查艳萍[1]2002年在《抗血小板多肽基因在大肠杆菌中的克隆和表达》文中进行了进一步梳理血小板在急性冠脉综合征中起着重要作用[1]。血小板破裂释放出大量的血栓源性复合物，血栓源性复合物激活血小板，产生凝血阶联反应。糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂是一类全新的抗血小板药物。血小板Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂阻断血小板激活的最后通路,且可以减少急性冠脉综合征或经皮冠状动脉介入术后血栓形成的可能 [2]。本实验目的是通过基因工程的方法，人工合成抗血小板多肽，并在体外实验中观察其抗血小板活性，为抗血小板药物的研制提供了一个新的方向。本实验主要方法和结果如下：1、抗血小板多肽的基因克隆重组抗血小板多肽分子由谷胱甘肽－S－转移酶（GST）通过一可被Xa裂解的序列结合而构成。含有12个氨基酸，其中Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸序列的，可抑制血小板GpⅡb/Ⅲa受体和纤维蛋白原结合。重组抗血小板多肽的DNA序列是根据欲合成的氨基酸序列逆向翻译后应用DNA合成仪合成的，目的基因共有36bp，其中包括两侧的BamHⅠ和XcoI限制性内切酶的识别位点。经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳以及DNA自动测序仪测定结果提示，合成的DNA片段其序列与设计要求完全一致，且已正确地插入载体PGEX-4T-1 tac启动子下游的重组质粒。2、抗血小板多肽在大肠杆菌中的表达和纯化将纯化的目的基因DNA片段插入质粒pGEX-4T-1的BamHⅠ和XcoⅠ之间构成克隆质粒，并转染E.coli DH5α后进行培养用于质粒的扩增，抽提质粒后用DNA序列仪对其进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列完全正确。将纯化的目的基因DNA片段插入表达质粒pGEX-4T-1多克隆位点的BamHⅠ和XcoⅠ之间，与其中的编码GST序列的3′端相连接融合，构建重组质粒，转染E.coli DH5α构建阳性菌株。另外，也将不含目的基因的pGEX-4T-1转染E.coli DH5α用于对照研究。将转染后的菌株于含氨苄青霉素的LB培养液中进行培养，并加入IPTG在37℃条件下诱导6小时，将诱导后收集的细菌在冰浴中超声破菌后，取上清液用谷胱甘肽－琼脂糖珠悬液进行抽提纯化，得到纯化的融合蛋白。不含目的基因的转染菌表达的则为GST。表达产物经谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白的纯化后，经12%SDS－PAGE电泳鉴定，在分<WP=6>子量为26 000Da和25 556Da处蛋白条带分别表现为一条带，经凝胶光密度扫描，GST、GST-KGDX表达量分别占总菌体蛋白的49.54%,48.02%，纯度为95%。3、抗血小板多肽的活性测定抽取8名健康志愿者血液(在2周内未用过任何抗凝或对血凝系统有影响的药物)，用低温离心机（SORVALL RC 5C Plus）制备富含血小板的血浆（PRP），用血小板凝聚仪检测活性。全血流式细胞仪方法确定GST-KGDX的作用机制。结果显示：GST-KGDX融合蛋白抑制ADP诱导的人血小板聚集作用强于GST（P＜0.05或＜0.01）。全血流式细胞仪检测结果表明GST-KGDX和GST均能与GPIIb/IIIa受体特异性结合。GST-KGDX融合蛋白拮抗GPIIb/IIIa受体的作用强于GST（P＜0.05或＜0.01）。 结论： 通过生物工程技术构建的含有KGD基因序列的质粒可在大肠杆菌中高效表达。制备的多肽具有抗血小板作用,经流式细胞仪检测证明是通过拮抗GPⅡb/Ⅲa受体而起到抑制血小板聚集的作用。
穆瑞斌[2]2002年在《重组多功能抗凝多肽基因的大肠杆菌中的表达及活性测定》文中认为在由于血管成形术或动脉粥样斑块破裂及其它损伤因素所致血管壁损伤而引起的血栓形成过程中，血小板、纤维蛋白原和凝血酶起着非常关键的作用。目前防止血栓形成和发展的方法包括抑制血小板的活化、抑制凝血酶的活性、或者是增强纤溶系统的活性。本实验通过基因工程的方法，人工合成一种能同时表达抗血小板和抗凝血酶的多功能杂交分子，并在体外实验中观察其抗血小板和抗凝血酶的活性，为抗栓药物的研制提供一个新的方向。本实验分为叁个部分 ：（一）含多功能抗凝多肽基因片段的表达载体的构建：重组多功能抗凝多肽分子，它由谷胱甘肽－S－转移酶（GST）通过一可被Xa裂解的序列和重组抗凝多肽结合而形成。