一、中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定（论文文献综述）
吴颖[1]（2021）在《H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立》文中研究说明犬流感是由犬流感病毒（Canine Influenza Virus,CIV）引起的一种犬的接触性呼吸道传染病,患犬主要表现为发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状。目前,犬群中主要流行H3N2和H3N8亚型CIV。犬作为伴侣动物与人类接触密切,流感病毒很有可能通过犬传染给人。因此,加强对犬流感的监测并建立一种快速诊断犬流感的检测方法具有重要的公共卫生学意义。本研究首先对2018-2020年自黑龙江省、江苏省、浙江省、河北省、云南省和宁夏回族自治区的部分地区采集的3758份犬鼻拭子进行鸡胚接种,成功分离到4株H3N2亚型CIV,对分离的病毒进行系统的遗传演化分析、受体结合特性分析和抗原性分析。病毒遗传演化分析结果表明,各分离毒株与早期韩国和中国H3N2亚型CIV位于同一分支,并与2016年后国内H3N2亚型CIV形成独立分支。4株病毒各基因片段核苷酸同源性均在98%以上,且各毒株NA基因头部均出现2个氨基酸缺失。抗原性分析结果显示,本研究各病毒阳性血清之间具有良好的交叉反应,且与3株H3N2亚型禽流感病毒的阳性血清均出现交叉血凝现象,但是与H3N2亚型猪流感病毒和WHO推荐的H3N2亚型人流感疫苗株的阳性血清均不反应。受体结合特性分析结果显示,4株H3N2亚型CIV可以同时结合α-2,6唾液酸受体和α-2,3唾液酸受体,但仍以结合α-2,3唾液酸受体为主。鉴于部分犬感染CIV后症状不明显或排毒量较少,从而对CIV的临床诊断造成困难。本研究根据国内外各亚型CIV的M基因和H3亚型CIV的HA基因核苷酸序列,设计并合成特异性引物和探针。通过优化反应体系和条件,分别建立了通用型和H3亚型CIV荧光定量PCR检测方法。建立的两种方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便。不仅可以对病毒进行定性分析,还能通过建立标准曲线对病毒进行定量分析。敏感性结果显示,两种方法对质粒标准品的检测限度分别为150copies/μL和19copies/μL;重复性试验结果显示,两种方法的变异系数均小于2%。本研究建立的两种方法与病毒分离结果相比,符合率均在95%以上。综上所述,本研究对分离到的4株H3N2亚型CIV进行了系统的遗传演化分析,并建立了快速检测通用型和H3亚型CIV的荧光定量PCR方法,对有效控制CIV在犬群中的流行,预防人类流感的大流行具有重要意义。
陈凯彪[2]（2021）在《H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究》文中认为猪因其呼吸道上皮同时具有人（α-2,6）和禽（α-2,3）流感病毒受体,被认为是人和禽流感病毒间发生基因重配的重要场所。有研究表明,我国近10年来猪群中广泛流行的猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）为欧亚类禽H1N1（Eurasian avian-like H1N1,EAH1N1）、2009 大流行 H1N1（Pandemic 2009 H1N1,Pdm09H1N1）以及类人 H3N2（Human-like H3N2,HLH3N2）。并且,这三种不同进化谱系的SIV持续不断地在猪群中发生着基因片段的重组,产生了众多基因型。值得注意的是,刘金华等学者报道的基因4型（Genotype4,G4）EAH1N1不仅在猪群中获得了优势流行,还具有较强的跨宿主传播潜能,对养猪业和公共卫生安全均构成了严重威胁。本研究基于目前我国猪群中主要存在H1和H3亚型SIV的现状,建立了同时检测并区分两种亚型SIV的一步法双重荧光定量RT-PCR（Real-time reverse-transcriptive PCR,RT-qPCR）方法,并将其应用于 SIV 的流行病学调查与分离鉴定,且进一步对临床分离株的遗传进化与生物学特性进行了分析。研究结果将为SIV的快速检测提供技术支撑,并为深入了解SIV的流行动态及致病特性提供理论参考。1.H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用本章通过比对近10年在我国流行的SIV HA基因序列,设计了一对能够同时匹配EA H1N1和Pdm09 H1N1的引物探针组以及一对匹配HL H3N2的引物探针组,并在此基础上建立了一种基于TaqMan-MGB探针的一步法RT-qPCR方法。该方法具有良好的灵敏性,最低能够检测到5copie/μL的质粒标准品以及2.1 EID50/mL的病毒RNA。此外,通过同时使用RT-qPCR和鸡胚接种对人工感染SIV的小鼠肺脏进行检测,RT-qPCR方法与传统的病毒分离法具有97.9%（47/48）的符合率。并且,该双重RT-qPCR在进行批间和批内重复性试验时,变异系数（Coefficientofvariation,CV）均小于3%,提示其具有良好的重复性。进一步地,应用该RT-qPCR方法对2019-2020年秋冬季屠宰场来源的猪鼻拭样品进行检测,结果显示H1亚型SIV的阳性数总体要高于H3亚型,此结果与其他研究人员所报道的情况一致,表明该RT-qPCR方法在H1和H3亚型SIV的快速检测方面具有较好的应用前景。2.猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析结合第一章中建立的RT-qPCR检测方法,从屠宰场所采集的598份鼻拭中成功分离出具有血凝活性的9株EAH1N1和4株HLH3N2病毒,并另从170份由猪场送检样品中分离获得1株EA H1N1病毒。接下来,基于这14株病毒的HA基因的测序结果,选取出其中的3株EAH1N1和2株HLH3N2亚型SIV进行全基因组测序与遗传进化分析。结果显示,这5株SIV均具有Pdm09 H1N1的PB2、PB1、PA、NP 和 M 基因以及三源重组（Triple reassortant,TR）SIV 的 NS基因,即它们的内部基因组成来源均与当前中国猪群中优势流行的G4 EAH1N1相 同。此 外,值 得注 意 的 是,EA H1N1 分 离 株A/swine/Huadong/11/2020（H 1N1）[HD 11]与 人 流 感 病 毒 株A/Shandong/00204/2021（H1N1）高度同源,两者的核苷酸一致性高达99.35%～99.89%,提示这两株H1N1可能具有共同祖先或两者间存在跨宿主传播。3.5株猪流感病毒的生物学特性研究进一步对第二章中已全基因测序的5株SIV进行了抗原差异性分析与受体结合能力、体外复制能力和对小鼠致病能力的测定。结果显示,3株G4 EAH1N1分离株之间及其与基因1型（Genotype 1,G1）、基因5型（Genotype 5,G5）之间和2株HL H3N2分离株之间及其与人源H3N2病毒间均不存在明显的抗原性变化,但部分EA H1N1毒株与Pdm09 H1N1存在一定的抗原性差异;5株SIV均呈现α-2,3和α-2,6双受体结合特性,其中HD11（H1N1）分离株明显偏嗜α-2,6受体;5株SIV在MDCK细胞上均复制良好,其中HD11（H1N1）在各取样时间点均具有相对最高的病毒滴度;106.0EID50攻毒剂量下的小鼠实验中,HD11（H1N1）与A/swine/Shandong/SG03（H1N1）这2个分离株表现出明显的致病性,分别导致100%和80%的小鼠死亡率,并在5株受试SIV中具有相对最高的组织病毒载量以及细胞炎性因子水平。进而提示,G4 EAH1N1跨宿主传播的潜能对公共卫生产生的威胁不容忽视,亟需加强监测。
张醒海[3]（2021）在《候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究》文中认为流感病毒是目前最受关注的人畜共患病原体之一,广泛分布在自然环境、家禽及候鸟等自然宿主中,可感染包括人类在内的多种哺乳动物,对国家生物安全、产业经济有着重要影响。该病毒对人类健康的危害主要表现为引起季节性流感、流感大流行和人感染动物流感等。候鸟是H3N8、H9N2和H5N8等众多亚型禽流感病毒的储存库,且这些病毒持续在我国候鸟中流行传播。近年来它们又出现新的生物表型或基因特性,如水禽不仅呈现无症状携带流感病毒,也出现了感染甚至致死的现象;部分候鸟来源的病毒,可发生水禽-陆禽的传播;出现禽源H9N2、H5N8感染人的现象。这些亚型病毒在中国候鸟中的流行、进化及引发公共卫生风险等问题亟待解决。本研究以监测中国东部候鸟禽流感病毒流行动态为切入点,研究内容包括发现候鸟禽流感病毒的亚洲-北美地区跨洲际传播的证据,揭示候鸟禽流感病毒在自然宿主中的遗传变异规律,提供禽流感病毒家禽-野禽间跨物种感染的证据,评估候鸟源禽流感病毒在哺乳动物间的传播能力以及识别决定禽流感病毒跨物种感染人的分子特征。第一部分:中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查。在全球候鸟迁徙背景下,选取途经我国东部的东亚-澳大利亚候鸟迁徙路线上重要候鸟停歇与聚集地（湖南东洞庭湖、环渤海湾湿地、内蒙古图牧吉、上海崇明东滩）开展了2016-2019年为期四年的主动预警监测,分离跨洲际传播或新型重配候鸟源禽流感病毒株,并测定其全基因序列。监测过程中本研究共采集了来自96种不同鸟类的35604份样本,分离得到88株病毒,候鸟禽流感病毒携带率约为0.247%。亚型多样性分析表明分离毒株涵盖12种HA和9种NA组成的23种不同亚型。其中低致病性禽流感病毒H3、H6、H9亚型为优势流行毒株。病原学及血清学数据证明H9N2禽流感病毒在候鸟内广泛流行,H9N2禽流感病毒可以感染包括纵纹腹小鸮、红隼、苍鹰和雉鸡多种野生鸟类,在小型多宿主生态系统中H9N2可以发生有效的种间传播。自2020年10月底以来,H5N8病毒中国中东部候鸟中引发疫情。本研究证实了H5N8对大天鹅、尤鼻天鹅等候鸟的感染,确定2020 HPAIV H5N8为2.3.4.4b谱系。抗原性分析发现,由于抗原漂移,当前家禽H5疫苗株对2020年HPAIV H5N8病毒保护力下降,病毒传入家禽并大面积流行的风险极大,需要及时更新家禽候选疫苗株,并进一步加强监测和实施预防措施。第二部分:候鸟禽流感病毒遗传进化分析。本研究进而对禽流感病毒各基因片段在天然宿主中的进化速率及基因片段溯源分析:基于不同时间点分离的病毒之间遗传差异和时间分布,采用贝叶斯MCMC方法,估算各个基因片段进化变异的总体速率并推断其最近共同祖先（t MRCA）的年代。重点关注亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系:利用病原基因组序列信息构建系统发育树,结合候鸟迁徙数据,分析病毒基因片段转移的方向性,通过各基因片段的地理溯源来确定亚洲和北美洲之间候鸟禽流感病毒的洲际联系,确定可能的病毒引入途径,解析候鸟在大陆之间和大陆内部的禽流感病毒流通过程中发挥的作用。系统发育分析揭示部分亚型AIVs基因片段存在洲际间的沟通与传播。遗传变异分析发现中国东部候鸟AIVs基因片段遗传多样性丰富、不同亚型及不同鸟种间出现基因节段流通与传播。H3N8亚型禽流感病毒在候鸟中广泛流行,且基因型十分丰富,分离到的8株H3N8禽流感病毒可以分为7个基因型。H13、H3N8亚型内部基因节段存在洲际间的沟通与传播。系统发生及基因型分析研究发现H9N2禽流感病毒存在由家禽向野禽溢出的现象。对2020 HPAIV H5N8进行各基因节段溯源,结合系统发生地理学及候鸟迁徙路线证明了2020年中国候鸟中流行的H5N8禽流感病毒为新型重配毒株,随候鸟迁徙由哈萨克斯坦及俄罗斯引入我国,明确了新型重排H5N8流感病毒各基因片段的进化地位和起源,揭示了H5N8禽流感病毒株在欧亚大陆内的洲内传播及非洲-欧亚大陆的洲际间传播的现象。第三部分:候鸟禽流感病毒公共卫生风险评估。在遗传变异分析的基础上,我们开展候鸟禽流感病毒新型重配病毒受体结合特性及其在非天然宿主中的致病与传播能力评估。针对首次出现感染人的2020 HPAIV H5N8高致病性禽流感病毒,采用哺乳动物模型评估其在不同宿主上的致病性及传播能力,评估其公共卫生风险;针对由家禽溢出到野鸟的H9N2亚型禽流感病毒,我们结合病毒基因组变异分析,受体结合偏好性与哺乳动物致病性及传播能力分析,系统评估其公共卫生风险;针对在候鸟中广泛流行的多个基因型的H3N8亚型禽流感病毒,我们评估其受体结合能力,利用小鼠、豚鼠、雪貂等动物模型检测其在哺乳动物致病性及传播能力,分析研判H3N8亚型人群间传播的潜在风险。生物学特性评估发现H5N8禽流感病毒在人际间传播的风险仍然很低,此判断基于H5N8禽流感病毒偏好与禽类受体结合,而且在豚鼠中不具备传播能力的研究数据。尽管近来首次出现2020 HPAIV H5N8禽流感病毒感染人的状况,本研究证实H5N8禽流感病毒尚不具备在人际间流行的潜力,提示其产生的公共卫生威胁有限。由家禽溢出到候鸟的H9N2毒株结合人样受体后,可以在豚鼠及雪貂模型间通过直接接触及呼吸道飞沫途径进行高效传播,这些结果强调了H9N2亚型禽流感病毒存在能够引发人际间流行的潜在的公共卫生风险。受体结合检测证实H3N8毒株普遍具有结合人样受体的能力,在豚鼠模型中具备高效的接触传播及呼吸道飞沫传播能力。候鸟H3N8亚型禽流感病毒具有感染人类并在人群中传播的潜在风险。第四部分:候鸟源H3N8禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究。在候鸟源H3N8禽流感病毒的哺乳间传播评估过程中,本研究发现T222毒株不能在雪貂模型中通过呼吸道飞沫传播,而T222豚鼠适应1代毒株可以经呼吸道飞沫传播。因此,我们选择传播能力差异明显但遗传背景相似的以上两株H3N8亚型禽流感病毒毒株,结合反向遗传学技术,构建了PB1-S524G突变质粒并拯救r T222-S524G突变体。采用体外聚合酶活性检测,我们证实PB1-S524G突变增强了病毒聚合酶活性。进一步利用小鼠、豚鼠和雪貂等动物模型,发掘决定H3N8亚型哺乳动物间传播的关键分子标记。本研究证实PB1-S524G突变可以赋予H3N8在雪貂间经呼吸道飞沫传播的能力。PB1-S524G突变增强了病毒体内外复制能力,提高病毒在小鼠及雪貂上呼吸道的病毒复制滴度,加剧了由病毒导致的雪貂肺脏的病理损伤。研究结果表明PB1-S524G是影响候鸟H3N8禽流感病毒在哺乳动物宿主上致病及传播能力的关键分子标记。以上研究结果提示我们应持续加强对候鸟禽流感病毒的监测及对公共卫生安全的威胁进行评估,进一步加强候鸟禽流感病毒跨物种传播的分子机制的研究,为禽流感防控提供理论依据。
