孙堂胜[1]2003年在《转化生长因子β_2对培养的兔视网膜色素上皮DNA合成增殖影响的研究》文中进行了进一步梳理目的：本研究旨在探讨转化生长因子β_2对体外培养的兔视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞增殖和DNA合成的影响，揭示TGF—β_2在增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)中的作用。 方法：建立兔视网膜色素上皮细胞系进行体外培养。在此基础上应用10μM的溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、2ng／ml的TGF-β_2以及LPA+TGF-β_2在血清组和无血清组干预细胞生长过程，研究该浓度下叁种作用因素对兔RPE细胞增殖和DNA合成的影响。 结果：1．10μM的LPA对兔RPE细胞的生长具有促进作用，可与血清协同促进兔RPE细胞增殖和DNA合成。 2．TGF-β_2对兔RPE细胞的生长具有抑制作用。单独应用TGF-β_2时抑制效应更为明显，细胞数量及DNA合成均显着减少。 3．TGF-β_2可抑制因LPA引起细胞的旺盛增殖和DNA合成效应。 结论：鉴于RPE细胞在PVR发生、发展中所起的重要作用，揭示TGF-β_2对RPE细胞增殖和DNA合成的抑制作用将有助于为PVR的控制和治疗开辟新的途径。同时可利用LPA对RPE细胞的促增殖作用为开展原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)等RPE细胞变性性疾病的治疗提供新的思路。
张文松[2]2007年在《氯离子通道ClC-2在人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移中的作用及对PVR形成的影响》文中提出增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy PVR)是造成人类失明的主要原因之一。已经发现视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial RPE)细胞是PVR增殖膜的主要细胞成分,其异常增殖和迁移是PVR发生和复位手术失败的主要原因。而且已经发现氯离子通道ClC-2的功能与某些细胞增殖、迁移有关。ClC-2与PVR发生和发展的关系有待于研究。本实验利用酵母双杂交技术,筛选出与ClC-2相结合的蛋白,这些蛋白与细胞增殖功能有关;利用RT-PCR和Western-Blot发现ClC-2的mRNA及蛋白质在RPE细胞均有表达;通过氯离子通道阻滞剂及SiRNA技术,利用MTT实验、流式细胞仪、核仁染色及纤维连接蛋白包被乳胶株的吞噬实验证实了ClC-2功能抑制后RPE细胞的增殖、迁移及吞噬功能均受到抑制;并通过动物实验证实应用氯离子通道阻滞剂抑制ClC-2功能后PVR的发生发展受到抑制。本实验的创新性在于首次研究PVR的发病机理与ClC-2的功能的相关关系,并通过动物实验证实ClC-2的功能与PVR成正相关。为临床探索治疗PVR的新的方法提供了新的思路。
张未娟[3]2010年在《豚鼠视网膜色素上皮细胞分泌TGF-β2的信号通路的研究》文中研究表明目的在各种近视眼发病机制学说中,“视网膜局部调控学说”备受瞩目,该学说认为视网膜感知外界环境变化后产生一级近视信号因子(如视黄酸,RA)并作用于视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE),使之产生二级信号因子(如TGF-β2),进而调控巩膜的生长,形成近视。本实验观察全反视黄酸(ATRA)对豚鼠RPE细胞的生长、分泌TGF-β2的影响及细胞内第二信使cAMP、IP3的变化。并研究磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536分别对视网膜色素上皮细胞生长及分泌TGF-β2影响,分析RPE细胞分泌TGF-β2的相关胞内信号传导途径,进一步探讨RPE在近视发生发展中的呈递作用。方法选取健康3周龄花色豚鼠,麻醉处死后摘取眼球,采用组织消化法分离培养豚鼠RPE细胞,上皮细胞特异的角蛋白免疫组化染色鉴定,取第2-3代对数生长期的细胞用于后续实验。实验细胞于使用前均换无血清培养液培养24小时以使其同步化。1. ATRA组：用MTT法检测不同浓度(5×10-6M,10×10-6M,40×10-6M)ATRA对豚鼠RPE细胞增殖的影响。选取浓度为10×10-6M的ATRA作用于RPE细胞,分别于2h、4h、6h、8h、16h取上清培养液用ELISA方法检测TGF-β2的分泌量；于0min、5min、30min、2h、6h收集细胞裂解液用ELISA和放射免疫的方法分别检测胞内cAMP和IP3的含量变化。2.磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536组：用MTT法检测不同浓度(5×10-6M,10×10-6M,15×106M,20×10-6M)U73122和(5×10-6M,10×10-6M,20x10-6M,50×10-6M)SQ22536对豚鼠RPE细胞增殖的影响。取浓度为1×10-5M的U73122、SQ22536作用于豚鼠RPE细胞,分别于2h、4h、6h、8h、16h用ELISA方法检测TGF-β2的分泌量。结果1. RPE细胞原代培养及鉴定：原代培养的豚鼠RPE细胞48小时后已贴壁生长,细胞含有丰富的色素。传代后色素减少,细胞近融合时形态近六角形。免疫组化角蛋白染色RPE细胞为棕黄色阳性反应。2. ATRA对豚鼠RPE细胞的影响MTT检测：40×10-6M的ATRA作用RPE细胞24h后,细胞生长明显受到抑制。5×10"6M和10×10-6M的ATRA对RPE细胞的生长的作用与对照组相比差异无显着性(P>0.05)。TGF-β2的检测：加入10×10-6MATRA后,TGF-β2的分泌量与对照组相比,2h、4h、6h明显升高,8h无显着差异,16h降低(P<0.05),呈随时间延长分泌量逐渐下降趋势。cAMP及IP3的检测：加入含10×10-6MATRA的培养液后,RPE胞内cAMP含量在30min和2h时升高(p＜0.05),5min、6h时与对照组相比无明显差别。而胞内的IP3含量在各时间点均显着降低(p<0.05),6h时降低最明显。3.磷脂酶C抑制剂U73122和腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536对豚鼠RPE细胞的影响MTT检测：5×106M浓度U73122作用豚鼠RPE细胞24h后,MTT结果与对照组无显着差异(p>0.05),浓度>5×10-6M时均明显低于对照组(p<0.01)。并随浓度的增OD值降低越明显。而SQ22536组RPE细胞生长无明显变化(p>0.05)。TGF-β2的检测：加入1×10-5M U73122后,TGF-β2的分泌量除2h无显着差异外,余各时间点均较对照组明显增加(P<0.05)；而SQ22536组对RPE细胞分泌TGF-β2在2h,4h,6h,16h无明显影响(p>0.05),8h时分泌量降低(P<0.05)。结论1.较高浓度的ATRA及U73122对豚鼠RPE细胞的增殖有抑制作用,而SQ22536对RPE细胞生长无明显影响。2.10×10-6M的ATRA作用于RPE细胞后,TGF-β2的分泌量短期升高,随时间延长而降低。3.10×10-6M的ATRA作用于RPE细胞后,IP3含量显着降低,cAMP含量在观察时间段中期有升高,后又降至对照组水平。4.U73122可使RPE细胞分泌TGF-β2增加,而SQ22536对RPE TGF-β2的分泌无明显影响。研究结果提示RPE细胞的增殖与第二信使IP3有关。ATRA对RPE细胞分泌TGF-β2的影响可能与第二信使IP3的降低有关。而抑制磷脂酶C信号通路后,RPE细胞分泌TGF-β2增加,进一步证实了豚鼠RPE细胞分泌TGF-β2与磷脂酶C信号通路有关。
崔极哲[4]2005年在《转化生长因子-β1基因修饰的人视网膜色素上皮细胞移植治疗老年性黄斑变性的实验研究》文中研究说明人转化生长因子-β1(hTGF-β1),在多种组织细胞的增殖分化、间质形成、组织损伤修复、骨质再生、胚胎发育以及免疫调控中起着重要的作用。目前已经证实TGF-β1 是一种强效免疫抑制因子,其功能比环孢素A 还要强大约104-106倍。本研究以hTGF-β1 为目的基因,构建了TGF-β1 真核表达载体,并成功地转染到体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞,建立了稳定表达TGF-β1的基因工程化RPE 细胞。将TGF-β1 的基因工程化RPE 细胞移植到兔视网膜下腔,移植术后通过眼底照相、眼底荧光造影、组织病理等方法对移植细胞的存活状态、TGF-β1 表达情况及宿主对移植细胞的排异情况进行观察。结果显示,与实验对照组比较,TGF-β1 基因修饰的RPE 细胞在兔视网膜下腔可以较长期存活,无明显荧光渗漏,移植区域脉络膜层无明显的组织细胞浸润。上述结果表明hTGF-β1 基因修饰的RPE 细胞异体移植是可行的,并有望成为老年性黄斑变性等RPE 细胞变性性疾病的一种有效的治疗手段。