重组抗凝多肽含有31个氨基酸，由叁个功能部分组成：（1）Lys-Gly-Asp(KGD)氨基酸序列，可抑制血小板GpⅡb／Ⅲa受体和纤维蛋白原的结合；（2）纤维蛋白单肽A的7－16残基（FBA7－16），它是凝血酶的抑制剂。（3）水蛭素C末端的12肽，它可直接抑制凝血酶。编码重组抗凝多肽的DNA序列是根据欲合成的氨基酸序列逆向翻译后经人工合成，编码重组抗凝多肽的目的基因共有115bp，其中包括两侧的BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶的识别位点，此115个bp分成两个引物由上海生工公司的DNA合成仪合成（2OD），以上两套引物中有25个碱基互补，其互补之外的空缺部分通过PCR扩增补平得到两条互补的DNA双链。取样品用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定，可见一条清晰的条带，片段大小稍大于100bp。（二）多功能抗凝多肽基因表达载体的构建及表达将将纯化的目的基 因DNA片段插入质粒pUC18的BamHⅠ和EcoRⅠ之间构成克隆质粒，并转染E.coli DH5α后进行培养用于质粒的扩增，抽提质粒后用DNA序列仪对其进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列完全正确。将纯化的目的基因DNA片段插入表达质粒pGEX-5X-3多克隆位点的BamHⅠ和EcoRⅠ之间，与其中的编码GST序列的3′端相连接融合，构建重组质粒，转染E.coli DH5α构建阳性菌株。另外，也将不含目的基因的pGEX-5X-3转染E.coli DH5α用于对照研究。将转染后的菌株于含氨苄青霉素的LB培养液中进行培养，并加入IPTG进行诱导，将诱导后收集的细菌在冰浴中超声破菌后，取上清液用谷胱甘肽－琼脂糖珠悬液进行抽提纯化，得到纯化的融合蛋白。不含目的基因的转染菌表达的则为GST。应用SDS－<WP=6>PAGE电泳分别对该菌株的表达产物及应用亲和层析方法纯化后的产物进行鉴定，纯化后的融合蛋白的电泳条带，其大小约为30KD，纯度大于95%，较GST约大3KD。（叁）含多功能抗凝多肽的融合蛋白活性的测定1 抗凝血酶活性的测定抽取8名健康志愿者血液(在2周内内未用过任何抗凝或对血凝系统有影响的药物，每个活性部分均重复测定3次，取其平均值)，通过测定部分凝血活酶时间（aPTT）和凝血酶时间（TT）来测定样品的抗凝血酶活性；抗凝血酶的蛋白分解活性的测定则应用生色底物（Chromozym TH） 。同时测定等摩尔浓度的GST、水蛭素54－65和纤维蛋白单肽A作为对照。结果表明，GST和纤维蛋白单肽A对aPTT、TT均无延长作用，对凝血酶无抑制作用；水蛭素54－65则对aPTT、TT有一定的延长作用，而对凝血酶的蛋白分解活性则无抑制作用；而抗凝多肽则对aPTT、TT有显着延长作用，小剂量的融合蛋白就能对凝血酶的蛋白分解活性有显着抑制作用，随浓度的增加而增加。这表明其对凝血酶有明显的抑制作用，且其作用明显强于水蛭素54－65。2 抗血小板活性的测定用低温离心机（SORVALL RC 5C Plus）制备富含血小板的血浆（PRP），用比浊法在血液凝聚仪上测定在室温下加入ADP后4分钟内的血小板聚集率（以%表示）。结果表明融合蛋白对血小板聚集有明显的抑制效应，稍弱于RGD，同时也发现GST对血小板聚集有抑制效应，但要明显弱于融合蛋白。而水蛭素54－65和纤维蛋白单肽A则对血小板聚集无影响。本研究发现：（1）大肠杆菌中能够表达出较高产量的融合蛋白，且具有可溶性。（2）融合蛋白使aPTT、TT明显延长及凝血酶蛋白水解酶活性受到抑制。其抗凝血酶作用明显强于水蛭素的C未端12肽及FBA。表明二者发挥抗凝血酶的协同作用。（3）体外血小板聚集抑制作用融合蛋白强于GST，显示融合蛋白中GST与KGD序列具有协同抗血小板作用。（4）融合蛋白、KGD均能通过占据GPIIb/IIIa 受体而抑制血小板聚集。（5）GST对血小板的聚集也有轻至中度的抑制作用。本研究发现GST抑制血小板聚集还通过拮抗GPIIb/IIIa 受体的途径。总之，在本实验中我们通过基因重组的方法构建了一个能够在大肠杆菌中表达的杂交肽，它能够同时具有抗凝血酶和抗血小板作用。结果表明通过基因重组的方法设计一具复合抗凝功能的多肽是可行的。