孔子荣,李三木,何奇松,曾咏芳,杨可妍,冯淑萍,孙翔翔,熊毅,颜健华[4]（2020）在《2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析》文中指出【目的】明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性（抗原性、耐药性和致病性）,为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据。【方法】以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒（SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株）为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段（HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因）,经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析。【结果】2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框（ORF）分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410bp、M:982 bp和NS:838 bp。2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型。2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变。2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点（NCS）;NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63～65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234aa处非常保守,但发生W402S突变。【结论】从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒（SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株）虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性。因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播。
庄青叶[5]（2020）在《基于氨基酸序列的甲型流感病毒多样性及进化分析》文中研究说明甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）可引起人和多种动物感染发病。IAV的多样性和分布特征非常复杂,揭示IAV的多样性和分布特征有助于分析IAV疫情状况和风险,阐明IAV的流行规律,以及预测IAV疫情发展态势。十年前,IAV的多样性和分布特征曾被全面解析。但是近十年来,新增了数万株IAV的基因序列,同时有些IAV基因的旧序列已被修订。这些新增和修订的毒株可能代表了一些新的分支或亚分支。并且,近十年计算机运算能力也显着增强,为系统运算更多、更新、更准确的IAV序列提供了工具。鉴于上述背景,本研究旨在重新全景式地解析了IAV多样性和分布特征,以完善了人们对IAV多样性和分布特征的认识。在本研究中,将主要在禽、人、猪、马和犬群体中流行的IAV,分别命名为禽流感病毒（AIV）、人流感病毒（Hu IV）、猪流感病毒（SIV）、马流感病毒（EIV）、犬流感病毒（CIV）;本研究从流感病毒资源数据库中（Influenza Virus Resource）筛选了背景清晰的139872条IAV的氨基酸序列,作为分析原始材料;对不同亚型的HA和NA基因节段,以及IAV的6个内部基因节段（PB2、PB1、PA、NP、MP、NS）,逐个利用MEGA 7.0软件进行序列比对、遗传进化分析、谱系划分,对既往IAV多样性和分布特征的描述修订了200处以上,并对全景图进行了抽样检验与实例应用。主要结果如下:1.IAV整体分布特征解析对139872条IAV的氨基酸序列进行统计分析,结果表明:H1、H3、H5和H9亚型的序列显着多于其他亚型;H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2亚型的序列显着多于其他组合亚型;禽、人、猪为IAV主要的感染宿主;AIV中H9N2和H5N1亚型较多;Hu IV主要是H1N1或H3N2亚型;SIV主要是H1N1、H1N2或H3N2亚型;EIV主要是H3N8或H7N7亚型;CIV主要是H3N8或H3N2亚型。IAV这些整体分布特征反映了IAV的流行情况,也反映了各个宿主中某些亚型的流行潜力,对IAV的流行病学分析与风险预测具有重要意义。2.IAV各基因节段全景式多样性分析对139872条IAV的氨基酸序列进行比对、系统进化分析和谱系划分,结果表明:H1亚型IAV分为H1.1和H1.2,它们又各进一步划分了4个二级分支,每个二级分支都有明显宿主、时间或地理特征,如H1.1b对应着来自南美洲的AIV,H1.2a对应1918年的Hu IV,H1.2c对应在全球流行多年的H1亚型SIV;类似地,对H2-H18等其余17个HA亚型也进行了全景式多样性和分布分析。N1亚型IAV分为N1.1-N1.3,有些分支进一步划分了二级、三级和四级分支和五级分支,每个亚分支都有明显宿主、时间或地理特征,如N1.1b对应流行于西半球的AIV、N1.1c2a对应近些年在东半球广泛流行的H5N1亚型HPAIV;类似地,对N2-N11等其余10个NA亚型也进行了全景式多样性和分布分析。PB2基因分为PB2.1-PB2.4,有些分支进一步划分了二级、三级和四级分支,每个二级、三级或四级分支都有明显宿主、时间或地理特征,如PB2.1b对应1990s在北美暴发的SIV、PB2.1d对应近些年出现的H3N2亚型CIV;类似地,对PB1、NP、PA、MP、NS等5个内部基因也进行了全景式的多样性和分布分析。上述结果对既往IAV的多样性和分布特征的描述进行了200处以上的修订,主要包括:（1）确定以前研究中因为序列错误而设置了S1.7、S1.8、S2.7、S3.8、S5.9、S5.10、h3.3和h5.3等IAV分支,本研究中均予以删除;（2）本研究全景性地揭示了IAV在近些年形成的一些新分支（如2013年在中国引起大量人感染和死亡的H7N9亚型AIV所形成的分支PB2.1b1等）;（3）本研究揭示了H1和H3亚型SIV存在更多的分支或亚分支;（4）本研究还从整体上进一步证实了前人研究中的相关结论,如大多数AIV的基因都是分为东、西两个半球的分支,但H3和H13亚型AIV、N2亚型AIV以及病毒的NS基因,并不能简单地根据西半球和东半球而划分为两个分支;（5）本研究从整体上揭示了IAV的流行特征,如在东半球流行的SIV很少在西半球流行,但是在西半球流行的SIV却能时常在东半球流行。3.全景图的抽样检验与实例应用本研究筛选部分有参考意义的IAV代表毒株序列对全景图进行抽样检验。结果表明,本研究中所选取的有一定参考意义的代表毒株所构建的进化树,与上述全景图的进化树趋势上完全一致,且大多数分支及亚分支都获得较高步值（bootstrap）的支持,表明本研究结果是可靠的。同时,于2018年,从我国11省（直辖市）67个场点,采集8914份样品,开展AIV流行病学调查。并对分离到的2273株AIV的NA基因进行序列测定和谱系进化分析,结果进一步验证了本研究更新修订的IAV多样性与分布特征全景图的实用性和可靠性。综上,本研究通过对更准确、更多和更新的IAV序列进行运算,进行了200处以上的修订以及实例检验,更全面地描述了IAV的多样性、分布特征和IAV最新演化情况,为全球科研人员和疫病防控人员开展各类IAV流行病学调查、流行特征分析、流行风险预警,提供了全面的框架和背景信息,因而对各类IAV的防控具有重要意义。此外,本研究提出一种新的适用于所有IAV基因/亚型的分支和亚分支的合理而简洁的命名系统,这有助于统一和简化人们对IAV的学术交流。
高灵茜[6]（2019）在《新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征及特殊miRNA-mRNA-蛋白质整合研究》文中研究表明研究背景及意义:新甲型 H1N1 大流行流感病毒（2009 pandemic H1N1 virus,pdm/09）于2009年在人群中暴发流行,之后该病毒进入猪群,成为猪流感病毒基因池中的成员之一而备受关注。经该病毒溯源研究得知,pdm/09是由人流感、禽流感和猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）重配形成的病毒,在人群流行后,它的基因片段已进入猪流感病毒中,并开始产生新的变异毒株。这表明pdm/09在人间流行后,返传给猪,获得与SIV重组形成新的重配病毒的能力,可能拥有形成新的重配毒株,并引起流感大流行的潜能。因此,重组有pdm/09片段的新现SIV对人类的潜在威胁,必须得到关注。流感病毒跨种属感染具有特殊性,非编码微小RNA（microRNA,简称miRNA）是其中一个非常重要的影响因素,细胞miRNA对流感病毒的影响,体现在病毒与宿主细胞相互作用过程中（简称相互作用）,细胞miRNA可以直接促进病毒的复制,或者通过阻止宿主被激活的抗病毒机制而协助感染的发生,或者通过调节细胞miRNA自身表达来促进宿主细胞对病毒感染的抵抗或者限制病毒的增殖过程。重组有pdm/09片段的新现SIV对传代人肺腺癌A549细胞的跨种属感染,是否存在某些特殊细胞miRNA,以及相关的miRNA-mRNA-蛋白质的交联网络又是如何,至今还缺乏相关研究。高通量测序和生物信息学分析是目前研究miRNA相对成熟的方法,先前也有一些研究借助这两种方法,对未知或者已知的miRNA的功能进行深度挖掘,但在病毒感染过程中,感染宿主参与的基因与研究所使用的宿主细胞种类、病毒毒株（型、亚型）的不同以及检测的方法有关,从而导致所得到的结果归纳性不佳,这尚需更多的研究进行多方面探索,以丰富miRNA与流感病毒的相互作用关系。综上,本文关注miRNA在流感病毒感染过程中发挥的作用,主要侧重在具有跨种属感染潜力的新现SIV感染A549细胞过程中是否存在特殊miRNA这一问题上,我们利用高通量深度测序和生物信息学大量数据分析,绘制新现SIV感染过程中miRNA-mRNA-蛋白质相互作用图谱,寻找特异性差异表达的miRNA,探讨其对病毒复制的影响,进一步研究微小RNA在开发抗病毒药物、研制疫苗和筛选新的生物标记物的潜力。目的:1.探讨新现SIV-SW2 783（简称SW2783）与参考流感病毒毒株是否具有不同的复制能力和跨种属感染潜能。2.探讨新现SW2783感染A549细胞后是否存在特殊差异表达的miRNA及具有靶向关系的mRNA。3.探讨新现SW2783感染A549细胞后是否存在特殊差异表达的蛋白质.