武慧敏[5]2007年在《辛伐他汀抑制牛视网膜色素上皮细胞增生的实验研究》文中认为增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是指在孔源性视网膜脱离或视网膜复位手术后，由于玻璃体腔和视网膜表面广泛纤维增生膜收缩，最终形成牵拉性视网膜脱离的病变。是裂孔源性视网膜脱离手术失败最常见的原因，也是外伤导致视力丧失的重要原因。PVR的发病机制目前还未完全清楚，但其发生发展的病理过程已经明确。PVR作为一个损伤修复过程，其形成过程可划分为炎症期、细胞增生期和瘢痕期3个时期。参与PVR增生的细胞主要是视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)和视网膜神经胶质细胞，其在细胞因子及细胞外基质等刺激因素的作用下，增生、迁移至视网膜表面及玻璃体腔，附着于一切可能的界面，并发生收缩。RPE细胞的主要作用为合成胶原及其他细胞外基质，能够收缩产生牵拉力，从而造成视网膜脱离。所以RPE细胞在PVR的发生过程中起着至关重要的作用。因此，PVR的药物治疗也多从RPE细胞入手，通过抑制RPE细胞的移行及增生来达到治疗目的。辛伐他汀(simvastatin)是一种3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A(3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制药，目前临床用于治疗高胆固醇血症，具有良好的治疗效果。近年来，有关HMG-CoA还原酶抑制药物的研究日益增多，实验表明此类药物可抑制多种细胞增生。本实验旨在观察辛伐他汀对体外培养牛视网膜色素上皮细胞(bovine retinal pigment epithelium，bRPE)增生作用的影响，从而探讨一种新的玻璃体视网膜增生性疾病的药物治疗方法。材料与方法1．细胞培养取健康无眼疾的小牛眼球，小牛处死后立即取眼球，4小时内分离RPE细胞进行培养：无菌条件下，沿角巩膜缘后5mm处环形剪开眼球壁，弃去眼前节和玻璃体，用显微镊仔细分离视网膜神经上皮层自视盘处将其剪除，暴露RPE层，用灭菌PBS冲洗眼杯3次，滴加0.25％胰蛋白酶溶液，置于37℃孵育箱消化30～60分钟。取出眼杯，用吸管反复吹打RPE面使细胞脱落，收集RPE细胞悬液，移入无菌离心管中，加入含20％胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化；以1000r／min离心5min；弃去上清液，加入含20％胎牛血清的DMEM高糖培养液，反复吹打制成细胞悬液，接种于25ml培养瓶中，置于5％CO_2、饱和湿度的37℃细胞培养箱中培养；每3～5天换一次培养液，直至细胞融合传代。选第3～6代细胞用于实验，细胞鉴定采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(SABC)法，一抗为鼠抗人细胞角蛋白单克隆抗体，行免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。2．实验药物辛伐他汀3．细胞形态学观察倒置显微镜下观察RPE细胞形态，并照相记录。4．RPE细胞体外药物敏感试验--MTT试验选第3～6代细胞用于实验，调整细胞密度为4～5×10~4／ml，接种于96孔培养板中，每孔接种200μl。孵育24h细胞贴壁后进行分组实验，对照组单纯用含10％胎牛血清的DMEM培养液，实验组根据加入辛伐他汀浓度的不同分为4组(浓度分别为1μmol／L，5μmol／L，10μmol／L，50μmol／L)，每个浓度设3个复孔，分别培养24h、48h、72h，每孔加入MTT 20μl(5mg／ml)，继续培养4小时，弃去上清液，加入DMSO 150μl，震荡均匀，15分钟后在酶联免疫检测仪490nm处测A值。5．统计学分析实验数据以均数±标准差((?)±s)表示，应用SPSS10.0统计软件中One-way ANOVA进行检验。结果1．RPE细胞形态观察及鉴定原代培养的RPE细胞呈不规则形或扁平多角形，可见清晰的透明细胞核，胞浆内富含黑色素颗粒。1～2周后细胞渐融合，细胞浆变淡，细胞呈不规则形。传代2～3次后黑色素颗粒显着减少或消失，细胞呈梭形及不规则形。传代细胞铺满约需3～5天。角蛋白免疫化学染色胞浆呈特异性棕黄色，呈阳性反应。2．辛伐他汀对细胞形态学的影响倒置显微镜下观察，对照组可见对照组细胞呈贴壁生长，悬浮细胞少，细胞呈梭形或多角形，排列均匀。实验组观察发现细胞数有随浓度增加而相对减少的趋势。细胞形态不规则，体积缩小，悬浮细胞增多。3．MTT实验结果不同浓度的辛伐他汀作用于RPE细胞不同时间后，细胞生长受到不同程度的抑制。MTT法测得各实验组及对照组吸光度A值显示，随着药物浓度的增加和时间的延长，细胞A值减少，存活率降低。不同作用时间各实验组与对照组之间吸光度比较有统计学意义的药物剂量分别为：24h为5μmol／L有统计学意义，48h为5μmol／L有统计学意义，72h为1μmol／L有统计学意义。细胞增生抑制率随浓度增加和时间延长而升高。在一定浓度范围内，药物的抑制作用有浓度-时间依赖关系。结论辛伐他汀能够抑制体外培养的牛视网膜色素上皮细胞增生，且这种抑制作用呈剂量依赖性，可能为药物防治增生性玻璃体视网膜病变提供新方法。