查艳萍, 秦永文, 荆清, 穆瑞斌[3]2002年在《抗血小板多肽在大肠杆菌中的克隆和表达》文中进行了进一步梳理设计合成了两条编码KGDX (赖 甘 天冬 X)的寡核苷酸链 ,长度为 3 6个碱基对 ,两端分别为BamHI酶和XcoI酶切位点。将该基因插入原核高效表达载体PGEX 4T 1的tac启动子下游 ,获得重组质粒PGEX 4T 1KGDX ,转化大肠杆菌DH5a,3 7℃诱导使重组子表达。GST KGDX融合蛋白具有可溶性 ,产量为3 5mg/L培养基 ,表达量占菌体总蛋白 48 0 2 %。破碎菌体上清经谷胱甘肽 琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯度为95 %的重组蛋白。1 2 5I7E3竞争拮抗实验结果表明 ,GST无GPIIb/IIIa结合作用 ,GST KGD融合蛋白能代替 7E3竞争性地与GPIIb/IIIa受体特异性结合 ,从而抑制血小板聚集。其IC5 0值为 40 μmol/L。
朱美虹[4]2017年在《海洋芽孢杆菌抗肿瘤多肽的克隆表达及其生物活性研究》文中研究说明如今,癌症的发病率愈来愈高,癌症的控制和治疗已成为全球人们关注的焦点。药物治疗在肿瘤治疗中具有重要的价值,研发出疗效好,特异性高,副作用小的抗肿瘤药物是药物治疗的重点。抗肿瘤肽具有治疗效果好,作用部位准确,毒副作用低,分子量低,易于修饰和合成等优点,已经被应用到肿瘤的治疗和研究中,对癌症的治疗和控制具有重要的意义。本课题组前期从南极芽孢杆菌N11-8的代谢产物中分离得到了一种具有抗肿瘤活性的多肽PBN11-8,PBN11-8对多种肿瘤细胞具有细胞毒性,能抑制人肝癌细胞BEL-7402的迁移和侵袭,具有发展成为新型海洋抗肿瘤药物的潜力。本课题以抗肿瘤多肽PBN11-8为研究对象,通过PCR克隆技术得到编码PBN11-8的基因,确定出PBN11-8的基因序列。氨基酸序列分析结果显示PBN11-8准确的分子量为19.04kDa,等电点为5.37。由序列对比结果可知,PBN11-8是一种金属蛋白酶,福林-酚法测得多肽的酶活力为1172U/m L(0.85mg/m L),EDTA可以影响其蛋白酶活性,反应温度为50℃和pH为10.0时酶活力最高。PBN11-8在40℃以下性质稳定,碱性条件下酶活力高,是一种碱性蛋白酶,pH为7.0-8.0时性质稳定,易于储存。Mn2+可以提高PBN11-8的酶活力,相反的Hg2+可以抑制蛋白酶活性。利用重组表达技术,本课题组通过高表达大肠杆菌原核表达体系得到了重组PBN11-8。MTT结果显示,重组多肽具有较强的抗肿瘤活性,对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用。重组PBN11-8对人肝癌细胞BEL-7402,人卵巢癌细胞NIH:OVCAR-3,人大细胞肺癌细胞NCI-H460,人神经胶质瘤细胞U251和人肾透明细胞腺癌细胞786-0的IC50值分别为2.56,2.74,2.97,3.88和4.31μg/m L。重组PBN11-8可以显着改变BEL-7402的细胞形态,加药组细胞逐渐变圆聚团,胞间间隙明显。结晶紫粘附实验表明,重组多肽可以降低细胞的贴壁生长能力,进而影响细胞存活率。重组多肽蛋白酶活力为847U/m L(0.73mg/m L),酶活受EDTA影响较大,EDTA浓度为0.5mM,1.0mM和2.0mM时,剩余蛋白酶活仅为原蛋白酶活力的48.5%,13.2%和9.7%。重组PBN11-8最适反应温度为40℃,最适反应pH为10.0,40℃以下和中性条件下性质稳定。与天然多肽类似,Mn2+可以提高重组多肽的蛋白酶活力,Hg2+抑制作用最强。研究PBN11-8的相关性质对其后续的研究和应用有重要的价值,PBN11-8重组表达技术的建立,可以解决天然PBN11-8产量低的问题,这项研究为PBN11-8的进一步发展奠定了基础。
张耀方[5]2013年在《MFFP的构建及其对T2DM及血栓并发症模型小鼠的疗效学研究》文中研究指明糖尿病(diabetes mellitus, DM)是胰岛素绝对或相对分泌不足以及机体对胰岛素敏感性降低所引起的代谢紊乱疾病。其主要临床特征为血糖高、血脂高以及高粘血症等,被称为“百病之源”。随着人们生活水平的提高,近年来糖尿病发病率呈现逐年上升趋势。因此,寻找更好的糖尿病治疗药物、给药途径和治疗方法是学术界亟待解决的重要课题。糖尿病除了其本身的危害以外,往往还会带来一系列的并发症,这些并发症给患者带来了更为严重的后果。糖尿病患者死亡率最高的为心脑血管病变,约占80%,其中血栓的发病率为非糖尿病人的12倍。因此,在糖尿病的治疗中,找到一种治疗糖尿病同时又能有效预防和治疗心脑血管疾病血栓等并发症的治疗方法或药物具有十分重要的意义。胰高血糖素样多肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽。GLP-1具有促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌、减少食物摄取、减慢胃排空,以及抑制胰高血糖素分泌、刺激胰β细胞增殖、促进胰岛再生、抑制胰β细胞的凋亡等特殊功能。