以及与筛选出的miRNA的相互作用关系。4.初步探讨筛选的miRNA对新现SW2783的复制的影响。方法:1.建立新现SW2783及两株参考毒株（经典SIV-SW3861-简称SW3861和pdm/09的疫苗株CA09-简称CA09）体内和体外感染实验模型,对比三株流感病毒感染性的差异,通过血凝素实验（HA）、半数组织细胞感染实验（TCID50）、蚀斑实验、免疫组化和免疫荧光等实验,绘制病毒复制动力曲线,了解其不同的致病性特征。2.利用miRNA芯片技术和转录组高通量测序技术,检测SW2783、SW3861和CA09三株流感病毒（后两种病毒作为对照病毒）感染人肺腺癌A549细胞24小时后（急性感染期）的差异表达miRNA和mRNA,并对它们进行联合分析,最终得到SW2783感染A549细胞中特殊差异表达的miRNA-mRNA靶向关系对。3.通过蛋白质测序iTRAQ技术,进一步研究SW2783感染A549细胞后特异性差异表达的蛋白质,结合miRNA筛选结果,对miRNA和蛋白质进行交联分析,绘制miRNA-蛋白质关系图谱,在蛋白质水平上再次验证和探讨与跨种属感染人A549细胞过程相关的特殊miRNA。4.筛选得到的miRNA通过在A549细胞中的miRNA敲除和过表达技术,确定其对潜在靶基因的影响,并通过病毒拯救实验验证该miRNA对三株流感病毒复制的影响,进一步研究miRNA是否对SW2783的感染具有特殊的调控作用。结果:1.成功建立三株流感病毒的体外感染组织和细胞模型,显示不同病毒对组织细胞不同的感染能力。新现SW2783能够在体外感染A549细胞和人肺组织,并显示出较好的复制增殖能力,提示其具有跨种属感染人的潜力;经典猪流感病毒SW3861则体现出相对较弱的感染能力,提示其跨种属感染人的可能性较低;09年大流行甲型流感病毒CA09则能有效感染人细胞和组织;通过小鼠感染体内实验分析病毒致病特征发现,三株流感病毒均能感染小鼠,引起相应病理反应,并能够在小鼠肺部进行有效增殖,但SW2783的感染能力稍强其他两株流感病毒。2.通过对三株流感病毒感染A549细胞后24h的总RNA进行miRNA芯片检测和转录组mRNA高通量测序,得到与未感染对照组（NC组）比较差异表达的细胞miRNA和mRNA,经韦恩图分析,共筛选出52个特异性差异表达的细胞miRNA和2543个与之相关的mRNA,它们可能与跨种属感染A549细胞有关,利用GO和KEGG分析其功能,绘制出miRNA-mRNA相互作用图谱。用荧光定量PCR检测miRNA和mRNA表达量和相对倍数,发现三个 miRNA（hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p）和五个相关的mRNA所对应的基因（RCC1,ERVFRD-1,RANBP1,SCARB2和RPS29）可能与SW2783跨种属感染A549细胞有密切关系。3.用iTRAQ蛋白质测序技术,对三株流感病毒A549细胞感染24h后表达的蛋白质进行差异表达分析,共得到128个差异表达的蛋白质,推测可能与跨种属感染有关,其中70个差异表达蛋白质与52个候选miRNA存在靶向关系。通过与 hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p 建立相互作用网络,进行功能分析和筛选,6个候选蛋白质符合要求。用Western blot进行验证和通过表达量变化相对倍数分析后发现,RPS29,HMGA2,IFIT2和PPIA蛋白在SW2783感染A549细胞过程中呈特异性上调,我们推测这是新现SIV跨种属感染A549细胞时显着表达的功能性蛋白。4.综合对所有miRNA、mRNA及蛋白质的功能和与病毒之间的关系进行分析,我们发现非编码miRNA:hsa-miR-140-5p与3个潜在的靶蛋白（ERVFRD-1,PPIA和IFIT2）有关,值得进一步探讨它们之间的关系。通过敲除和过表达实验,确定了 hsa-miR-140-5p对ERVFRD-1,PPIA和IFIT2具有靶向调节作用。通过病毒拯救实验,我们尚发现hsa-miR-140-5p能够特异性影响SW2783病毒的感染,但对SW3861和CA09病毒的感染能力影响不大。因此,我们认为非编码miRNA—hsa-miR-140-5p可能作为潜在跨种属感染的流感病毒筛选的生物标记物或者新的药物靶点。结论:本研究用具有跨种属感染潜力的新现重配H3N2亚型SIV作为研究对象,围绕其跨种属感染过程中特异性差异表达的miRNA及相关miRNA-mRNA-蛋白质相互作用网络开展研究,获得如下发现:1.新现SW2783在体内外实验中均提示其具有跨种属感染的特征。2.通过miRNA-mRNA整合网络分析,筛选出3个非编码miRNA:hsa-miR-140-5p,hsa-miR-30a-3p 和 hsa-miR-582-5p,它们在 SW2783 感染过程中呈现特异性的差异表达,推测可能与跨种属感染有密切关系。3.通过miRNA-mRNA-蛋白质整合网络分析,筛选出非编码miRNA:hsa-miR-140-5p与3个潜在的靶蛋白（ERVFRD-1,PPIA和IFIT2）可能存在调控关系,并有可能对有跨种属感染的毒株在A549细胞中的感染能力有影响。4.通过功能实验证实hsa-miR-140-5p能够对SW2783感染A549细胞有特殊调控作用,表现在其能影响病毒的复制,并影响其靶向的ERVFRD-1,PPIA和IFIT2的表达。综上,在SW2783感染A549细胞过程中,非编码miRNA—hsa-miR-140-5p发挥了特殊的调控病毒复制作用,可能作为筛选跨种属感染的新型流感病毒的潜在生物标志物,或者治疗的新型药物靶点。
刘东[7]（2019）在《我国鸡群中H7N9亚型禽流感病毒的遗传进化及PA-X蛋白在高、低致病性毒株感染中的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）自2013年首次报道以来,已导致我国人群中形成了五波流行高峰。截至2018年9月5日,实验室共确诊1567例人感染H7N9的病例,死亡率接近40%。其中2016～2017年的第五波流行高峰感染人数最多、波及范围最广,在此期间还分离到了对鸡呈高致病性的（Highly pathogenic,HP）的H7N9AIV。与在我国流行20多年的亚洲HP H5N1病毒相比,H7N9亚型AIV在短短5年时间内造成的人类感染数量已经远远超过H5N1亚型AIV。人群中的H7N9散发病例均直接来自家禽感染。HP毒株和低致病性（Low pathogenic,LP）毒株并存的复杂状况给我国养禽业和公共卫生构成了重大威胁,因此,研究我国家禽中H7N9亚型AIV的遗传进化特点和毒株的生物学特性并掌握其流行趋势十分必要。因为人类感染的H7N9AIV主要来自家禽,所以家禽中H7N9病毒的监测和防控是控制和减少人类感染的最有效措施,因此,快速检测方法的建立及免疫原性良好的禽用疫苗储备就显得刻不容缓。同时,研究H7N9亚型AIV对家禽的致病机制可以为更有效的防控策略提供科学依据,家禽中同时存在的HP和LPH7N9病毒给新发现的PA-X蛋白功能的研究提供了良好的病毒模型。目前还没有针对H7N9亚型AIV PA-X蛋白作用的研究,因此探索PA-X对H7N9病毒致病性及宿主抗病毒免疫的影响不仅能够揭示PA-X蛋白在新型流感病毒感染中的关键作用,也能够推进H7N9病毒致病和制的研究。本研究在对我国鸡群中H7N9亚型AIV进行流行病学监测的基础上,对本实验室2013-2017年分离到的H7N9亚型AIVs进行了遗传进化分析,并对部分HP H7N9进行了生物学特性的鉴定。针对当前H7N9流行现状,成功构建了免疫效力良好RGW疫苗候选株并建立了灵敏度高的且能区别H7N9强弱毒的MGB RRT-PCR检测方法;同时研究了PA-X在高、低致病性H7N9病毒中调节复制能力和致病性的作用机理。1.2013年以来我国鸡群中H7N9亚型禽流感病毒遗传进化及生物学特性分析根据2013年以来本实验室在我国部分鸡场和活禽市场（Live poultry market,LPM）进行的禽流感病原学监测,我们对2013～2017年分离到的116株H7N9亚型AIVs进行了流行病学及遗传进化分析。研究表明,禽源H7N9病毒已经在我国获得常在性地方流行,家禽中H7N9的流行高峰时间和流行区域与人源H7N9类似,进一步证实了人源H7N9与禽源H7N9病毒高度同源。遗传进化树显示,监测期间H7N9亚型AIV的HA基因和NA基因均按照分离年份进行聚类。但是第五波流行高峰期间（2016年10月～2017年3月）分离到的HP H7N9毒株却独立于2015年的进化分支内而与2016～2017年的分离株相距较远,提示我们HP H7N9分离株可能来源于2015年的毒株。内部基因进化总体相对保守,大部分毒株的内部基因均来源于优势S基因型的H9N2病毒,即PB2和M基因属于Gl-like谱系而其他内部基因为F98-like谱系。但值得注意的是,分离株PB2基因分成了两个明显的进化分支且2015年部分毒株出现了 F98-like谱系的M基因,提示我们H7N9在进化过程中仍然可能进行着基因的重配。关键氨基酸位点的分析显示,在第五波流行高峰期间我们分离到了 7株裂解位点具有4个氨基酸插入的HP H7N9,这些病毒裂解位点的氨基酸序列存在两种模式（PEVPKGKRTAR↓GLF和PEVPKRKRTAR↓GLF）。在重要的受体结合位点处,HA蛋白G186V及Q226L的变化意味着大部分禽源H7N9亚型AIV已经具有结合人类和禽类的双受体结合特性。HA抗原A区R140K突变比例逐年增多,提示我们H7N9,在进化的过程中有可能已经产生了抗原漂移。同时,H7N9分离株PB2-K526R、PB1-1368V、PA-K356R、NS1-P42S的位点发生了普遍的或者逐年的变异,提示我们禽源H7N9已经获得了在小鼠中增殖和毒力增强的潜力,这些病毒如果一旦获得在哺乳动物体内的适应将会对公共卫生构成巨大威胁。HPH7N9的生物学特性和动物实验结果显示,分离株在对鸡呈高致病性的同时,对小鼠的毒力却各不相同,GD15株在小鼠和鸡中均呈现出了比GD4株更强的复制能力和毒力,这是否和其不同的裂解位点模式有关还需要进一步研究。同时SPF鸡感染传播实验提示我们H7N9亚型AIV的传播方式虽局限于接触传播,但传播效率非常高。2.高致病性H7N9禽流感病毒疫苗候选株的构建及基于Taqman-MGB探针RRT-PCR检测方法的建立为了有效防控H7N9亚型AIV在家禽中流行与传播,本研究根据当前H7N9流行情况和遗传进化特点,有针对性地构建了免疫效力良好的RGW疫苗候选株并建立了鉴别诊断不同毒力H7N9病毒的Taqman-MGB探针RRT-PCR检测方法。我们利用突变及反向遗传手段成功构建了重组致弱的疫苗株RGW,该疫苗株选择了GD15的裂解位点致弱的HA和NA作为供体外部基因,内部基因来源于同为S基因型的H9N2亚型疫苗株WJ57,还原性突变策略不仅使强毒株的毒力变弱,同时也能保证其良好的免疫原性,使疫苗株RGW能同时预防高致病性H7N9和低致病性H7N9病毒的感染。RGW株保持了母本毒株良好的繁殖特性和免疫原性,经10次传代后依然具有l1 log2的高效价,在免疫鸡后四个月后仍保持81og2的高滴度抗体。RGW不仅能对高致病性H7N9亚型流感病毒产生高滴度的HI抗体,对当前流行的低致病性H7N9也有很好的交叉反应性,交叉保护滴度均≥91og2。同时,RGW疫苗株在具有100%临床保护（死亡保护）的前提下,其排毒保护也能高达80%～100%,可以有效控制H7N9病毒在鸡群中流行及传播,从而也可以减少人类与禽类接触而感染病毒。当前H7N9亚型禽流感病毒存在着高致病性毒株和低致病性毒株共同流行的现状,快速区分强弱毒H7N9检测方法的建立极为必要。因此我们基于Taqman-MGB探针技术建立了一种可以鉴别诊断不同毒力H7N9的双通道RRT-PCR方法,该方法首次将MGB探针技术用于H7N9病毒的检测。Taqman-MGB探针相比于普通RRT-PCR方法有着更高的灵敏度,本方法针对不同毒力H7N9的不同模式裂解位点序列设计了探针,在双通道条件下能够高效地特异性检测HP-H7N9及LP-H7N9并达到区分的效果,灵敏度达50拷贝。相比于传统的鸡胚分离和RT-PCR方法,该方法总符合率达92.7%且敏感性更好,临床操作更加简便快速,同时又避免了传统方法中可能存在的交叉污染。3.PA-X蛋白在高、低致病性H7N9禽流感病毒感染中的作用及其机制研究为了探索PA-X蛋白在不同致病性H7N9病毒感染过程中的作用,我们以高致病性毒株A/chicken/Guangdong/GD15/2016（GD15）及其裂解位点致弱的低致病性毒株r15为研究对象,通过对PA基因核糖体移码区的改造,成功构建了 PA-X表达量下降的高致病性突变病毒GD15-PAX3、GD15-PAX5和低致病性突变病毒r15-PAX3、r15-PAX5。本研究系统地比较了母本病毒和突变毒株在病毒感染过程中的差异。当以高致病性毒株为骨架时,与母本病毒GD15比,突变病毒GD15-PAX3、GD15-PAX5对SPF鸡胚的毒力增强,在MDCK和DF-1细胞和SPF鸡体内的复制能力增强;在哺乳动物和禽类细胞中的聚合酶活性增强;同时在病毒诱导的细胞凋亡能力方面也增强;然而,鸡的肺脏差异转录组学分析结果显示,GD15-PAX3所诱导的宿主先天性免疫应答能力却低于母本病毒,主要表现在GD15-PAX3诱导的显着差异表达的基因个数要低于母本病毒GD15,并且刺激宿主IL-6、IL-18、INF-β等重要炎性细胞因子应答水平也显着低于母本病毒。因此,当以高致病性毒株为骨架时,PA-X能显着抑制病毒的复制能力和病毒诱导的细胞凋亡,增强了宿主的先天性免疫应答能力。然而,当以低致病性毒株为骨架时,大部分结果与以高致病性毒株为骨架的结果相反,主要体现在,与母本病毒r15相比,突变病毒rl5-PAX3、r15-PAX5在体内和体外的复制能力、在哺乳动物和禽类细胞中的聚合酶活性、在病毒诱导,的细胞凋亡能力方面均显着降低。但是,鸡的肺脏差异转录组学分析结果显示,r15-PAX3所诱导的宿主先天性免疫应答差异基因的个数要低于母本病毒r15,但是IL-6、IL-18、TNF-α等重要的炎性细胞因子表达水平却显着提升。因此,当以低致病性毒株为骨架时,PA-X能显着增强病毒的复制能力和病毒诱导的细胞凋亡,抑制宿主的先天性免疫应答能力。因此,本章的研究结果首次发现PA-X蛋白在HP/LP H7N9病毒中起到调节复制能力和病毒毒力的作用,并且发现H7N9病毒PA-X蛋白无法诱导鸡肺脏显着的“Host shutoff’活性,推测PA-X蛋白抑制宿主蛋白表达的能力可能存在宿主或亚型特异性。同时我们的结果也表明PA-X可能通过调节炎性细胞因子的应答水平和不同程度的细胞凋亡来调节高/低致病性H7N9病毒的复制能力和致病性。因此,本研究推进了我们对HP/LP H7N9病毒致病机制的了解。