杨娟[6]2004年在《视网膜色素上皮细胞增殖与抑制实验及移植研究》文中进行了进一步梳理目的:通过体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelium,hRPE)来研究转化生长因子β1、血小板源性生长因子对人类视网膜色素上皮细胞增殖的作用,并探索用内路法进行兔RPE细胞视网膜下腔的移植。方法:取自愿者贡献的意外事故成年眼球,用0.25%胰酶消化获取人RPE细胞、15%胎牛血清的DMEM培养液培养,细胞接近融合状态时进行传代培养。取第2代hRPE用转化生长因子β1、血小板源性生长因子及PDGF+ TGFβ1进行增殖试验,用细胞计数和MTT法定量测定细胞量。同样方法体外培养有色素兔视网色素上皮细胞,将体外传代培养的第2-3代细胞悬液用微量注射器通过内路法移植入受体视网膜下腔。结果:hRPE原代细胞镜下为圆形,大小不一,内含较多的色素颗粒,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后第3天增殖速度明显加快,至4-5天即可基本融合,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见胞浆突起,细胞核多呈不规则形,核内以常染色体为主。细胞质内细胞器丰富,粗面内质网多,滑面内质网也较多,分布于大量糖原颗粒中。黑色素小体散在或集中分布于胞浆内,细胞浆内可见不同成熟阶段的黑色素小体。在血清的协同作用下50ng/mlPDGF明显刺激hRPE生长,但这种细胞的增殖被10ng/ml的TGFβ1所阻滞。术后4周无色素兔视网膜下腔可见供体RPE细胞,电镜观察证实存活<WP=4>的供体RPE细胞仍有合成色素功能。结论:已基本建立人视网膜色素上皮细胞体外原代细胞培养方法,hRPE细胞在体外呈现出旺盛的分裂能力和代谢功能。第3代培养的视网膜色素上皮细胞基本保留了原代细胞的生物学特性,如合成黑色素颗粒的特性。10ng/ml的 TGFβ1能阻滞由PDGF引起的人视网膜色素上皮细胞的增殖作用,TGFβ1抑制hRPE增殖的作用机理仍需进一步研究。内路法可以将供体RPE细胞成功移植在受体眼视网膜下腔,为RPE移植的实验室研究提供一条可借鉴的途径。
王文丽[7]2013年在《海昆化瘀片调控RPE诱导的增生性玻璃体视网膜病变TGF-β表达的研究》文中研究表明目的：转化生长因子(Transforming growth factor,TGF-β)具有调控细胞生长、分化、黏附、迁移、胞外基质产生和纤维化等系列生物作活性用,是增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)病理过程中最关键的促增生因子。本实验拟通过玻璃体腔注射视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)诱导PVR动物模型,观察海昆化瘀片对PVR动物模型玻璃体液中TGF-B浓度的影响,以探讨其对TGF-β表达的调控作用,为进一步明确海昆化瘀片的防治作用提供一定实验依据。方法：采用玻璃体腔注射0.1ml RPE细胞悬混液诱导PVR动物模型,将动物分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组、海昆化瘀片高、中、低剂量治疗组,海昆化瘀片治疗组连续给予不同剂量混悬液灌胃治疗28天,阳性对照组给予道诺霉素一次性玻璃体腔注射,通过眼底观察判定眼底增生级数、常规组织病理学观察分析增生膜截面积及截面增生细胞数、免疫组化染色观察分析增殖细胞核抗原、酶联吸附法(ELISA)检测玻璃体液中TGF-B.bFGF浓度。结果：(1)PVR动物模型的判定：空白对照组与模型对照组眼底增生级数、增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性信号积分光密度(IOD)比较均有极显着差异(P<0.01)。(2)眼底增生级数：给药后第7天模型对照组阳性对照组、高剂量治疗组比较有显着差异(P<0.05),而与中、低剂量组比较无差异(P>0.05)；给药后第14天模型对照组与阳性对照组、海昆化瘀片高、中剂量治疗组比较有极显着差异(P<0.01),与低剂量组比较有显着差异(P<0.05)；给药后第21天模型对照组与阳性对照组比较有显着差异(P<0.05),与海昆化瘀片高剂量治疗组比较有极显着差异(P<0.01),与中、低剂量治疗组比较无差异(P>0.05)；给药后第28天模型对照组与阳性对照组、海昆化瘀片高剂量治疗组比较有极显着差异(P<0.01),与中剂量治疗组比较有显着差异(P<0.05),与低剂量治疗组比较无差异(P>0.05)。(3)增生膜截面积与截面增生细胞数：模型对照组与各用药组比较有极显着差异(P<0.01)。(4)增殖细胞核抗原：模型对照组PCNA的IOD值与阳性对照组、海昆化瘀片高、中剂量治疗组比较有极显着差异(P<0.01)与低剂量治疗组比较无差异(P>0.05)。