葡萄糖依赖性促胰岛素释放激素(glucose-dependent insμlintropic polypeptide, GIP)是由肠道K细胞合成和分泌的由42个氨基酸组成的多肽。具有促进第一时相胰岛素的分泌,改善胰岛素敏感性,刺激胰β细胞再生,延缓胰岛素清除等作用,对2型糖尿病具有良好的治疗效果。水蛭素(Hirudin, HV)是从医蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分离的一种酸性小分子蛋白,是目前发现的最好的凝血酶抑制剂,在预防和治疗人类心脑血管疾病方面有着非常显着的疗效,是治疗心脑血管疾病的首选良药。本研究通过定点突变技术将天然GLP-1基因内部的第8位的Ala替换成Ser,以抑制二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPP-Ⅳ)对其降解,并分别将第26位的Glu和第34位的Asp替换成Lys抑制胰蛋白酶的切割,克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶切割的GLP-1同源物,命名为重组口服长效GLP-1(recombinant oral long-acting GLP-1, rolGLP-1)。通过分子克隆手段将GIP第2位的Ala用Gly替换,获得抗DPP-Ⅳ切割的重组GIP (recombinant glucose-dependent insμlintropic polypeptide, rGIP)和重组HV(recombiant Hirudin,rHV)。将多拷贝的rolGLP-1基因分别与多拷贝的rGIP基因和单拷贝的rHV基因串联,分别获得4rolGG(4rolGLP-4GIP)、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV基因,将基因克隆到pET22b(+)载体后,分别获得表达载体pET22b(+) pET-22b(+)-5rolGZP-4GIP和pET-22b(+)-5rolGLP-HV,转化转化大肠杆菌BL21(DE3)。转化的工程菌株经IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析证明均实现了这些融合多肽的高效可溶性表达。对其诱导表达条件进行优化,结果表明：rolGG最佳表达条件为IPTG浓度为0.6mmol/L、温度为30℃下培养10h;4rolGG最佳表达条件为在IPPTG终浓度为0.2mmol/L,温度在37℃下诱导5h；5rolGLP-4GIP最佳表达条件为在IPTG终浓度为0.4mmol/L,温度在30℃下诱导10h;5rolGLP-HV最佳表达条件为IPTG终浓度为0.4mmol/L,温度在37℃下诱导5h；菌体裂解液经超生破碎后,上清经过Ni金属亲和层析进行纯化,分别获得纯度较高的rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽,为以后功能的验证奠定了良好基础。rolGG体外切割实验证明,rolGG在体外可以被修饰性胰蛋白酶切割成rolGLP-1和rGIP,切割率达到70%。采用STZ诱导的2型糖尿病小鼠模型分别对rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽的降血糖功能进行了检测。结果表明：与0.9%NaCl处理的阴性对照组小鼠相比,rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV等融合多肽均可有效地降低血糖和甘油叁脂、胆固醇的水平,并改善口服糖耐量,糖化血红蛋白以及胰岛素的分泌情况,并可有效改善糖尿病小鼠的多饮、多食和体重减轻等症状。采用凝血酶滴定法检测rolGLP-HV的抗凝活性,结果表明5rolGLP-HV的抗凝活性为105±1.7ATU/ml,证明5rolGLP-HV融合多肽具有HV的抗凝血功能。采用血栓模型对5rolGLP-HV融合多肽的抗血栓活性进行了检测。在昆明小鼠背部皮下注射角叉菜胶(50mg/kg)的同时给小鼠灌胃5rolGLP-HV融合多肽,观察小鼠尾部出现血栓的时间及血栓的相对长度。结果发现,灌胃5rolGLP-HV融合多肽的小鼠出现血栓的时间比对照延迟致32h,相对长度从37.5%缩减到25%,说明口服5rolGLP-HV融合多肽确实可以起到抗血栓作用。本研究为功能互补型双元促胰岛素rolGG以及多拷贝功能互补型双元促胰岛素4rolGG和5rolGLP-4GIP口服融合多肽类药物的研发提供了较完善的实验和理论依据,并为利用口服重组融合多肽来防治2型糖尿病的临床研究和应用奠定了基础。本研究结果亦表明,5rolGLP-HV融合具有明显的治疗和预防糖尿病及血栓的双重功能,有望研发成为治疗糖尿病和心脑血管病的双功能口服药物,为今后5rolGLP-HV融合多肽的临床前应用研究奠定了坚实基础。