秦锋[8]（2017）在《广东地区猪场H5N6亚型流感病毒的调查及1株H1N1亚型SIV对小鼠致病性研究》文中研究指明A型流感病毒可以感染多种哺乳动物。其中猪的呼吸道上皮细胞同时具有α-2,3和α-2,6唾液酸受体,猪在流感病毒的变异、重组及跨宿主传播的过程中起着“混合器”的作用,具有重要的公共卫生学意义。为了调查广东地区猪场猪群流感病毒感染情况,随机抽取猪场猪血清样品2744份进行血凝抑制试验（HI）,结果显示:血清中EAH1N1、pdm9H1和H3N2亚型的猪流感病毒抗体的阳性率分别为30.35%、21.19%和9.11%。血清样品中流感病毒混合感染的情况显示:EAH1N1+pdm09H1为6.13%、EAH1N1+H3N2为3.58%、pdm09H1+H3N2为1.90%、EAH1N1+pdm09H1+H3N2为1.50%。血清样品中H9N2亚型禽源流感病毒抗体的阳性率为2.52%,未监测到H5亚型、H4亚型和H6亚型禽流感病毒抗体的存在。研究又在广东地区猪场流感病毒的调查中收集猪鼻拭子、猪肺脏组织和猪场野鸟栖息处粪便、水禽活动区、污水等环境中拭子,在猪肺和猪场环境中分离到3株H5N6亚型流感病毒和在病猪上分离到一株H1N1亚型SIV分别命名为:A/swine/Guangdong/G3/2015（H5N6,SwG3）、A/enviroment/Guangdong/F3/2015（H5N6,EnvF3）、A/enviroment/Guangdong/F4/2016（H5N6,EnvF4）和A/swine/Guangdong/0326/2015（H1N1,Sw0326）。3株H5N6分离株的遗传进化分析表明,HA基因属于2.3.4.4分支,3株H5亚型分离株的NA基因均属于H5N6亚型第Ⅰ分支,该分支源于H6N6亚型禽流感病毒与H5亚型禽流感病毒自然重组,存在跨越物种障碍导致人类感染的风险。SwG3内部基因属于H5N6亚型第Ⅰ分支,而EnvF3与EnvF4的PB2基因以及EnvF4的PB1基因属于H5N6亚型第Ⅱ分支,其PB2基因均源于H6N6亚型禽流感病毒,而EnvF4的PB1基因与A/duckGuangdong/175D12/2014（H3N6）毒株PB1基因的同源性为96.3%,推测其PB1基因源于H3N6亚型禽流感病毒,其他内部基因PA、NP、M及NS属于H5N6亚型第Ⅰ分支。所有病毒的基因分子特性分析显示,HA蛋白受体结合位点未发生Q226L和G228S,趋向禽的α-2,3受体,而SwG3、EnvF3和EnvF4的HA蛋白受体结合位点T160A发生了突变及EnvF3和EnvF4的HA蛋白受体结合位点I155T发生了突变,趋向人的α-2,6受体。遗传进化分析显示Sw0326的HA、NA、M和NS基因片段属于EA分支,PB2、PB1、PA和NP基因片段属于Pdm/09分支,另外Sw0326的M1（T215A）、NS1（P42S）蛋白的位点的突变。为了进一步研究Sw0326的致病性的强弱,选择5周龄的BALB/c小鼠,采取滴鼻的方式攻毒,攻毒剂量为106 EID50/50μL。攻毒小鼠后小鼠精神沉郁,采食量减少,体重下降迅速。攻毒组在3d时肺脏中的病毒滴度为4.3±0.66log10EID50/m L,在6d时肺脏中的病毒滴度为6.4±0.57log10EID50/m L;3d时脑中的病毒滴度是2.25±1.3log10EID50/mL;在6d时脑中的病毒滴度为2.83±1.8log10EID50/mL。采集攻毒组第6d感染的小鼠肺脏和脑组织做病理组织学观察,小鼠肺脏和脑组织明显的组织损伤和病变,并且免疫组化结果也证明在第6d可以在肺脏和脑组织中检测到病毒抗原,表明Sw0326重组株可以突破血脑屏障,对小鼠有较强的致病性,为进一步研究流感病毒对哺乳动物的致病性奠定了基础。
关立峥[9]（2017）在《中国H3N2（2009-2014年）和H5（2015-2016年）亚型禽流感病毒的生物学特性研究》文中研究说明H5亚型禽流感病毒随着其不断进化、变异及对宿主的适应,部分毒株已经稳定存在并获得对其自然宿主的高致病力,这不仅严重危害到养禽业的发展,更对人类的公共卫生安全构成潜在威胁。H3N2亚型流感病毒具有广泛的感染宿主谱,除了可以感染野鸟和家禽外,还可以感染猪、犬、猫、雪貂等多种哺乳动物,而且是造成人的季节性流感最直接的病原之一。近年来的禽流感监测数据显示,H3N2亚型禽流感病毒不仅是水禽中分离率最高的流感病毒亚型之一,而且在我国大多数地区流行,病毒分离数目有逐年增多的趋势。为了解我国H5和H3N2亚型禽流感病毒的流行趋势,评估病毒对哺乳动物感染和传播的潜在风险,本研究选取2015-2016年分离到的66株具有代表性的H5亚型禽流感病毒和2009-2014年分离到的26株具有代表性的H3N2亚型禽流感病毒进行了病毒的遗传演化分析、抗原性分析、受体结合特异性分析、对小鼠的感染性和致病性分析以及H3N2亚型禽流感病毒在豚鼠中的复制和传播能力的分析。66株病毒的HA和NA亚型组合共有5种,即H5N1、H5N2、H5N3、H5N6和H5N8,其中以H5N6亚型禽流感病毒为主。病毒的遗传演化分析表明,66株病毒可划分为A、B、C、D和E共5种基因型,其中H5N1亚型禽流感病毒包括A1-A3基因型,H5N6亚型禽流感病毒包括D1-D16基因型,表明我国流行的H5亚型禽流感病毒具有明显的遗传多样性,且内部基因存在与H1、H5、H7、H9、H12等多种野鸟源的禽流感病毒、H3和H6等多种低致病性禽流感病毒的内部基因存在广泛的基因重排现象,此外,还与人源分离株H5N6或H7N9以及猪源H3N2亚型流感病毒的内部基因有着较近的亲缘关系。H3N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析结果表明,26株病毒的基因型各不相同,病毒的基因来源具有明显的遗传多样性。HA基因与马源、人源和猪源H3亚型流感病毒的亲缘关系较远,内部基因则与野鸟源的多种不同亚型的低致病性,如H1N2、H1N9、H2N3、H6N6和H10N5等禽流感病毒的内部基因具有广泛的基因重排现象。此外,还有一些进化相对古老的基因片段与高致病性H5N1或H5N2禽流感病毒甚至是猪源H4N8流感病毒的基因片段存在着密切的亲缘关系。病毒的抗原性分析结果表明,clade 2.3.4.4分支的大部分病毒与我国当前所使用的Re-8疫苗株的反应性良好,少数病毒与Re-8疫苗株的抗原性存在一定差异。此外,clade 2.3.2.1分支病毒与我国当前所使用的Re-6疫苗株的抗原性存在较大差异,抗原性差异明显。除此以外,当前我国流行的H3N2亚型禽流感病毒已发生明显的抗原性漂移,与人源、猪源H3N2亚型流感病毒的抗原性差异明显。小鼠的感染性和致病性实验结果表明,66株H5亚型禽流感病毒均能在小鼠的呼吸系统内复制,在除鼻甲和肺脏以外的脑、脾脏和肺脏中选择性复制。66株病毒对小鼠的致病力具有显着性差异,A基因型病毒对小鼠呈现中、高2种致病力,B和C基因型病毒对小鼠呈现中、低2种致病力,D基因型对小鼠呈现低、中、高3种致病力,E基因型病毒对小鼠呈现高致病力。大部分H3N2亚型禽流感病毒不需适应就能够在小鼠的呼吸系统内有效复制,小鼠感染病毒后均不表现出明显的临床症状,病毒对小鼠均不致死,表现出对小鼠的低致病力。对HA蛋白的受体结合位点及其周围有氨基酸变化的10株病毒（2株H5N1、1株H5N3、6株H5N6和1株H5N8亚型禽流感病毒）进行受体结合特异性的分析,研究结果表明病毒的受体结合特异性不尽相同。所有的病毒均具有极强的与α-2,3-SA受体结合的能力,但与α-2,6-SA受体结合的能力则表现为不结合、微弱、中等和较强4种形式。挑选的10株H3N2亚型禽流感病毒均同时具备与α-2,3-SA和α2,6-SA受体结合的能力,尽管病毒与前者的结合能力更强。挑选在小鼠上呼吸道高效复制且具有与人型受体结合能力的5株病毒检测其在豚鼠中的复制能力、直接接触传播和呼吸道飞沫传播能力。豚鼠的复制实验结果表明5株病毒均能在豚鼠的呼吸系统内复制,传播实验结果表明,5株病毒均能在豚鼠间进行高效的直接接触传播,此外有2株病毒能在豚鼠间进行中等能力的呼吸道飞沫传播,有1株病毒能在豚鼠间进行高效的呼吸道飞沫传播。综上所述,当前我国流行的H5亚型禽流感病毒亚型组合多样,基因来源复杂,部分病毒与当前所使用的疫苗株抗原差异明显,且具有感染人的潜在风险,而H3N2亚型禽流感病毒具有感染人并在人际间传播的潜在风险。
张传美[10]（2016）在《H9N2亚型禽流感病毒感染水貂的研究》文中提出H9N2-型禽流感病毒在我国广泛流行和存在,不仅给养禽业带来巨大危害,且能够跨越种属屏障获得了感染人等哺乳动物的能力,还因其易发生变异和重组,可作为内部基因组供体,将其他亚型的禽流感病毒“引渡”到人群中,对人类的健康造成了极大的威胁。自1956年我国从国外引种开始饲养毛皮动物以来,养貂规模不断扩大,但养貂场养殖模式不规范、管理水平参差不齐,长期饲喂禽类副产品及貂舍暴露于外界易接触飞鸟粪便、羽屑等状况,使水貂感染流感病毒的风险日益加大,致使我们期望全面掌握我国养殖水貂中感染流感病毒的情况及其危害,研究水貂是否可以作为“病毒携带者”或“中间宿主”在流感病毒传播过程中起到推波助澜的作用。所以本文通过水貂群中流感病毒血清学调查、流感病毒的分离鉴定、对分离毒株的生物学特性研究和全基因测序分析、H9N2亚型禽源禽流感分离株对水貂致病性的研究及水貂呼吸道组织中流感受体的分布分析,系统研究了H9N2亚型禽流感病毒对水貂的感染情况。首先,为评估水貂感染H9N2禽流感的风险,在山东省不同地区采集血清样品560份,开展了禽流感H9N2亚型抗体的血清学调查。HI试验显示,被检血清中对A/Chicken/Hebei/4/2008 （H9N2）和A/chicken/Shanghai/10/01 （H9N2）抗原的阳性反应百分比分别为45.4%和47.5%。无论在成年貂还是幼貂中,H9N2禽流感的抗体阳性普遍存在,阳性率高达40%以上。说明山东省不同养殖区域貂群均不同程度地感染禽流感H9亚型病毒,具有重大的感染风险。血清学调查提示养殖水貂中存在感染H9N2禽流感病毒的风险,所以本研究试图从水貂中分离得到H9N2病毒株,并进行全面的生物学特性研究。2014年从一只有咳嗽、发热、流鼻涕症状的发病水貂分离得到一株流感病毒,经鉴定为H9N2亚型流感病毒,命名为A/Mink/Shandong/wm/2014（H9N2）.生物学特性分析表明,接种SPF鸡后,该分离株对SPF鸡致病性较低,未表现明显临床症状,属低致病性流感病毒。但接种小鼠后可引起小鼠显着的临床变化,肺部明显水肿、淤血和出血；病毒可在在小鼠体内复制并引起小鼠发病,说明该株病毒对小鼠的致病性较强。对该分离株8个基因片段进行分子遗传进化分析表明,HA基因属于Y280-like分支,M基因属于G1-like分支,NA、NP、NS、PB1、PB2、PA基因均属于F98-like分支,说明该毒株是一株H9N2大陆流行谱系的低致病性禽流感病毒。与近两年在山东及其周边地区流行的H0N2禽流感分离株同源性较高,其中M、NS、NP、PA、PB1基因与多株H7N9毒株同源性较高,说明这些基因片段与H7N9分离株有相同的来源。HA基因裂解位点氨基酸序列为PSRSSR↓GL,符合低致病性禽流感的特征。