(5)TGF-B:模型对照组与阳性对照组、海昆化瘀片高、中剂量治疗组比较有极显着差异(P<0.01),与低剂量治疗组比较有显着差异(P<0.05)。(6)bFGF:模型对照组与阳性对照组、海昆化瘀片高、中剂量治疗组比较有极显着差异(P<0.01),与低剂量治疗组比较有显着差异(P<0.05)。结论：本实验通过玻璃体腔注射RPE细胞悬混液成功诱导PVR动物模型,研究发现海昆化瘀片能减轻PVR动物模型眼底增生程度、抑制增生膜的形成及膜内细胞增生,并通过抑制模型动物视网膜组织中PCNA的表达、降低玻璃体液中TGF-B、bFGF浓度阻止视网膜、玻璃体增生,从而发挥其防治PVR的作用。
杜颖华[8]2013年在《姜黄素和维甲酸抑制人视网膜色素上皮细胞移行和重塑人视网膜色素上皮细胞外基质的研究》文中提出增殖性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）是在玻璃体和视网膜前后表面形成纤维增殖膜，由于膜的收缩和牵拉引起视网膜脱离（retinal detachment，RD）为特征的一类眼病。PVR是孔源性视网膜脱离最严重的并发症之一，其发展过程包括早期的细胞移行，细胞增殖，细胞外基质的重塑和纤维细胞膜的形成和收缩，引起视网膜结构明显的变形，造成视网膜复位手术的失败，最终导致严重的视功能丧失或失明。PVR也是严重眼外伤、血管性视网膜病变的常见并发症。视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞作为最关键细胞，贯穿于PVR发生、发展的所有过程。PVR病理上分为叁个阶段：第一阶段RPE等细胞移行至视网膜前和视网膜下，开始增殖；第二阶段包括RPE等细胞大量增殖和细胞外基质的重塑；最后阶段纤维增殖膜形成并收缩导致RD。过多地纤维细胞膜的增殖被认为是伴随RPE细胞参与和细胞外基质重塑的一种创伤修复过程。一旦孔源性视网膜脱离中的RPE细胞从基底膜上播散下来，它的性质就变得像体外培养的成纤维母细胞一样活跃。临床上一直沿用的治疗PVR的方法是玻璃体视网膜手术，手术技术的飞速发展提高了视网膜复位率，但术后往往由于再次发生PVR，导致RD复发，严重影响患者视功能。因此，选择安全有效的药物早期防治PVR是一项既迫切又有广泛前景的任务。现在，无论在临床上还是动物实验中，药物防治PVR日益成为研究的热点。迄今为止眼科界所研究用于PVR的药物不下几十种，这些药物主要为西药，虽然抗增殖作用强大，但作用单一，且可能存在一定细胞毒性，一直未能应用于临床。中药具有药源丰富、作用多样且毒副作用小等众多优点，从理论上有很好的应用前景。一种从植物中提取的天然中药姜黄素进入我们视线。姜黄素是从植物姜黄（Curcuma longa）中提取的一种天然有效成分。它具有抗癌性、抗炎性、抗血管化、抗氧化、抗风湿和抗转移等多种功效，在内科及抗肿瘤疾病中研究颇多，但是在眼科领域国内外报道为数不多。同时，近年来的实验研究多限于针对RPE细胞自身增殖的研究，对于RPE和其生物活性息息相关的微环境----细胞外基质的相关特性目前还不十分明确或者报道的较片面。因此，本课题分别通过体外和体内实验研究姜黄素这种中药对人RPE细胞移行的抑制作用和对人RPE细胞外基质的重塑的影响，并选取了先前研究中防治PVR效果显着的药物----维甲酸作为对照研究。积极从细胞外基质方面，探讨姜黄素和维甲酸这两种药物如何来阻止RPE细胞产生PVR的行为，为PVR防治提供新思路。第一部分姜黄素和维甲酸抑制人视网膜色素上皮细胞移行的体外和体内实验研究目的：研究不同剂量的姜黄素和维甲酸对体外培养的人RPE细胞移行的影响，评价姜黄素和维甲酸在人RPE细胞移行中的作用，并筛选出这两种药物抑制人RPE细胞移行的最佳药物浓度。将最佳浓度的姜黄素和维甲酸分别作用于RPE细胞诱导的兔眼PVR模型，评价两种药物对RPE细胞在体内侵袭能力的影响。方法：采用胰蛋白酶消化法体外分离、培养人RPE细胞，免疫荧光细胞化学法进行细胞鉴定。取第4~6代生长状态良好的RPE细胞用于实验。以MTT法检测不同浓度姜黄素（0、0.25×10~(-5)、0.5×10~(-5)、1.0×10~(-5)、2.0×10~(-5)、4.0×10~(-5)M）和不同浓度维甲酸（0、10-6、10~(-5)、10-4、10-3M）作用48h后对人RPE细胞增殖的影响。通过计算48h作用时间后姜黄素和维甲酸的半数抑制率(the half maximal inhibitory concentration,IC50)。筛选合适浓度的姜黄素和维甲酸作用人RPE细胞，分别通过划痕实验，transwell侵袭实验，3D胶原胶收缩实验和体内RPE细胞的侵袭实验，探讨姜黄素和维甲酸在人RPE细胞移行中的作用。结果：初分离的人RPE细胞呈球形，多数细胞胞质中布满黑色素颗粒，在培养48～72h内贴壁，培养后7d细胞达融合，传代细胞24h贴壁。