杨宇峰, 周建, 耿旭, 吴自荣[6]2003年在《水蛭素-RGD序列融合基因在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达》文中认为水蛭素是从医用水蛭唾液腺中分离纯化的一种多肽,它是天然存在的最有效和专一的凝血酶抑制剂,可作为抗栓药物用于治疗血栓性疾病。它由多种含有的～66个氨基酸的单链类系物组成,分子量约为7000Da,主要分为HV1、HV2、HV3。含叁个二硫键的N端核心区域结合于凝血酶的活性中心,无规则的C端尾部则结合于酶对纤维蛋白原的识别位点。水蛭素无明显毒副作用,用量低,不引起出血,无免疫原性,因
于永生[7]2005年在《人尿激酶原突变体的构建与特性分析》文中研究表明动脉发生栓塞是血栓类疾病(如心肌梗塞)的一个重要原因。溶栓治疗被认为是治疗血栓最为有效的方法,临床上所用的溶栓药物大多为纤维蛋白溶解酶原(简称纤溶酶原)激活剂类药物,它们可以将纤溶酶原转化为纤溶酶,纤溶酶可以溶解栓塞位置的纤维蛋白,从而恢复血液的畅通。目前常用的溶栓药物有链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)、重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)、对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶激活剂复合物(APSAC) 和重组链激酶(r-SK)等,它们的溶栓疗效肯定,但是还存在一些缺陷(如初始再灌注延迟或失败、出血、再梗塞等),阻碍了溶栓疗效的进一步提高。因此,随着对溶栓药物结构和功能的研究,寻找和研制溶栓效率高、特异性强、具有纤维蛋白选择性、半衰期长的溶栓治疗药物对于更有效治疗血栓性疾病具有十分重要的意义。尿激酶原(pro-UK)是单链的u-PA,属于丝氨酸蛋白酶,能够激活纤溶酶原,使之成为纤溶酶,从而溶解血栓。体内和体外的实验均证明当用量控制在一定范围时,pro-UK 可以使纤维蛋白特异性溶解,但用量加大时,pro-UK 就转化为尿激酶(UK),失去了对纤维蛋白的特异性。对pro-UK 的研究表明,它由411 个氨基酸残基组成;经激肽释放酶或纤溶酶激活可在Lys158-Ile159 断开形成UK;凝血酶可催化pro-UK 的Arg156-Phe157 之间肽键的水解,产生凝血酶断裂型的UK 双链,该双链仅具有微弱的激活纤溶酶原的活性;为了防止系统性纤溶,pro-UK 受到纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)的调控;PAI-1 可通过与pro-UK 共价结合形成复合物而使之失活,是pro-UK主要的抑制剂;一项研究显示pro-UK 表面可变环中的许多带正电荷氨基酸残基(R178RHRGGS184)可与PAI-1 分子中的带负电荷氨基酸残基形成“盐桥”,该盐桥在pro-UK 与PAI-1 结合过程中起决定性作用;用苯甲酰甲醛处理pro-UK,改变四个Arg 残基可使衍生物在血浆中最稳定,且具有更高的溶栓活性,推测该四个Arg残基中有3 个位于pro-UK 表面的可变环(R178RHRGGS184)中。基于以上结果,本研究设计带有突变位点的引物,以天然pro-UK cDNA为模板,采用PCR 介导的定点突变技术对pro-UK 基因进行了突变,构建了叁种人pro-UK 的突变体,分别将蛋白序列中的凝血酶作用位点Arg156 突变成His156 ,构建成pro-UKM1;将PAI-1 的作用位点Arg178、Arg179、Arg181 突变为Lys178、Lys179、His181构建成pro-UKM3;同时将凝血酶和PAI-1 的作用位点突变构建成pro-UKM13。由于蛋白翻译后修饰(糖基化、形成二硫键、亚基组装等)对产物的性质至关重