HA基因含有8个潜在糖基化位点,与经典毒株Y280相比,在313位和551位出现两个潜在的糖基化位点。HA基因受体结合相关位点发生了N191H与E198T的突变；Q234L发生突变,具有了与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特性。NA基因有7个潜在的糖基化位点,在其茎部缺失3个氨基酸,造成61位潜在糖基化位点的缺失；三处红细胞受体结合位点在368位点（K→N）、400（S→N）及401（D→E）三处氨基酸发生突变,而且368位点的突变与同源性较高的近几年H9N2的流行株突变相同。HA与NA基因这些位点的突变与缺失是否与其宿主范围扩大和对哺乳动物致病性增强有关,有待于进一步研究。M2基因出现了S31N变异,说明该病毒可能对离子通道抑制剂类药物不敏感。为研究禽源H9N2亚型禽流感病毒对水貂的致病性,本试验通过鼻腔接种Ck/HB/4/08分离株感染幼貂,观察其临床症状、病理变化、各脏器感染情况、排毒情况及抗体变化。结果显示,攻毒后水貂未出现明显的临床症状；但肺脏淤血,局部轻微实变。感染后第3、7d的肺脏中均可检测到病毒。攻毒后3-11d内均可在鼻拭子中检测到病毒。攻毒后第7d抗体水平开始升高,持续到第15d。表明禽源H9N2亚型禽流感病毒可以直接感染水貂,且对水貂造成了一定的致病性,临床症状不显着,病毒可在其体内有效复制,并可向外排毒。为了检测唾液酸受体在水貂呼吸道组织中的类型和分布,本研究利用免疫组化方法对水貂呼吸道组织进行了禽型SAa-2,3Gal受体和人型SAa-2,6Gal受体两种受体的分析。分析显示,两种唾液酸受体在水貂的呼吸道组织中均有表达,但以SAa-2,6Gal受体为主,尤其在上呼吸道以SAa2,6Gal受体表达较多,说明水貂呼吸道含有人型与禽型两种受体,提示水貂可能作为一种甲型流感病毒“基因混合器”或“中间宿主”。总之,本研究提供了临床和实验室两方面的研究资料,提示H9N2亚型流感病毒在养殖水貂中普遍存在,病毒可以感染水貂,引起水貂发病,病毒可在水貂体内复制并向外排毒。禽源流感病毒传播到了水貂中,使水貂成为病毒的侵入者和携带者,提醒我们务必加强水貂群中流感病毒的监测,对防控禽流感以及人类流感大流行均具有的重要意义。
二、中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定（论文提纲范文）
（1）H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 A型流感病毒基本特征 |
| 1.2 A型流感病毒的抗原变异 |
| 1.2.1 抗原漂移 |
| 1.2.2 抗原转移 |
| 1.3 流感病毒的受体结合特性 |
| 1.3.1 HA蛋白受体结合位点 |
| 1.3.2 HA蛋白的受体结合特异性 |
| 1.4 犬流感病毒的流行病学 |
| 1.4.1 CIV概述 |
| 1.4.2 H3N8亚型CIV |
| 1.4.3 H3N2亚型CIV |
| 1.4.4 H5N1亚型CIV |
| 1.4.5 H5N2亚型CIV |
| 1.4.6 H1N1亚型CIV |
| 1.4.7 H3N1亚型CIV |
| 1.4.8 H9N2亚型CIV |
| 1.4.9 H6N1亚型CIV |
| 1.4.10 CIV的发病机理 |
| 1.5 犬流感病毒的诊断 |
| 1.5.1 病毒的分离培养 |
| 1.5.2 血清学检测 |
| 1.5.3 RT-LAMP检测 |
| 1.5.4 RT-PCR试验 |
| 1.5.5 荧光定量RT-PCR |
| 1.5.6 SYBR GreenⅠ荧光染料法 |
| 1.5.7 Taq Man探针法 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 第二章 犬流感病毒的分离鉴定及遗传演化分析 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料 |
| 2.1.2 鸡胚 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.1 病料的采集与接种 |
| 2.2.2 病毒的鉴定 |
| 2.2.3 病毒RNA的提取 |
| 2.2.4 病毒RNA反转录与PCR |
| 2.2.5 病毒全基因组序列测定 |
| 2.2.6 病毒遗传演化分析 |
| 2.2.7 抗原性分析 |
| 2.2.8 受体结合特性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犬流感病毒的分离鉴定 |
| 2.3.2 病毒核苷酸同源性比较 |
| 2.3.3 HA基因遗传演化分析 |
| 2.3.4 NA基因遗传演化分析 |
| 2.3.5 PB2基因遗传演化分析 |
| 2.3.6 PB1基因遗传演化分析 |
| 2.3.7 PA基因遗传演化分析 |
| 2.3.8 NP基因遗传演化分析 |
| 2.3.9 M基因遗传演化分析 |
| 2.3.10 NS基因遗传演化分析 |
| 2.3.11 抗原性分析 |
| 2.3.12 受体结合特性 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 通用型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 毒株和核酸样品 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 3.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 3.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.1.6 特异性试验 |
| 3.1.7 敏感性试验 |
| 3.1.8 重复性试验 |
| 3.1.9 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 3.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 3.2.3 特异性试验结果 |
| 3.2.4 敏感性试验结果 |
| 3.2.5 重复性试验结果 |
| 3.2.6 临床样品检测结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 H3 亚型犬流感病毒荧光定量PCR诊断方法的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株和核酸样品 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 引物和探针的设计合成 |
| 4.1.4 重组质粒标准品的制备 |
| 4.1.5 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.1.6 特异性试验 |
| 4.1.7 敏感性试验 |
| 4.1.8 重复性试验 |
| 4.1.9 临床样品检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组质粒标准品的构建与鉴定结果 |
| 4.2.2 荧光定量PCR的条件优化和标准曲线的建立 |
| 4.2.3 特异性试验结果 |
| 4.2.4 敏感性试验结果 |
| 4.2.5 重复性试验结果 |
| 4.2.6 临床样品检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（2）H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 猪流感病毒流行病学及其检测方法研究进展 |
| 1 猪流感病毒流行病学 |
| 2 猪流感病毒检测方法的研究进展 |
| 第一章 H1和H3亚型猪流感病毒一步法双重RT-qPCR方法的建立与应用 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 猪流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 5株猪流感病毒的生物学特性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 流感病毒病原学 |
| 1.1 流感病毒概述 |
| 1.2 流感病毒病原生态学特点 |
| 第二章 流感病毒受体 |
| 2.1 流感病毒受体概述 |
| 2.2 唾液酸的结构及种类 |
| 2.3 不同动物唾液酸受体的异质性 |
| 2.4 不同物种间流感病毒唾液酸受体的分布 |
| 2.5 病毒结合不同唾液酸受体的分子机制 |
| 2.6 流感病毒唾液酸受体研究方法 |
| 第三章 禽流感病毒跨种传播 |
| 3.1 禽流感病毒跨种传播的发生 |
| 3.2 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因突变 |
| 3.3 影响禽流感病毒跨种传播的病原因素-基因重组 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国东部地区候鸟禽流感流行病学调查研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 实验用鸡胚和细胞 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 样品采集 |
| 1.1.5 禽流感病毒分离 |
| 1.1.6 禽流感病毒RNA的提取 |
| 1.1.7 禽流感病毒高通量测序 |
| 1.1.8 候鸟禽流感病毒抗体检测 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 样品采集及毒株分离情况 |
| 1.2.2 候鸟AIVs亚型多样性和宿主特异性 |
| 1.2.3 H9N2 禽流感病毒在候鸟中流行的血清学调查 |
| 1.2.4 2020 年候鸟H5N8 禽流感病毒检测及抗原性分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 中国东部候鸟禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验用毒株 |
| 2.1.2 候鸟源禽流感病毒基因组收集及比对 |
| 2.1.3 系统发生分析 |
| 2.1.4 进化动力学的空间系统发育重建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 候鸟源禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.2 候鸟源H9N2 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.3 候鸟源H3N8 禽流感病毒遗传进化分析 |
| 2.2.4 候鸟源H13 亚型禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.2.5 候鸟源H5N8 禽流感病毒遗传变异分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 中国东部候鸟禽流感病毒分离株受体结合特性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验用毒株 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 红细胞法检测禽流感病毒受体 |
| 3.1.5 糖芯片法检测禽流感病毒受体 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 候鸟禽流感病毒红细胞法受体测定 |
| 3.2.2 候鸟禽流感病毒糖芯片法受体测定 |
| 3.2.3 候鸟禽流感病毒结合聚糖结构分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 候鸟禽流感病毒在哺乳动物间跨种传播能力评估 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验用毒株 |
| 4.1.2 实验用动物 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 小鼠致病性实验 |
| 4.1.6 豚鼠间传播实验 |
| 4.1.7 雪貂间呼吸道飞沫传播实验 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.2 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.3 候鸟H9N2 亚型禽流感病毒雪貂间传播 |