传至第4代细胞黑色素颗粒明显减少，免疫细胞荧光化学染色法提示细胞S-100抗原和角蛋白（cytokeratinAE1/AE3）抗原均表达阳性。姜黄素和维甲酸的IC-550分别是：1.2×10M和10-2.77M。划痕实验中：0、10-6、10~(-5)和10-4M的维甲酸和0、0.25×10~(-5)、0.5×10~(-5)、1.0×10~(-5)M的姜黄素分别作用于人RPE细胞，维甲酸和姜黄素对细胞的迁移均有抑制作用，且呈浓度依赖性；transwell细胞侵袭实验中：0、10-6和10-5M的维甲酸和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黄素分别作用于人RPE细胞48h，维甲酸和姜黄素对细胞的侵袭均有抑制作用，且呈浓度依赖性；3D胶原胶收缩实验中：0、10-6和10-5M的维甲酸和0、0.25×10-5和0.5×10-5的姜黄素分别被加入含有2×105RPE的胶原胶的混合物中，连续观察96h，维甲酸和姜黄素对胶原胶的收缩均有抑制作用，且呈浓度依赖性；RPE细胞体内侵袭实验中：0、0.5×10-5M姜黄素和10-5M维甲酸各100μl和100μl含2×106第6代RPE混合液（共200μl）分别注入兔眼玻璃体腔，连续观察4周。与对照组比较，姜黄素和维甲酸能显着地抑制PVR的形成。结论：通过体外培养的方法可获得大量人RPE细胞，用于体外和体内实验研究；结合MTT实验、划痕实验、transwell侵袭实验、3D胶原胶的收缩模拟实验和RPE细胞体内侵袭实验数据，0.5×10-5M的姜黄素和10-5M的维甲酸对体外培养和注入兔眼内的人RPE细胞的移行能力有显着地抑制作用，并且48h的时间观察点被作为合适的实验条件确定下来，将应用于进一步的实验。第二部分姜黄素和维甲酸对体外培养的人视网膜色素上皮细胞外基质和粘附分子mRNA水平的影响目的：通过观察姜黄素和维甲酸对体外和体内人RPE细胞移行的影响，应用基因芯片和实时定量PCR（real-time PCR）检测姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子mRNA表达的影响，探讨姜黄素和维甲酸影响人RPE细胞外基质重塑的因素及作用机制。方法：选取第9代生长状态良好的人RPE细胞用于本研究。通过人的细胞外基质和粘附分子PCR芯片技术描述0.5×10-5M的姜黄素和10-5M的维甲酸干预后人RPE（1×107）48h后细胞外基质和粘附分子基因表达图谱。并与不加任何药物的空白对照组进行比较。结果：与对照组比较，84个被检测的基因中，与姜黄素相关的17个基因的mRNA显着下调，10个显着增加（P <0.05）；与维甲酸相关的有24个基因，其中20个基因的mRNA显着下调，4个显着增加（P <0.05）。结论：姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子的mRNA的表达影响是显着的，有选择性的，并有类似的作用机制。这两种药物共同抑制基质金属蛋白酶(Matrix Metallo Preteinases，MMP)，如MMP1，MMP2，MMP9；大多数的胶原蛋白；纤粘连接蛋白1（Fibronectin1）和层粘连蛋白等；共同增强MMP3和一些整合素的表达。相比较而言，在调节MMP3、MMP9和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（Tissue Inhibitor ofMetalloproteinase1, TIMP1）的mRNA表达上，姜黄素比维甲酸的作用更强，更系统化。第叁部分姜黄素和维甲酸对体外培养的人视网膜色素上皮细胞外基质和粘附分子蛋白质水平的影响目的：通过观察姜黄素和维甲酸对体外和体内人RPE细胞移行能力的影响和细胞外基质基因的表达，应用western blotting测定姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子中部分相应蛋白质表达的影响，探讨姜黄素和维甲酸重塑人RPE细胞外基质的影响因素及作用机制，探讨蛋白质与基因的表达是否一致。方法：选取第9代生长状态良好的人RPE细胞用于本研究。通过western blotting描述0.5×10-5M的姜黄素和10-5M的维甲酸干预人RPE（1×107）48h后细胞外基质和粘附分子蛋白质的表达。并与不加任何药物的空白对照组进行比较。结果：与对照组比较，0.5×10-5M的姜黄素显着地抑制纤维粘连蛋白1，MMP1，MMP2和MMP9蛋白质的表达，增强MMP3蛋白质的表达；而10-5M的维甲酸显着地抑制纤维粘连蛋白1，MMP1，MMP2，MMP9，MMP14，整合素ITGAM和ITGB2，增强了MMP3和钙粘连蛋白-E蛋白的表达；姜黄素和维甲酸比较，姜黄素对MMP3蛋白质表达的作用较强。