安广宇[8]2001年在《抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究》文中进行了进一步梳理血小板血栓形成是血管闭塞性疾病的主要成因。其表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa是血小板聚集最终共同途径的关键要素。阻断GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原的结合，能高效地抑制血小板的聚集，进而使血小板血栓不能形成。SZ-21是我室制备的一株针对GPⅢa的单克隆抗体，经家兔颈动—静脉血栓模型证实能显着降低血栓形成，显示了在抗血栓治疗中的潜在价值。为降低鼠源性单抗免疫原性（HAMA）及全抗体Fc段对血小板的破坏，本研究将SZ-21制备成小分子抗体，并对这一抗体片段进行了纯化、复性和体外性质的研究。一 SZ-21单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析 采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术，从分泌抗血小板膜糖蛋白Ⅲa单克隆抗体SZ-21杂交瘤细胞中克隆了该抗体的重、轻链可变区（V区）基因，并测序分析。SZ-21重链（V_H）基因全长为342 bp，轻链（V_L）基因全长为306 bp，分别编码114和102个氨基酸。基因序列登录号为VH：AF354053，VL：AF354054。二 SZ-21单链抗体（SZ-21ScFv）基因的筛选和表达 为最大限度地保留单链抗体的血小板结合活性，利用噬菌体展示技术进行了高亲和力筛选。将SZ-21 V_H和V_L基因分别与含有（Gly_4Ser）_3多肽接头的载体pSW1-ScFv连接，构建成单链抗体基因pSW1-SZ21ScFv，克隆到噬菌体分泌型表达载体pHEN1中。同时亲和层析纯化血小板膜糖蛋白Ⅲa，用糖蛋白Ⅲa作为抗原进行高亲和力筛选。经过四轮“吸附—洗脱—扩增”的富集过程，phage-ELISA得到一个具有与血小板高亲和力的克隆，转化E.coli HB2151，表达了可溶性ScFv融合蛋白。ELISA和Western blot证实该融合蛋白保留了亲本抗体的血小板结合特性。叁 SZ-21单链抗体高效表达载体的构建及其在大肠杆菌中的融合表达 将上述筛选得到的单链抗体基因亚克隆到大肠杆菌融合型表达载体pET20b中，得到pET20b-21ScFv。通过IPTG诱导在大肠杆菌E coli 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究 摘 要 BLZI（DE3）PlysS中表达了功能分子。SDS－PAGE和 Western blot显 示表达产物的分子量为27000。该融合蛋白除少量为分泌型表达外， 主要以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的 21％，约 20 m叭。同 时探索了该抗体片段的最佳复性条件。把包涵体形式表达的 SZ上 单 链抗体片段用尿素溶解，经过蛋白质的体外重折迭复性过程，成功地 得到具有活性的单链抗体片段。ELISA和Western印迹检测证实，该 鱼链抗体保留了与血小板特异结合的能力。 四SZ毛 的纯化和体外性质研究 通过NINTA树脂亲和吸附纯化，获得具有活性的高纯度单链抗 体片段，纯度达95％以上。流式细胞仪检测证实该单链抗体能与人脐 静脉内皮细胞和血小板反应。体外实验表明，SZ2 单链抗体能够抑 制 ADP诱导的血小板聚集，其抑制能力呈剂量依赖性，其 IC刃为 12 ug／mL，在浓度为20 ug／mL时达到最大抑制率。对花生四稀酸诱导的 血小板聚集亦有相似的抑制作用。此外，SZ上 单链抗体同样能够抑 制纤维蛋白原与血小板的结合，显示了其抗血栓作用。 以上结果表明，制备的基因工程抗体具有原鼠单克隆抗体的抗 血栓形成能力，减少了全抗体的人抗鼠抗体反应（HAMAh 同时该小 分子抗体片段去除了抗体的FC段，避免鼠源性单克隆抗体引起血小 板严重下降的副作用。该单链抗体有望用于抗血栓治疗。 五抗血小板膜糟蛋白单抗SZ毛 嵌合Fab片段基因构建和表达研究 利用基因克隆技术，从杂交瘤细胞系 SZ上 中克隆出轻、重链可 变区基因，然后亚克隆到含有人恒区基因C＊和C。的质粒pSWIFab 中，构建成人一鼠嵌合Fab抗体片段质粒pSZ2，在大肠杆菌中表 达了可溶性＊b抗体片段。SDS－PAGE显示在分子量（Mr）45 000处 有一诱导条带，与该嵌合抗体的理论计算值相符。表达量约为 800 fig／L， ELISA和Western检测证实表达产物具有与血小板结合的活性。
王丽娜[9]2010年在《家蝇MdDpt和MdAtt-2基因的克隆与表达》文中提出抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子多肽,是生物体免疫系统的重要组分。家蝇(Musca domestica)生活在细菌横生的恶劣环境中,表现出很强的适应能力,这是因为其自身具有较为完善的免疫系统,形成了抵御外来有害微生物入侵的防御机制。