| 4.2.4 候鸟H5N8 禽流感病毒小鼠致病性 |
| 4.2.5 候鸟H5N8 禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.6 候鸟H3 亚型禽流感病毒豚鼠间传播 |
| 4.2.7 候鸟T222 分离株及豚鼠适应一代毒株雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 候鸟源H3N8 禽流感病毒在哺乳间传播的分子机制研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验用毒株、细胞及载体 |
| 5.1.2 实验用动物 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株RNA提取 |
| 5.1.6 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株c DNA制备 |
| 5.1.7 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株全基因组及载体扩增 |
| 5.1.8 候鸟源H3N8 流感病毒野毒株感染性克隆的构建 |
| 5.1.9 候鸟源H3N8 禽流感病毒及其突变株的体外拯救 |
| 5.1.10 流感病毒聚合酶活性检测 |
| 5.1.11 病毒滴定和复制动力学测定 |
| 5.1.12 动物实验 |
| 5.1.13 雪貂适应1 代毒株测序 |
| 5.1.14 雪貂适应1 代毒及受体结合能力检测 |
| 5.1.15 病理及组化 |
| 5.1.16 统计分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 T222 毒株及T222-G1 毒株氨基酸差异比对 |
| 5.2.2 rT222-wild及 rT222-S524G突变株拯救 |
| 5.2.3 rT222-wild及 rT222-S524G豚鼠间传播 |
| 5.2.4 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间呼吸道飞沫传播 |
| 5.2.5 rT222-wild及 rT222-S524G雪貂间传播变异分析 |
| 5.2.6 雪貂适应1 代毒株受体结合检测 |
| 5.2.7 PB1-S524G增强了病毒聚合酶活性 |
| 5.2.8 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体外复制能力 |
| 5.2.9 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒的体内复制能力 |
| 5.2.10 PB1-S524G增强了H3N8 禽流感病毒对小鼠的致病性 |
| 5.2.11 PB1-S524G增加了H3N8 禽流感病毒对雪貂的致病性 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 RT-PCR扩增 |
| 1.4 目的条带回收与克隆 |
| 1.5 病毒基因组测序分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 猪源H9N2亚型流感病毒各基因片段扩增结果 |
| 2.2 猪源H9N2亚型流感病毒基因核苷酸序列比对及遗传进化分析结果 |
| 2.3 猪源H9N2亚型流感病毒表面蛋白抗原性分析结果 |
| 2.4 猪源H9N2亚型流感病毒耐药性分析结果 |
| 2.5 猪源H9N2亚型流感病毒致病性关键位点分析结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（5）基于氨基酸序列的甲型流感病毒多样性及进化分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词(Abbreviation) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 甲型流感病毒感染的流行与危害 |
| 1.2 甲型流感病毒的基因组结构与功能 |
| 1.3 甲型流感病毒的命名和分类 |
| 1.3.1 甲型流感病毒的命名 |
| 1.3.2 甲型流感病毒的亚型 |
| 1.3.3 甲型流感病毒谱系/分支的命名 |
| 1.3.4 甲型流感病毒的分类 |
| 1.3.4.1 禽流感病毒 |
| 1.3.4.2 人流感病毒 |
| 1.3.4.3 猪流感病毒 |
| 1.3.4.4 马流感病毒 |
| 1.3.4.5 犬流感病毒 |
| 1.4 甲型流感病毒的进化 |
| 1.4.1 抗原漂移 |
| 1.4.2 抗原转变 |
| 1.4.3 遗传进化分析常用的技术及软件 |
| 1.4.4 甲型流感病毒的全景图分析 |
| 1.5 甲型流感病毒的防控现状 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 2 甲型流感病毒的分布研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 数据的收集与整理 |
| 2.2.2.1 流感病毒相关数据库 |
| 2.2.2.2 数据的下载和整理 |
| 2.2.3 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 IAV氨基酸序列的基本分布情况 |
| 2.3.2 HA基因的宿主分布 |
| 2.3.3 NA基因的氨基酸序列的宿主分布 |
| 2.3.4 HA基因的时间分布特征 |
| 2.3.5 NA基因序列的HA基因亚型分布 |
| 2.3.6 流感数据库的比较 |
| 2.3.6.1 Influenza Virus Resource和IRD数据库的比较 |
| 2.3.6.2 NCBI Influenza Virus Resource与GISAID数据库的比较 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 可用序列数据剧增 |
| 2.4.2 流行亚型的时空特点明显 |
| 2.4.3 感染宿主谱的倾向性明显 |
| 2.4.4 不同流感数据库各有特点 |
| 2.5 结论 |
| 3 甲型流感病毒的进化多样性分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 序列的选择和下载 |
| 3.3.2 进化树分析 |
| 3.3.3 分支和亚分支的注释 |
| 3.3.4 代表毒株的选择 |
| 3.3.5 GISAID独有数据库的验证 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.1 H1亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.2 H2亚型IAV的HA基因氨基酸序列的进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.3 H3亚型IAV的HA基因氨基酸序列的进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.4 H4亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.5 H7和H15亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.6 H9亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.7 H5-H6、H8、H10-H12、H14和H16亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.8 H13亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.1.9 H17和H18亚型IAV的HA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2 NA基因序列氨基酸进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.1 N1亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.2 N2亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.3 N4-N6亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.4 N3和N9亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.5 N7和N8亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.2.6 N10和N11亚型IAV的NA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3 内部基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.1 PB2基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.2 PB1基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.3 PA基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.4 NP基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.5 MP基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.3.6 NS基因氨基酸序列进化多样性及分布分析 |
| 3.4.4 数据库的相关探索 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 全景图更新的必要性及意义 |
| 3.5.2 IAV的氨基酸序列与流行特征的相关性分析 |
| 3.5.3 数据库的相关探索 |
| 3.5.4 序列分析之前的前处理 |
| 3.5.5 IAV全景图研究的可靠性 |
| 3.5.6 IAV进化树全景图中分支和亚分支的命名 |
| 3.6 结论 |
| 4 甲型流感病毒全景图的抽样检验与实例应用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.1.1 样品的采集 |
| 4.2.1.2 主要试剂和仪器等 |
| 4.2.1.3 主要溶液的配制方法 |
| 4.2.1.4 引物设计与合成 |
| 4.2.1.5 数据库及软件等 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.2.2.1 IAV全景图的抽样检验 |
| 4.2.2.2 2018年我国AIV毒株NA亚型的监测 |
| 4.2.2.2.1 病毒的分离 |
| 4.2.2.2.2 血凝试验 |
| 4.2.2.2.3 病毒RNA提取 |
| 4.2.2.2.4 一步法RT-PCR扩增AIV的 NA基因 |
| 4.2.2.2.5 RT-PCR产物实时毛细电泳 |
| 4.2.2.2.6 核苷酸序列测定及分析 |
| 4.2.2.2.7 分离毒株NA基因的分子进化分析 |
| 4.2.2.3 不同构建方法所构建进化树的比较及验证 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 基于IAV代表序列的全景图抽样检验 |