结论：姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子的蛋白质表达影响是显着的，有选择性的，并有类似的作用机制。这两种药物共同抑制MMP1，MMP2，MMP9，纤粘连蛋白1（Fibronectin1）等；共同增强MMP3的表达。姜黄素和维甲酸对人RPE细胞外基质和粘附分子蛋白质的调节与对基因的调节是一致的。第四部分姜黄素对体外培养的人视网膜色素上皮细胞内钙离子的影响目的：观察人视网膜色素上皮细胞内钙离子的变化，探讨不同浓度姜黄素干预后，在人视网膜色素上皮细胞和其基质间可能存在的相关信号转导作用机制。方法：对各组第6代人RPE细胞进行5μM Fluo-3负载30min，姜黄素分别以0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M浓度干预人RPE细胞，利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定各组RPE细胞内早期钙离子的荧光变化。结果：LSCM检测结果：0、0.25×10-5、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5M姜黄素组RPE细胞内均有钙荧光。空白对照组钙荧光强度明显低于姜黄素各组，细胞内钙离子的荧光强度与姜黄素的刺激浓度呈正相关（r=0.922, P＜0.05）。结论：体外培养的人RPE细胞经不同浓度姜黄素干预后，较空白对照组，早期细胞内钙离子荧光强度明显增加。结合四部分的实验数据，我们推断当细胞受到姜黄素外界信号刺激时，细胞内钙离子浓度能迅速增加，继而传递信号，重塑细胞外基质，引起细胞的生物学效应。
刘庆淮[9]2004年在《糖尿病视网膜氧化损伤及细胞因子表达机制的初步研究》文中研究表明糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy, DR)是视网膜长期暴露于高血糖状态下，血管内皮发生功能障碍而导致的微血管损伤引起的微血管病变。微血管损伤包括血管基底膜增厚、血管-视网膜屏障缺损和血管周细胞丧失，而高血糖的毒性作用是糖尿病视网膜病变最初发生的扳机点。早有文献报道，高血糖产生过多的活性氧分子(Reactive Oxygen Species, ROS)，使蛋白质糖化、细胞膜和细胞质内的不饱和脂肪酸氧化，这些氧化产物产生的细胞毒作用能损伤血管内皮细胞，并且是糖尿病微血管损伤的主要原因。同时，高血糖还可以使另一种活性氧分子NO在视网膜中产生增多，NO是氧分子和L-精氨酸在一氧化氮合酶的催化下产生的，一氧化氮合酶有叁种同工酶，分别是主要存在于中枢和外周神经细胞中的神经型一氧化氮合酶(NOS Ⅰ或nNOS)、在炎症或损伤等刺激下可存在于多种细胞内的诱导型一氧化氮合酶(NOS Ⅱ或iNOS)以及主要存在于血管内皮细胞内的内皮型一氧化氮合酶(NOS Ⅲ或eNOS)。各种类型一氧化氮合酶产生的NO其生理或病理作用各不相同，链脲佐菌素所致糖尿病大鼠的视网膜及其高浓度葡萄糖培养的牛视网膜内皮细胞NO含量增高、iNOS表达增加，并且NO可使血管-视网膜屏障通透性增高，提示作为活性氧分子重要组成部分的NO也参与了糖尿病视网膜微血管损伤的病理过程。但是中长期糖尿病视网膜中的NO及其合酶在视网膜损伤中的作用目前还没有报道。 nNOS来源的NO可以调节血管紧张度、调节血流量可能有助于减轻血管的高灌注状态，提示nNOS来源的NO对视网膜血管损伤可能具有保护作用。南京医科人学博}_学位论文 作为气体的NO会很快弥散，因而直接测定组织内的NO十分困难。组织中的NO气体可以被超氧阴离子(o:)氧化变成有细胞毒作用的过氧化峭酸盐(ONOO口)，ONOO口修饰蛋白质中的酪氨残基生成峭基酪氨酸(NT)，应用免疫组化或ELI SA方法可以间接反应组织中NO含量和02一的含量，间接反应组织中氧化应激的损伤情况。 另一方面，视网膜的损伤会释放出大量细胞因子，如TGF一口:、VEGF、PDEF、bFGF等等。这些细胞因子促使新生血管生成，新生血管极易发生破裂、出血，是糖尿病视网膜病变视力丧失的重要原因。目前已知vEGF是新生血管形成的关键因素，但是其他细胞因子也起重要作用。有研究显示，TGF一日:在DR新血管形成过程中也起重要作用，但现有报道为数不多，并有结论相反的报道。同时，关于TGF-口:在DR新生血管形成过程中的作用机制，尚无研究报道。 为了进一步研究NO和NOS在糖尿病视网膜损伤中的作用，探询TGF一日:在新生血管形成过程中的作用和作用机制。我们设计并进行了以下实验。 1、链脉佐菌素制备大鼠糖尿病模型，注射生理盐水作为对照，分别取正常对照及模型制备成功后大鼠视网膜标本进行以下实验。 2、利用免疫组化及图象处理技术，分析硝基酪氨酸在视网膜中的分布及含量。 3、利用免疫组化及Rl，一PCR技术，测定iNOS及nNOS的蛋白及mRNA表达。 