本论文以家蝇为研究材料,研究内容主要分为3个部分:第1部分:通过RT-PCR及RACE技术从家蝇幼虫体内克隆获得2种不同的抗菌肽基因的cDNA序列,根据同源分析,将其分别命名为:家蝇双翅肽(Musca domestica Diptericin, MdDpt)和家蝇攻击素-2(Musca domestica Attacin-2, MdAtt-2),并对其蛋白质序列进行了分析;第2部分:以家蝇β-actin基因作为内参分子,利用半定量RT-PCR对经大肠杆菌(Escherichia coli)刺激后MdDpt和MdAtt-2基因的mRNA表达水平进行相对定量研究;第3部分:构建了家蝇MdDpt和MdAtt-2基因的原核表达载体,并在大肠杆菌DE3体内进行诱导表达,以纯化后的DsbA-MdDpt融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清。研究结果:(1)得到一条全长410 bp的家蝇MdDpt基因cDNA序列,包含一个300 bp的完整开放阅读框(ORF),根据ORF推导的MdDpt多肽由99个氨基酸残基组成,SignalP 3.0程序预测N端包括20个氨基酸残基的信号肽,MdDpt成熟肽由79个氨基酸残基组成,理论分子量为8.79 kD,理论等电点为8.27。同源性分析表明,它与厩蝇(Stomoxys calcitrans)的Diptericin A mRNA相似性最高(identity=74%)。(2)MdAtt-2基因cDNA序列其全长809 bp,编码区长726 bp,根据ORF推导的MdAtt-2多肽由241个氨基酸残基组成,SignalP 3.0程序预测N端包括22个氨基酸残基的信号肽,MdAtt-2成熟肽由219个氨基酸残基组成,理论分子量为23.63 kD,理论等电点为9.77。同源性分析表明,氨基酸与棕尾别麻蝇(Sarcophaga peregrina)的Sarcotoxin IIA具有最高相似性(identity=45%)。(3)半定量RT-PCR分析:数据分析表明在未经诱导的家蝇幼虫体内2个基因的表达量均很低,经过大肠杆菌(E. coli)刺激后2个基因表达量迅速上调,在12 h后达到高峰,随后逐渐恢复,72 h后趋于恢复向正常水平,通过t检验,2个基因的表达量在6~72 h后均高于未刺激的对照组,且具有显着性差异(P<0.01)。(4)利用高效原核表达载体pET-DsbA,成功实现了MdDpt和MdAtt-2基因在大肠杆菌DE3中的融合表达,IPTG终浓度为0.8 mmol/L。SDS-PAGE蛋白电泳显示,获得的融合蛋白DsbA-MdDpt分子量约为33 kD,融合蛋白DsbA-MdAtt-2分子量约为48 kD,目的条带大小均与预期分子量大小一致。利用His亲和层析纯化两种融合蛋白,并用DsbA-MdDpt融合蛋白免疫新西兰大白兔制备抗MdDpt抗血清,Western Blot结果表明此抗血清具有很好的特异性。
季顺东[10]2011年在《抗血小板膜糖蛋白单抗片段肺栓塞动物模型显像研究》文中认为肺栓塞(pulmonary embolism, PE)是一种高发病率和具有潜在致死性的疾病,快速诊断和及时的治疗可以降低肺栓塞的致死率和致残率,同时避免不必要的溶栓治疗。虽然影像学检查方法已在动脉栓塞症[PE和深静脉血栓形成(deep venous thrombosis , DVT)]的诊断中发挥着至关重要的作用,但一直还缺乏一种单一的无创诊断方法,可以可靠地诊断动脉栓塞并识别血栓的病理状态(新鲜或陈旧血栓)。单光子发射计算机断层成像(single photon emission computed tomography ,SPECT)是一种高度敏感的成像技术,利用~(99m)锝( technetium,~(99m)Tc)标记的与血栓主要成份结合的血栓显像剂,进行SPECT显像诊断PE和DVT,可以为肺栓塞的诊断提供新的思路和办法。本研究以鼠源性抗人血小板P选择素单抗SZ51-F(ab)_2以及人鼠嵌合抗血小板GPIIIa的单抗chSZ21-F(ab)_2 ,经~(99m)Tc标记后,进行犬肺栓塞动物模型显像研究,评估其作为血栓显像剂进行体内血栓显像的可行性。此外,还进行了原核表达抗P选择素多肽的初步尝试。方法制备了SZ51-F(ab)_2及chSZ21-F(ab)_2抗体片段,经流式细胞仪检测以及ADP诱导的血小板聚集实验证实了单抗片段与各自靶抗原结合的特异性和亲和力。选用比格犬制备了肺栓塞模型,通过导管将特制的双股螺旋金属丝送入比格犬肺动脉内制备肺栓塞模型,同法制备股静脉模型。金属丝放置30分钟后,X -射线造影证实血栓栓塞的存在及其位置。以2-IT修饰抗体片段,以葡庚糖酸钠转换络合法进行~(99m)Tc标记,进行制备24h的PE以及DVT的显像。动物显像3小时后,进行肝素化处理,实施安乐死。迅速取出心肺,排空血液后,进行肺栓塞模型体外SPECT显像,判断放射性浓聚部位与栓塞部位是否一致。