| 4.3.1.1 基于HA基因代表序列的H1亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.2 基于HA基因代表序列的H3亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.3 基于HA基因代表序列的H4和H14亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.4 基于HA基因代表序列的H11亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.5 基于HA基因代表序列的H2、H5和H6亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.6 基于HA基因代表序列的H7、H10和H15亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.7 基于HA基因代表序列的H8、H9和H12亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.8 基于HA基因代表序列的H13和H16亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.9 基于NA基因代表序列的N1亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.10 基于NA基因代表序列的N2亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.11 基于NA基因代表序列的N3和N4亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.12 基于NA基因代表序列的N5和N8亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.13 基于NA基因代表序列的N6、N7和N9亚型IAV抽样检验 |
| 4.3.1.14 基于PB2基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.15 基于PB1基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.16 基于PA基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.17 基于MP基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.18 基于NP基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.1.19 基于NS基因代表序列的IAV抽样检验 |
| 4.3.2 2018 年我国AIV的 NA亚型监测对IAV全景图的验证 |
| 4.3.2.1 NA基因RT-PCR扩增结果 |
| 4.3.2.2 测序结果及遗传进化分析 |
| 4.3.2.2.1 2018年所分离的N1亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.2 2018年所分离的N2亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.3 2018年所分离的N3和N4亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.4 2018年所分离的N6亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.2.2.5 2018年所分离的N8亚型AIV分子进化分析 |
| 4.3.3 不同构建方法所构建进化树的比较及验证 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 IAV全景图的抽样检验 |
| 4.4.2 2018年我国AIV的NA亚型监测对IAV全景图的验证 |
| 4.4.3 不同构建方法所构建进化树的比较及验证 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 创新点 |
| References |
| 附录 |
| 攻读学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（6）新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征及特殊miRNA-mRNA-蛋白质整合研究（论文提纲范文）
| 个人简历 主要英文缩略词表 摘要 ABSTRACT 前言 第一部分 |
| 新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征研究 研究背景 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 第二部分 |
| 新现H3N2亚型SIV跨种属感染miRNA-mRNA的交联分析研究 研究背景 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 第三部分 |
| 新现H3N2亚型SIV跨种属感染miRNA蛋白质交联分析研究 研究背景 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 第四部分 |
| 新现H3N2亚型SIV跨种属感染miRNA的功能验证研究 研究背景 1. |
| 材料与方法 2. |
| 结果 3. |
| 讨论 4. |
| 小结 全文总结 不足与展望 本研究的创新点 参考文献 综述 参考文献 致谢 资助项目 攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）我国鸡群中H7N9亚型禽流感病毒的遗传进化及PA-X蛋白在高、低致病性毒株感染中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 符号说明 综述一 我国H7N9流感病毒的流行病学与遗传进化研究进展 |
| 1 H7N9及其他近期出现的禽流感病毒简介 |
| 2 人感染H7N9病毒的流行病学特征 |
| 3 中国H7N9流感病毒的遗传进化分析 |
| 3.1 五波流行高峰期间H7N9病毒HA基因和NA基因的遗传进化分析 |
| 3.2 五波流行高峰期间H7N9病毒内部基因的遗传进化分析 |
| 3.3 五波流行高峰期间H7N9病毒的宿主适应性和药物抗性突变 |
| 4 总结 |
| 参考文献 综述二 流感病毒PA-X蛋白研究进展 |
| 1 PA-X的起源和构成 |
| 2 PA-X蛋白的Global host-shutoff活性 |
| 3 PA-X在调节宿主先天性和获得性免疫反应中的作用 |
| 3.1 PA-X在调节宿主先天性免疫反应中的作用 |
| 3.2 PA-X在调节宿主获得性免疫反应中的作用 |
| 3.3 流感病毒中的其他免疫调节蛋白 |
| 4 PA-X在不同动物模型中调节流感病毒毒力的作用 |
| 4.1 PA-X表达缺失对流感病毒毒力的影响 |
| 4.2 PA-X的C末端20个氨基酸对流感病毒致病性的影响 |
| 5 与PA-X蛋白相互作用的宿主因子 |
| 6 流感病毒中PA-X的多态性研究进展 |
| 7 小结与展望 |
| 参考文献 第一章 2013年以来我国鸡群中H7N9亚型禽流感病毒遗传进化及生物学特性分析 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 细胞、鸡胚和实验动物 |
| 1.3 试剂和引物 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒的分离与鉴定 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 样品处理 |
| 2.1.3 病毒分离 |
| 2.1.4 病毒鉴定 |
| 2.2 病毒的遗传进化分析 |
| 2.3 病毒的生物学特性分析 |
| 2.3.1 鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定 |
| 2.3.2 细胞半数感染量(TCID_(50))的测定 |
| 2.3.3 鸡静脉接种指数(IVPI)的测定 |
| 2.3.4 小鼠半数致死量(MLD_(50))的测定 |
| 2.4 病毒对动物致病性分析 |
| 2.4.1 SPF鸡感染试验 |
| 2.4.2 小鼠感染试验 |
| 2.5 动物传播试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 2013-2017年H7N9亚型AIV流行病学监测情况 |
| 3.2 H7N9亚型AIV分离株HA基因遗传进化分析 |
| 3.2.1 HA基因序列分析 |
| 3.2.2 HA蛋白重要氨基酸位点分析 |
| 3.3 H7N9亚型AIV分离株NA基因遗传进化分析 |
| 3.3.1 NA基因序列分析 |
| 3.3.2 NA蛋白重要氨基酸位点分析 |
| 3.4 H7N9亚型AIV分离株内部基因遗传进化分析 |
| 3.5 HP-H7N9亚型AIV分离株基本生物学特性 |
| 3.6 HP-H7N9亚型AIV分离株对小鼠和鸡的致病性 |
| 3.7 H7N9亚型AIV分离株在鸡中传播特性 |
| 4 讨论 |
| 参考支献 第二章 高致病性H7N9禽流感病毒疫苗候选株的构建及基于Taqman-MGB探针RRT-PCR检测方法的建立 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒、鸡胚和实验动物 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 GD15致弱疫苗株RGW的构建及免疫效力评价 |
| 2.1.1 GD15致弱疫苗株RGW的构建 |
| 2.1.2 疫苗株RGW的毒力及繁殖能力鉴定 |
| 2.1.3 疫苗株RGW的抗原性分析 |
| 2.1.4 疫苗株RGW对鸡的免疫保护效果评价 |
| 2.2 高致病性H7N9亚型禽流感病毒RRT-PCR检测方法的建立 |
| 2.2.1 引物及探针的设计 |
| 2.2.2 制备质粒标准品 |
| 2.2.3 RRT-PCR方法的建立和优化 |
| 2.2.4 特异性和灵敏度的评价 |
| 2.2.5 临床鉴别诊断评价 |
| 3 结果 |
| 3.1 GD15重组致弱疫苗株RGW的获得及免疫效力评价 |
| 3.1.1 致弱疫苗株RGW的拯救及鉴定 |
| 3.1.2 致弱疫苗株RGW的传代及特性鉴定 |
| 3.1.3 致弱疫苗株RGW的交叉保护效果 |
| 3.1.4 重组致弱疫苗株RGW的抗体消长规律 |
| 3.1.5 重组致弱疫苗株RGW的免疫保护效果 |
| 3.2 高致病性H7N9亚型禽流感病毒RRT-PCR检测方法的建立 |
| 3.2.1 引物和探针的设计及优化 |
| 3.2.2 灵敏度和特异性 |
| 3.2.3 临床鉴别诊断评价 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 第三章 PA-X蛋白在高、低致病性H7N9禽流感病毒感染中的作用及机制研究 |
| 引言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒、质粒和细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 试剂及仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 模式病毒的构建及拯救 |
| 2.2 获救毒株生物学特性的鉴定 |
| 2.3 Western Blotting检测PA-X的表达 |
| 2.4 SPF鸡致病性试验 |
| 2.5 病毒在细胞上的生长曲线测定 |
| 2.6 病毒聚合酶活性测定 |
| 2.6.1 瞬时转染后聚合酶活性测定 |
| 2.6.2 病毒感染细胞后聚合酶活性测定 |
| 2.7 基因芯片及差异转录组学分析 |
| 2.8 细胞因子的测定 |
| 2.9 细胞凋亡及坏死检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒的拯救及特性鉴定 |
| 3.2 PA-X对高/低致病性H7N9病毒在体外内的复制能力的影响 |
| 3.2.1 PA-X表达量下调对高/低致病性H7N9在鸡体内复制的影响 |
| 3.2.2 PA-X表达量下调对高/低致病性H7N9在细胞上复制的影响 |
| 3.3 PA-X对高/低致病性H7N9病毒聚合酶活性的影响 |
| 3.4 PA-X对高/低致病性H7N9病毒感染后宿主免疫应答的影响 |
| 3.4.1 差异转录组学分析 |
| 3.4.2 基于SDE的生物功能和通路分析 |
| 3.4.3 PA-X影响高/低致病性H7N9病毒感染后宿主细胞因子应答 |
| 3.5 PA-X在高/低致病性H7N9中对诱导宿主细胞凋亡的影响 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 附录一 H7N9亚型AIV分离株背景信悤 附录二 鸡肺脏中显着差异表达的基因（GD15vsGD15-PAX3) 附录三 鸡肺脏中显着差异表达的基因（rl5vsrl5-PAX3) 附录四 显着差异表达的基因参与的生物学进程（GO) 附录五 显着差异表达蛋白的互作网络图 全文小结 致谢 攻读博士学位期间发表的学术论文 学术会议论文 |
（8）广东地区猪场H5N6亚型流感病毒的调查及1株H1N1亚型SIV对小鼠致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 流感概述 |