4、用Westem blot方法坝，{定TcF一口:的表达，RT-PCR测定其受体TGF一口Rl及TGF一口R 11的表达。 结果发现:l、链豚佐菌素(65mg/kg)腹腔注射一次，制备糖尿病大鼠模型，南京医科人学博卜学位论文链朦佐菌素腹腔注射后，大鼠直至实验结束，血糖均维持在(l 6.65mmol几)以上，证明造模成功。 糖尿病大鼠视网膜内的NT在糖尿病2、4、SW大鼠的表达升 高，但阳性细胞只分布于神经节细胞层，提示糖尿病大鼠的视网 膜损伤首先发生在神经节细胞层。糖尿病20W的大鼠NT表达量 明显增高，并且阳性细胞遍布视网膜全层，显示随糖尿病病程进 展视网膜氧化损伤进行性加重，NO产生增多。 和对照相比，糖尿病Zw大鼠的iNOS表达增加，nNOS表达 下降，糖尿病20W大鼠的iNOS进一步增加，而nNOS几乎消失， 提示糖尿病大鼠视网膜内NO产生增多和nNOS表达下降与iNOS 表达升高有关。 糖尿病大鼠视网膜内TGF一口:随糖尿病进展表达增加，其受体 TGF一口Rl的表达和对照组相比无显着变化，而TGF一日Rn的表 达显着性增加。提示TGF一日:在DR形成过程中有重要作用，并 有可能通TGF一口Rn型受体起作用。 为进一步阐明TGF一日:在糖尿病视网膜病变形成中的作用，我们又分别收集了临床上糖尿病不伴有眼底改变与糖尿病伴有视网膜病变患者的前房液标本，以及无糖尿病患者的前房液标本作为对照，用ELISA方法测定了TGF一吕:和VEGF的含量。 结果发现，和对照相比糖尿病患者眼前房液中VEGF的含量均显着增加，并且随着糖尿病视网膜病变的进展而增高;而糖尿病无眼底改变患者前房液中TGF一口:含量与正常相比无明显变化，单纯型糖尿病视网膜病变患者的TGF一口:含量下降，伴有增生型的视网膜病变患者TGF一日:含量升高。提示TGF一口:和vEGF在糖尿病视网膜新生血管的发病过程中起协同作用。南京医科人学博卜学位论文 视网膜损伤是糖尿病视网膜病变的基础和前提条件，早期发现、及时治疗是防止糖尿病视网膜病变产生、防止糖尿病视网膜病变病人视力丧失的有效?
丁静文[10]2006年在《新西兰白兔自体Schwann细胞视网膜下移植的实验研究》文中指出第一部分Schwann细胞体外纯化培养【目的】探索一种有效的Schwann细胞纯化培养方法,为今后体外获取高纯度高活性的Schwann细胞视网膜下移植治疗视网膜变性疾病奠定实验基础。【方法】采用改进的坐骨神经组织块反复种植方法分离纯化Schwann细胞。相差显微镜形态学观察、Schwann细胞胶质特异性标志蛋白S-100免疫细胞化学染色进行细胞纯度鉴定。【结果】形态学连续观察及S-100间接免疫荧光、免疫酶染色显示Schwann细胞的纯度达95%。【结论】本实验研究的Schwann细胞纯化培养方法所获细胞纯度高、数量多,可用于视网膜变性疾病的治疗研究。第二部分自体Schwann细胞视网膜下移植【目的】建立新西兰白兔视网膜下移植的实验模型,观察自体Schwann细胞在视网膜下腔短期存活状态。【方法】Schwann细胞分别取自8只新西兰白兔,纯化培养后制成细胞悬液;采用外路法在8只右眼中进行自体Schwann细胞视网膜下腔移植,左眼均为对照眼不施加任何干预因素;观察随访6周即对术眼作组织病理学检查。【结果】自体成功移植4只兔眼,组织学检查显示Schwann细胞在视网膜下腔存活,未发现淋巴细胞和巨噬细胞浸润,移植区周围视网膜结构无明显受损。
参考文献：
[1]. 转化生长因子β_2对培养的兔视网膜色素上皮DNA合成增殖影响的研究[D]. 孙堂胜. 福建医科大学. 2003
[2]. 氯离子通道ClC-2在人视网膜色素上皮细胞增殖、迁移中的作用及对PVR形成的影响[D]. 张文松. 吉林大学. 2007
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[4]. 转化生长因子-β1基因修饰的人视网膜色素上皮细胞移植治疗老年性黄斑变性的实验研究[D]. 崔极哲. 吉林大学. 2005
[5]. 辛伐他汀抑制牛视网膜色素上皮细胞增生的实验研究[D]. 武慧敏. 郑州大学. 2007
[6]. 视网膜色素上皮细胞增殖与抑制实验及移植研究[D]. 杨娟. 福建医科大学. 2004
[7]. 海昆化瘀片调控RPE诱导的增生性玻璃体视网膜病变TGF-β表达的研究[D]. 王文丽. 成都中医药大学. 2013
[8]. 姜黄素和维甲酸抑制人视网膜色素上皮细胞移行和重塑人视网膜色素上皮细胞外基质的研究[D]. 杜颖华. 河北医科大学. 2013
[9]. 糖尿病视网膜氧化损伤及细胞因子表达机制的初步研究[D]. 刘庆淮. 南京医科大学. 2004
[10]. 新西兰白兔自体Schwann细胞视网膜下移植的实验研究[D]. 丁静文. 福建医科大学. 2006
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