(1遵化市人民医院 河北 遵化 064200 2华北理工大学附属医 河北 唐山063000）
【摘要】目的 通过观察去骨瓣减压时大鼠大脑海马神经元神经生长因子（NGF）表达的变化及血清中肿瘤坏死因子TNF-α蛋白水平的变化，探讨去骨瓣减压对脑复苏的影响。方法 采用改良的窒息法制备大鼠复苏模型，成年雄性Wistar大鼠24只，随机分为假手术组（n=8）、对照组（n=8）、去骨瓣干预组（n=8）。对照组与去骨瓣干预组采用窒息致大鼠心脏骤停（CA）和心肺复苏（CPR）模型。数据处理应用SPSS 17.0软件，多组数据间用方差分析，两两比较用q检验，方差不齐时用秩和检验。所有数据以平均数±标准差表示，以P<0.05有统计学意义。结果 与假手术组比较，对照组血清TNF-α蛋白在自主循环恢复（ROSC）后6h明显升高（P<0.01），而对照组NGF的表达明显比假手术组低(P<0.01 )，差异具有统计学意义；与对照组比较，去骨瓣干预组血清TNF-α蛋白ROSC后6 h降低(P<0.05)，而去骨瓣干预组NGF表达比对照组高，差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 去骨瓣减压能增强心肺复苏后海马神经元NGF的表达，降低大鼠心肺复苏后血清中TNF-α蛋白的表达，从而减轻脑损伤。
【关键词】心肺复苏；去骨瓣减压；TNF-α蛋白；脑损伤；海马CA1；NGF；
中图分类号：R605.974 文献标识码：A
材料与方法
1.1实验动物及分组
成年清洁级雄性Wistar大鼠24只，体质量280～380 g，随机分为假手术组、对照组、去骨瓣组，实验前禁食12h，不禁水。
1.2实验模型制作
参照参考文献的方法制作窒息性心跳骤停模型。腹腔注射9%水合氯醛（0.33ml/100g）麻醉，将大鼠固定于手术板上，针状电极置于皮下，监测ECG。分别行气管插管和右侧股动、静脉置管术。气管插管后连接TKR-200C小动物呼吸机，行高频喷射通气，吸入空气，通气频率80次/min，通气压力<0.02 MPa，根据大鼠胸廓起伏及呼吸是否抵抗调节通气频率。经右股静脉输注乳酸钠林格0.Olml·g-1·h-1，股动脉接换能器监测动脉压及心率稳定10min。复苏液：肾上腺素40ug/kg。窒息前5 min静脉注射维库溴铵0．1mg/kg、肝素500U/kg。夹闭气管导管直至ECG和有创动脉监测示心电机械分离或心电活动消失，且MAP<20 mmHg，8min后经右股静脉插管注入复苏液，同时开放气道，行机械通气，并行心外按压（按压频率200次/分，深度为胸廓前后径的1/3），动脉波形恢复且MAP>40mmHg为按压有效，自主循环恢复(MAP>60mmHg，HR>250次/min)为复苏成功。
1.3去骨瓣干预治疗
去骨瓣组大鼠于窒息性心跳骤停复苏模型成功1小时后，切开头皮，擦拭分离筋膜，完全暴露另一侧顶骨,用显微牙科钻在顶骨边缘上均匀的打孔，配合牙科镊将大鼠一侧顶骨取下, 骨瓣大小约9mm×5mm，放射状切开硬脑膜，止血、缝合头皮。
1.4标本的采集
每亚组大鼠分别于自主循环恢复后6h后腹腔麻醉，立即开胸暴露心脏，迅速取大鼠上腔动脉血2 mL（待离心），之后速断头取脑，用4%多聚甲醛液固定24h后常规脱水、石蜡包埋，每个标本于大脑海马区连续切片2张，切片厚度5um，一张切片用于HE染色，一张用于免疫组化染色法测定海马神经元NGF的表达。将每只大鼠留取的静脉血离心(3500 r／rain，10 min)，取上清液于EP管，置于-80℃冰箱保存，批量待测。测定血清TNF-α蛋白浓度，测定步骤严格按试剂盒操作说明进行。
1.5免疫组化方法测定海马区神经元NGF的表达