多点采集主要脏器的组织块,测量放射性计数后称重,计算组织分布,结果以注射剂量百分比( percentage injected dose per gram , %ID/g)形式表示。此外,还通过基因克隆的方法,构建抗P选择素多肽P851及P851-GST融合蛋白表达载体,经IPTG诱导表达后,Westernblot法鉴定了表达的多肽与血小板膜裂解液的结合能力。结果流式细胞仪检测结果证实SZ51-F(ab)_2和chSZ21-F(ab)_2可与各自靶抗原特异性结合。chSZ21-F(ab)_2抑制ADP诱导的人和犬富血小板血浆聚集试验的半数有效剂量IC50分别为11.6±7.9 nM和24.9±18.8 nM。~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2显像结果表明SZ51-F(ab)_2与活化血小板表面P-选择素具有高亲和力结合,能够检测比格犬体内的形成24小时以上的肺栓塞,注射显像剂3小时内能够清晰显示肺栓塞。因此,~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2具有潜在的肺栓塞显像应用前景。在比格犬血栓栓塞模型体内,注射~(99m)Tc-chSZ21-F(ab)_2后30min和60min出现DVT和PE部位的放射性浓聚,且随着时间的延长而增强。显像3小时后处死动物,离体检测结果表明,PE和DVT的注射剂量百分比(%ID/g)分别为0.076%和0.083%。体外检测结果表明:肺动脉血栓与正常肺组织的单位质量放射性比值平均为12.8±3.7,下肢深静脉血栓与血液的单位质量放射性比值平均为7.2±1.9,与肌肉的比值平均为117.0±5.3。通过大肠杆菌表达系统,我们成功获得了具有人血小板P选择素结合活性的多肽,但表达量尚不理想,还有待进一步改进。讨论随着PE研究的进展,对可疑PE患者的诊断已变得更加安全、简便和快捷。虽然目前的CTPA和肺通气/灌注显像等检查方法已广泛应用于临床PE患者的诊断,但这些方法都是通过“阴性显像”进行诊断,仍存在无法鉴别新鲜和陈旧血栓的不足。SPECT成像和正电子发射断层成像(PET),可以实现分子水平的功能成像,从而为判断血栓的病理状态提供更多的信息。通常认为,PE和DVT是同一种病理类型疾病的不同临床表现形式。因此通过一项检查实现同时无创诊断PE和DVT,可以为血栓栓塞性疾病的诊断提供新的思路和方法。开发可与血栓表面的血小板或纤维蛋白成分特异性结合的血栓显像剂,将有助于实现这一目标。每个血小板表面约有80,000个糖蛋白GPIIb/IIIa受体表达,为血栓显像提供了一个高容量的血栓显像剂结合位点。理论上,无论是针对纤维蛋白还是血小板的血栓显像剂均可进行肺栓塞分子显像,但由于纤维蛋白在新鲜和陈旧血栓都有大量表达,所以应用针对血小板靶位点的分子探针鉴别新鲜和陈旧肺栓塞更有优势。另一方面,血小板聚集发生在血栓形成的早期阶段,此后随着纤维蛋白和大量红细胞包裹血栓,导致形成数日后的血栓表面,可供以血小板为靶点的血栓显像剂的结合位点减少,从而无法进行陈旧血栓显像。因此,理论上可以利用以血小板为靶点的血栓显像剂的这一特点,鉴别新鲜和陈旧血栓。本研究的不足之处在于,~(99m)Tc-chSZ21-F(ab)_2在动物体内清除较慢,血液中的血池背景较高。在未来的研究中,制备分子量更小,体内代谢分布特性更好在的血栓显像剂将有助于改进这一不足。结论~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2与活化血小板表面P-选择素具有高亲和力结合,能够检测比格犬体内的形成24小时以上的肺栓塞,注射显像剂3小时内能够清晰显示肺栓塞。因此,~(99m)Tc-SZ51-F(ab)_2具有潜在的肺栓塞显像应用前景。嵌合抗体片段chSZ21-F(ab)_2可与血小板表面糖蛋白IIb/ IIIa受体高特异性和高亲和力地结合,并经~(99m)Tc标记后,在实验犬血栓栓塞模型中显像成功。静脉注射~(99m)Tc-chSZ21-F(ab)_2 3小时后,可以在动物模型体内,清晰显示PE和DVT,具有成为可在一项检查中同时检出PE和DVT的血栓显像剂的潜力。
参考文献：
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[8]. 抗血小板膜糖蛋白基因工程抗体的制备和性质研究[D]. 安广宇. 苏州大学. 2001
[9]. 家蝇MdDpt和MdAtt-2基因的克隆与表达[D]. 王丽娜. 河北大学. 2010
[10]. 抗血小板膜糖蛋白单抗片段肺栓塞动物模型显像研究[D]. 季顺东. 苏州大学. 2011
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