的表达;免疫组织化学技术检测裸鼠肿瘤组织的KDM5A和Ki67的表达。4.统计学分析利用GraphPad Prism 5进行。基因表达强度与之间的相关性采用Pearson’s相关分析进行;总生存曲线用Kaplan-Meier法,所有实验结果均以P<0.05为有统计学意义。结果:1.转染Lenti-miR-421裸鼠肿瘤组织中的miR-421的表达显着上升(P<0.05);和转染空病毒(Lenti-mock)的裸鼠组相比,过表达miR-421(Lenti-miR-421)后卵巢癌增殖速度明显减慢,肿瘤体积减少。2.免疫组化证实过表达miR-421后KDM5A表达降低,KDM5A的表达和miR-421的表达呈负相关;肿瘤增殖标志物Ki67表达降低。结论:1.过表达miR-421后卵巢癌细胞在体内增殖速度明显减慢。2.KDM5A是miR-421的下游直接靶基因,miR-421通过靶向KDM5A而抑制卵巢癌增殖。全文结论1.卵巢癌组织中KDM5A的表达明显升高,其高表达与患者的FIGO分期、淋巴结转移等临床恶性表型明细相关,且其高表达和患者的预后密切相关,可见KDM5A在卵巢癌的发生和发展过程中起到促癌基因作用;2.miR-421在卵巢癌中表达明显降低,其低表达与患者的预后密切相关。提示在卵巢癌的发生和发展过程中miR-421可能起到抑癌基因的作用;3.miR-421能够特异性的结合KDM5A的3’UTR区,通过负性调节KDM5A的蛋白表达,参与卵巢癌的进展;4.在卵巢癌的发生发展中,miR-421/KDM5A调节轴起到了重要作用,未来有望成为卵巢癌靶向治疗的新靶点。 [1]. p53、线粒体基因多态性与二甲双胍辅助卵巢癌化疗增敏关系研究[D]. 韦德华. 郑州大学. 2016 [2]. 卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究[D]. 冯同富. 广西医科大学. 2008 [3]. PARP-1和EMT在卵巢癌中的生物学功能及意义[D]. 苏姗. 山东大学. 2017 [4]. 二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究[D]. 李状. 广西医科大学. 2012 [5]. MACC1与卵巢癌患者预后及其顺铂耐药性关系的分子机制研究[D]. 陈志敏. 郑州大学. 2016 [6]. A2M和CRABP2基因介导Fas凋亡信号通路逆转卵巢癌铂类耐药的研究[D]. 李梦迪. 广西医科大学. 2015 [7]. “滋阴填精方”对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤的作用及LRP、GST-π表达的影响[D]. 王瑛. 北京中医药大学. 2014 [8]. miRNA-mRNA差异表达与卵巢癌多药耐药关系的研究[D]. 刘玲. 广西医科大学. 2014 [9]. 耐药性卵巢癌的耐药机制及治疗的研究进展[D]. 杨华. 郑州大学. 2006 [10]. miR-421通过靶向组蛋白赖氨酸去甲基化酶5A调控卵巢癌增殖、迁移和侵袭的初步研究[D]. 任芳. 郑州大学. 2017 标签：妇产科学论文; 肿瘤学论文; 二甲双胍论文; 化疗药物论文; 放化疗论文; p53基因论文; 卵巢癌的症状论文; dna提取论文; 传代培养论文; 顺铂论文; 线粒体论文; 上皮细胞论文; 癌症论文; d-loop论文; 线粒体dna论文; 参考文献：