用3％H2O2孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min后用PBS稀释的10％山羊血清，室温孵育10～15 min，滴加适当比例稀释的一抗（1:2000），4℃过夜， PBS冲洗3次，滴加用PBS稀释的，用生物素标记的二抗，室温下孵育2 h，PBS冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，室温下孵育2 h，PBS冲洗3次，DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，封片。
采用计算机图像分析系统分别对免疫组化染色切片中海马CAl区染色阳性神经元进行采集。每次均在开机20 min后，在40倍物镜下采集图像。
1.6统计学方法
文中数据均以（均数±标准差）表示，应用SPSS17.0，多组数据间用方差分析，两两比较用q检验，方差不齐时用秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
2.1各组大鼠大脑海马区神经元NGF及血清TNF-α蛋白的表达。
各组大鼠海马CAl区NGF的表达肉眼观察：假手术组海马CAl区神经元NGF正常表达，神经细胞及轴突显示清晰；与假手术组比，对照组海马内有少量的NGF染色阳性神经元，神经元表达明显减少（P<0.01）；与对照组比，去骨瓣组NGF阳性染色神经元数目轻度减少(P<0.05)。
各组大鼠海马CAl区神经元NGF阳性染色积分光密度值应用计算机图像分析系统对3组大鼠海马CAl区神经元表达NGF的阳性染色积分光密度值(iOD)定量分析结果。（表1）
去骨瓣减压术对心肺复苏大鼠血清中TNF-α含量的影响：与假手术组相比，对照组大鼠血清中TNF-α含量显著升高(P<0.01)；去骨瓣组大鼠血清中TNF-α含量下降且与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。（表1）
表1各组大鼠大脑海马区神经元NGF及血清TNF-α蛋白的表达（n=4，x±s）
注：与假手术组比较，#P<0.01。与对照组比较，*P<0.05
与假手术组比较，aP<0.01。与对照组比较，bP<0.05
2.2HE染色观察组织结构及细胞形态结构
假手术组：神经细胞数量及形态结构分布正常，未见神经元病理性损伤。
对照组：神经元细胞水肿，神经毡疏松，部分细胞核浓染，固缩，局部可见少量三种深染单核淋巴细胞浸润。
去骨瓣组：可见大脑皮层及海马区神经元细胞轻度水肿，部分细分细胞核浓染，固缩，另外胶质细胞增生，大量新生毛细血管。
讨论
本实验结果显示心肺复苏自主循环恢复后6h对照组大鼠海马神经元NGF的表达明显低于假手术组。其原因为窒息所致心跳呼吸停止及心肺复苏引起脑组织严重缺血缺氧及再灌注损伤，导致严重的神经元损伤，并引起神经元NGF严重耗竭，从而进一步导致神经元细胞的损伤、死亡[1]。
TNF-α在中枢神经系统是源于星形胶质细胞的一种参与炎症反应和免疫反应的可溶性多肽类细胞因子[2]。它的分泌可引起其他因子如IL-6等的释放，而这些因子在机体炎症启动，维持和消退中都起着重要作用。
参考文献
[1]王晶，路毅，邢秀荣，等.APPl7肽对心肺复苏大鼠海马神经元NGF、BDNF表达的影响.[J]中国药理学通报；2007May；23(5)：582～585
[2]季杰,王麟鹏,刘慧林.TNF-α、IL-1β与缺血性脑血管病的关系.[J]首都医药；2005,10：23-24.
论文作者:张天伟1 王瑞刚2 (通讯作者)
论文发表刊物:《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年5月第5期供稿
论文发表时间:2015/7/16
标签：神经元论文; 大鼠论文; 血清论文; 对照组论文; 心肺论文; 蛋白论文; 统计学论文; 《中国耳鼻咽喉头颈外科》2015年5月第5期供稿论文;