| 1.1.1 A型流感病毒 |
| 1.1.2 A型流感病原学 |
| 1.1.3 病毒基因组结构与复制 |
| 1.1.4 病毒宿主特异性 |
| 1.1.5 病毒跨宿主传播 |
| 1.2 猪流感概述 |
| 1.2.1 猪流感的流行病学 |
| 1.2.2 猪流感重组与变异 |
| 1.3 疫苗的研究与反向遗传技术的应用 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 重组蛋白疫苗 |
| 1.3.3 载体疫苗 |
| 1.3.4 DNA疫苗 |
| 1.3.5 反向遗传技术的应用 |
| 1.4 猪流感公共卫生意义 |
| 1.5 猪流感防控 |
| 1.6 本实验研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株与鸡胚 |
| 2.1.2 血清样品收集 |
| 2.1.3 试剂 |
| 2.1.4 菌种 |
| 2.1.5 缓冲液 |
| 2.1.6 DEPC处理水 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.1.8 引物 |
| 2.1.9 实验动物 |
| 2.1.10 鸡红细胞 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 血凝抗原的增殖 |
| 2.2.2 血凝抑制试验（HI） |
| 2.2.3 病毒的分离鉴定与扩增 |
| 2.2.4 病毒RNA抽提 |
| 2.2.5 cDNA第一链的合成 |
| 2.2.6 目的片段与pMD18-T载体连接 |
| 2.2.7 PCR与目的片段的扩增 |
| 2.2.8 序列拼接与分析 |
| 2.2.9 病毒EID50的测定 |
| 2.2.10 临床观察 |
| 2.2.11 小鼠不同脏器病毒含量的测定 |
| 2.2.12 病理组织学试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 广东省猪群猪流感血清学调查结果分析 |
| 3.1.1 猪血清抗体检测结果 |
| 3.1.2 标准抗原的特性性分析 |
| 3.2 流感病毒分离株的鉴定 |
| 3.2.1 病毒的分离鉴定 |
| 3.2.2 流感病毒分离株全基因序列测序结果及序列拼接 |
| 3.3 猪场H5N6亚型流感病毒分离株的基因序列分析 |
| 3.3.1 H5N6分离株全基因序列遗传进化分析 |
| 3.3.2 分离株基因序列的分子特性分析 |
| 3.4 H1N1亚型SIV分离株的基因序列分析 |
| 3.4.1 分离株全基因序列遗传进化分析 |
| 3.4.2 分离株基因序列的分子特性分析 |
| 3.5 H1N1亚型重组病毒分离株（Sw0326）对小鼠的致病性结果分析 |
| 3.5.1 病毒的EID50测定 |
| 3.5.2 病毒对BALB/c小鼠的致病性试验 |
| 3.5.2.1 攻毒组小鼠临床表现和病毒感染BALB/c小鼠体重变化 |
| 3.5.2.2 攻毒组小鼠存活率 |
| 3.5.2.3 小鼠脏器病毒分离的测定结果 |
| 3.5.2.4 病理组织学观察 |
| 3.5.2.5 病毒感染后肺脏和脑中病毒抗原的检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 血清学调查分析讨论 |
| 4.2 H5N6亚型流感病毒的序列分析讨论 |
| 5 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录：科研情况 |
（9）中国H3N2（2009-2014年）和H5（2015-2016年）亚型禽流感病毒的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 ABSTRACT 英文缩略表 第一章 文献综述 |
| 1 流感病毒的抗原性变异 |
| 1.1 抗原性变异相关基因的结构与功能 |
| 1.1.1 血凝素蛋白（HA）的结构与功能 |
| 1.1.2 神经氨酸酶蛋白（NA）的结构与功能 |
| 1.2 抗原变异的分子基础 |
| 1.2.1 抗原漂移 |
| 1.2.2 抗原转变 |
| 2 病毒的受体结合特异性 |
| 2.1 流感病毒的唾液酸受体 |
| 2.1.1 流感病毒的受体分布 |
| 3 与受体结合特异性相关的因素 |
| 3.1 HA蛋白的受体结合位点 |
| 3.2 受体结合位点对受体结合特异性的影响 |
| 4 受体结合特性对病毒传播能力的影响 |
| 5 影响病毒传播的主要因素 |
| 5.1 环境 |
| 5.2 宿主 |
| 5.3 病毒蛋白 |
| 5.3.1 HA蛋白 |
| 5.3.2 NA蛋白 |
| 5.3.3 内部基因蛋白 |
| 6 H5亚型流感病毒的流行病学概况 |
| 6.1 A/Goose/Guangdong/1/96 谱系H5亚型流感病毒的传播 |
| 6.2 H5亚型AIV的宿主分布 |
| 6.2.1 H5亚型AIV在野生水禽中的分布 |
| 6.2.2 H5亚型AIV在家禽中的分布情况 |
| 6.2.3 H5亚型AIV的跨物种传播 |
| 7 H3N2亚型流感病毒的宿主谱及流行概述 |
| 7.1 H3N2亚型流感病毒在人类中的流行 |
| 7.2 H3N2亚型流感病毒在猪群中的流行 |
| 7.3 H3N2亚型流感病毒在野鸟和家禽中的流行 |
| 7.4 H3N2亚型流感病毒在其他哺乳动物中的流行 |
| 8 本研究的目的和意义 第二章 2015-2016 年中国H5亚型禽流感病毒的生物学特性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 实验所用毒株 |
| 1.4 H5亚型AIVs的纯化及鸡胚半数感染量（EID50）的测定 |
| 1.5 H5亚型AIVs的半数致死量（MLD50）的测定 |
| 1.6 H5亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 1.6.1 RT-PCR扩增 |
| 1.6.2 全基因组序列测定 |
| 1.6.3 遗传演化分析 |
| 1.7 H5亚型AIVs的抗原性分析 |
| 1.8 H5亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性评价 |
| 1.9 H5亚型AIVs的受体结合特异性分析 |
| 1.9.1 H5亚型AIVs的浓缩与纯化 |
| 1.9.2 固相结合ELISA实验 |
| 2 结果 |
| 2.1 H5亚型AIVs的分布 |
| 2.2 H5亚型AIVs的遗传演化分析结果 |
| 2.2.1 HA基因的遗传演化分析 |
| 2.2.2 NA基因的遗传演化分析 |
| 2.2.3 PB2基因的遗传演化关系 |
| 2.2.4 PB1基因的遗传演化分析 |
| 2.2.5 PA基因的遗传演化分析 |
| 2.2.6 NP基因的遗传演化分析 |
| 2.2.7 M基因的遗传演化分析 |
| 2.2.8 NS基因的遗传演化分析 |
| 2.2.9 H5亚型AIVs基因型的划分 |
| 2.3 H5亚型AIVs的抗原性分析结果 |
| 2.4 H5亚型AIVs的受体结合特异性分析结果 |
| 2.5 H5亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性结果 |
| 3 讨论 第三章 2009-2014 年中国H3N2亚型禽流感病毒的生物学特性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 实验用毒株 |
| 1.4 H3N2亚型AIVs的纯化及EID50测定 |
| 1.5 H3N2亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 1.5.1 RT-PCR扩增 |
| 1.5.2 全基因组序列测定 |
| 1.5.3 H3N2亚型AIVs的遗传演化分析 |
| 1.6 H3N2亚型AIVs的抗原性分析 |
| 1.7 H3N2亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性分析 |
| 1.8 H3N2亚型AIVs的受体结合特异性分析 |
| 1.8.1 蔗糖密度梯度离心浓缩纯化H3N2亚型AIVs |
| 1.8.2 固相结合ELISA实验检测H3N2亚型AIVs的受体结合特异性 |
| 1.9 H3N2亚型AIVs在豚鼠中的复制和传播能力评估 |
| 1.9.1 H3N2亚型AIVs在豚鼠体内的复制能力评估 |
| 1.9.2 H3N2亚型AIVs在豚鼠间的接触传播能力评估 |
| 1.9.3 H3N2亚型AIVs在豚鼠间的呼吸道飞沫传播能力评估 |
| 2 结果 |
| 2.1 H3N2亚型AIVs的EID50测定结果 |
| 2.2 H3N2亚型AIVs的遗传演化分析结果 |
| 2.2.1 表面基因（HA和NA基因）的遗传演化关系 |
| 2.2.2 内部基因的遗传演化分析结果 |
| 2.3 H3N2亚型AIVs的抗原性分析结果 |
| 2.4 H3N2亚型AIVs对小鼠的感染性和致病性分析 |
| 2.5 H3N2亚型AIVs的受体结合特异性分析 |
| 2.6 H3N2亚型AIVs在豚鼠中的复制能力以及传播能力的评估 |
| 3 讨论 第四章 全文结论 参考文献 附录 致谢 作者简介 导师简介 |
（10）H9N2亚型禽流感病毒感染水貂的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 主要仪器设备 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 禽流感病毒综述 |
| 1.2 H9N2亚型禽流感病毒的研究 |
| 1.3 流感病毒感染水貂及雪貂的研究 |
| 1.4 流感病毒受体的研究 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 研究内容与技术路线 |
| 第二章 水貂群中禽流感病毒血清学调查 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 貂源流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 貂源H9N2亚型禽流感病毒的全基因序列分析 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 H9N2亚型禽流感病毒对水貂致病性的研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 水貂呼吸道组织中唾液酸受体分布的研究 |
| 6.1 试验材料 |
| 6.2 试验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论与创新点 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、中国猪源H5N1和H9N2亚型流感病毒的分离鉴定（论文参考文献）
- [1]H3亚型犬流感病毒的分离鉴定及其荧光定量RT-PCR方法的建立[D]. 吴颖. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]H1和H3亚型猪流感病毒的双重荧光定量RT-PCR方法与遗传进化和生物学特性研究[D]. 陈凯彪. 扬州大学, 2021
- [3]候鸟禽流感病毒遗传变异规律分析及在哺乳动物间传播机制研究[D]. 张醒海. 吉林大学, 2021
- [4]2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析[J]. 孔子荣,李三木,何奇松,曾咏芳,杨可妍,冯淑萍,孙翔翔,熊毅,颜健华. 南方农业学报, 2020(09)
- [5]基于氨基酸序列的甲型流感病毒多样性及进化分析[D]. 庄青叶. 华中农业大学, 2020
- [6]新现H3N2亚型SIV跨种属感染特征及特殊miRNA-mRNA-蛋白质整合研究[D]. 高灵茜. 广西医科大学, 2019
- [7]我国鸡群中H7N9亚型禽流感病毒的遗传进化及PA-X蛋白在高、低致病性毒株感染中的作用和机制研究[D]. 刘东. 扬州大学, 2019(05)
- [8]广东地区猪场H5N6亚型流感病毒的调查及1株H1N1亚型SIV对小鼠致病性研究[D]. 秦锋. 华南农业大学, 2017(08)
- [9]中国H3N2（2009-2014年）和H5（2015-2016年）亚型禽流感病毒的生物学特性研究[D]. 关立峥. 甘肃农业大学, 2017(09)
- [10]H9N2亚型禽流感病毒感染水貂的研究[D]. 张传美. 中国农业大学, 2016(08)